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Neuroscience

वेंट्रल चिकी midbrain में microRNA की ओवो अभिव्यक्ति में

doi: 10.3791/50024 Published: September 16, 2013

Summary

अस्थानिक अभिव्यक्ति मस्तिष्क के विकास में microRNAs भूमिका स्पष्ट करने के लिए एक तकनीक है. हालांकि, ओवो electroporation में उपयोग कर विशिष्ट क्षेत्रों को लक्षित चुनौती दे रहा है. यहाँ, हम एक कारगर तरीका चुनिंदा Electroporate उदर और पृष्ठीय मध्यमस्तिष्क क्षेत्रों को दिखाते हैं.

Abstract

गैर कोडन RNAs जीन अभिव्यक्ति को विनियमित करने में अतिरिक्त खिलाड़ी हैं. विशिष्ट क्षेत्रों के ओवो electroporation में लक्षित अस्थानिक microRNA अभिव्यक्ति के स्थानिक और लौकिक नियंत्रण के लिए एक अनूठा उपकरण प्रदान करता है. हालांकि, उदर मध्यमस्तिष्क तरह उदर मस्तिष्क संरचना किसी भी जोड़तोड़ के लिए तक पहुँचने के लिए नहीं बल्कि मुश्किल है. यहाँ, हम पतली प्लैटिनम इलेक्ट्रोड का उपयोग उदर मध्यमस्तिष्क में miRNA electroporate करने के लिए एक कारगर तरीका प्रदर्शित करता है. इस विधि मध्यमस्तिष्क और vivo अध्ययन के लिए एक उपयोगी उपकरण के विशिष्ट क्षेत्रों transfect करने के लिए एक विश्वसनीय तरीका प्रदान करता है.

Introduction

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जीन अभिव्यक्ति के लिए अतिरिक्त खिलाड़ी के रूप में छोटे गैर कोडन RNAs के मान्यता जीनोमिक प्रोग्रामिंग / जीन विनियमन के लिए एक नया जटिलता का शुभारंभ किया. गैर कोडन RNAs के विभिन्न प्रजातियों के छोटे गैर कोडन RNAs 1-4 सहित तंत्रिका कोशिकाओं में कार्यात्मक महत्व है. उदाहरण के लिए, MicroRNAs (मीर या miRNA) विकासशील दिमाग 5 में अलग और बदलते अभिव्यक्ति प्रोफाइल दिखा. विकास के दौरान जीन अभिव्यक्ति और मुंह बंद करने के अस्थायी और स्थानिक नियंत्रण के लिए एक अनूठा अवसर लड़की भ्रूण के ओवो electroporation में प्रदान करता है लक्षित.

इस वीडियो electroporation 6-10 ओवो में उपयोग करते हुए लड़की मध्यमस्तिष्क के विशिष्ट क्षेत्रों में miRs के अस्थानिक अभिव्यक्ति के प्रदर्शन के विभिन्न चरणों को दर्शाता है. कोशिकाओं में इन छोटे गैर कोडन RNAs के एक लंबे समय तक चलने प्रभाव को सुनिश्चित करने के लिए, miRs के डीएनए अनुक्रम मोनो या द्वि cistronic वैक्टर में क्लोन किया गया. ओवो electroporation में के लिए, मीर वी युक्तector अंडे का खोल में एक छोटी सी खिड़की बनाने के बाद भ्रूण को उजागर करके मध्यमस्तिष्क न्यूरल ट्यूब में इंजेक्ट किया जाता है. मध्यमस्तिष्क छोटे प्लस (एनोड) और ऋण (कैथोड) के विशिष्ट क्षेत्रों transfect प्लैटिनम इलेक्ट्रोड विशिष्ट पदों पर रखा जाता है. उदर मध्यमस्तिष्क अभिकर्मक के लिए, एनोड बाईं उदर मध्यमस्तिष्क और एक मौजूदा लागू करने से पहले मध्यमस्तिष्क के ठीक आधे से ऊपर कैथोड के नीचे रखा गया है. खोल में उद्घाटन टेप के साथ बंद हो गया है और भ्रूण के रूप में लंबे समय तक किसी भी विश्लेषण के लिए आवश्यक के रूप में के लिए incubated हैं. इस विधि मूल रूप से Muramatsu एट अल. 6 से वर्णित और विशिष्ट क्षेत्र अभिकर्मक के लिए Momose एट अल. 8 से सुधार हुआ है.


योजनाबद्ध सिंहावलोकन.

  1. अंडा में भ्रूण वें में एक छोटी सी खिड़की काटने से अवगत कराया हैई eggshell.
  2. भंग वेक्टर (एस) एक सूक्ष्म केशिका का उपयोग मध्यमस्तिष्क में इंजेक्ट किया जाता है.
  3. दो इलेक्ट्रोड - समानांतर या भ्रूण के तहत और ऊपर रखा - एक स्पंदित विद्युत क्षेत्र उत्पन्न करते हैं.
  4. बिजली के क्षेत्र अस्थायी एनोड 11,12 करने के लिए आकर्षित नकारात्मक आरोप लगाया डीएनए (या आरएनए) द्वारा कोशिका में प्रवेश की सुविधा है, जो कोशिका झिल्ली में pores, बनाता है.

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Protocol

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1. में ओवो electroporation के लिए आवश्यकताएँ

  1. वेक्टर निर्माण की तैयारी: मीर भावना और antisense प्राइमरों, Ambion के निर्देश के बाद तैयार annealed और ApaI में ligated गया / EcoRI pSilencer U6.1 वेक्टर पच. सफल परिवर्तन के बाद परिणामस्वरूप क्लोनों में से एक हो गया था और pSilencer प्लाज्मिड एक Quiagen मिडी तैयारी किट का उपयोग क्षारीय सेल पद्धति से अलग किया गया था.
  2. इलेक्ट्रोड: इलेक्ट्रोड खरीदा जा सकता है या आसानी से 13 का निर्माण किया. हम प्लैटिनम तार की स्वयं बनाया इलेक्ट्रोड (Φ = व्यास में 0.2, 0.25, या 0.5 मिमी) का उपयोग करें या कुछ मामलों में एक भी छोटे टंगस्टन तार इलेक्ट्रोड (Φ = 0.1 मिमी) 8 हम electroporate करना चाहते हैं जो क्षेत्र के आधार पर. ऊतक की चिलचिलाती से बचने के लिए, हम ऊतक इलेक्ट्रोड पतली करने के लिए करीब एक नियम के रूप में इस्तेमाल करते हैं. मध्यमस्तिष्क के व्यापक electroporation के लिए, हम एक पीतल / स्टेनलेस स्टील ट्यूबलर को soldered 0.5 मिमी प्लैटिनम तारों का उपयोगशाफ्ट और 3-5 मिमी की दूरी (चित्रा 1) के साथ एक इलेक्ट्रोड धारक को तय की. विशिष्ट क्षेत्रों electroporate करने के लिए, हम 0.25 मिमी प्लैटिनम तार एनोड और 0.2 मिमी प्लैटिनम तार या 1 मिमी या उससे कम की एक अनुमानित दूरी के साथ कैथोड के लिए 0.1 मिमी टंगस्टन का उपयोग करें.
  3. समाधान: निम्नलिखित समाधान के लिए तैयार है:
    1. Autoclaved चिकन घंटी, पीएच 7.5 (9.0 छ NaCl, 0.42 ग्राम KCl, 0.24 ग्राम CaCl2, 1 एल में आसुत जल भंग).
    2. पीबीएस (8 छ NaCl, 0.2 ग्राम KCl, 0.24 ग्राम के.एच. 2 PO4, 1.44 जी 2 ना HPO 4, 1L आसुत एच 2 ओ में भंग).
    3. फास्ट ग्रीन: शेयर समाधान 10 मिलीग्राम / एमएल आसुत एच 2 हे
    4. धीरे सूखने स्याही (कम चपड़ा और भ्रूण के लिए इस प्रकार कम विषाक्तता). नोट: सर्ग-Soler और एडलर 14 में वर्णित के रूप में एक फाइबर ऑप्टिक दीपक से जुड़ी एक नीले dichroic फिल्टर विपरीत बढ़ाता है और स्याही इंजेक्षन करने की आवश्यकता को समाप्त कर सकते हैं.


चित्रा 1. इलेक्ट्रोड और इलेक्ट्रोड धारक के योजनाबद्ध आरेख. (ए, बी, सी) प्लैटिनम तार एक स्टेनलेस स्टील ट्यूबलर शाफ्ट के एक तरफ करने के लिए soldered था. एक छेद इस प्रकार है कि पिन वाले प्लग (ए) लाल और नीले रंग का तार पिन वाले प्लग से जुड़े थे अंदर फिट कर सकते हैं ट्यूबलर शाफ्ट के दूसरे पक्ष में drilled किया गया था. विपरीत अंत में तार electroporator की बिजली की कुर्सियां ​​के साथ काम है कि केला connectors के लिए लगाया गया था. (ए, सी) प्लैटिनम तार 90 डिग्री के एक दूत में तुला हुआ था. नेल वार्निश की एक परत मोड़ ऊपर शाफ्ट पृथक.

2. सीधे ओवो electroporation पहले से तैयारी

  1. निम्नलिखित सामग्री तैयार:
    1. चिकन घंटी 1:06 साथ स्याही पतला, Gibc से एंटीबायोटिक antimycotic समाधान (100x जोड़) 1:100 ओ.
    2. वेक्टर समाधान तैयार: एच 2 ओ में विशिष्ट डीएनए प्रति 1-2 ग्राम / μl फास्ट ग्रीन (1:20) के साथ पूरक.
    3. 70% इथेनॉल के साथ संदंश, कैंची, टंगस्टन सुई और इलेक्ट्रोड जीवाणुरहित.
    4. Borosilicate ग्लास केशिकाओं (: 100 मिमी x 0.9 मिमी बाहरी व्यास लंबाई) से न्यूक्लिक एसिड इंजेक्शन के लिए micropipettes खींचो. हम तालिका 1 में दिखाया सेटिंग्स के साथ एक सरल खींचने पुल -1 (डब्ल्यूपीआई, बर्लिन) का उपयोग करें.
    5. तालिका 2 में दिखाया गया है electroporator के मापदंडों सेट.
पैरामीटर्स मान
गर्मी 350
खींच 100
वेग 50
देरी 200

तालिका 1. पुल-1 के लिए सेटिंग्स

पैरामीटर्स मान
आवृत्ति 50 हर्ट्ज
देरी 20 - 50 मिसे *
चौडाई 20 मिसे
वोल्टेज 8-25 वी *
नाड़ी 3 - 5 बार
* इलेक्ट्रोड व्यास और दूरी के आधार पर. कृपयामानकों में से एक को बदलने के खाते में जब कि ले.

तालिका 2. पल्स उत्तेजक के लिए सेटिंग्स

  1. Electroporation के लिए लड़की भ्रूण तैयार:
    1. हैम्बर्गर और हैमिल्टन (एच एच) के बीच भ्रूण प्राप्त करने के लिए 39 घंटे के लिए 65% आर्द्रता के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर उनके लंबे समय तक पक्ष पर निषेचित चिकन अंडे सेते 15 9-11 चरणों. भ्रूण अंडे की सर्वोच्च भाग पर बैठती है, तो आप एक पेंसिल लाइन के साथ यह निशान चाहिए.
    2. 70% इथेनॉल के साथ अंडे कीटाणुरहित.
    3. हवा गुहा जहां होना चाहिए, इसके व्यापक पक्ष में अंडा पियर्स.
    4. अंडे का सफेद की 1-2 एमएल निकालें. इस खोल से भ्रूण को अलग करेगा.
    5. सेलो टेप भ्रूण पर गिरने खोल splinters से बचने के लिए खोल. पेंसिल की रेखा के आसपास खोल में एक छोटी सी खिड़की में कटौती के लिए कैंची की एक जोड़ी का उपयोग करें.
    6. स्याही की एक बिट इंजेक्षनभ्रूण कल्पना करने के लिए क्षेत्र opaca नीचे.
    7. न्यूक्लिक एसिड इंजेक्शन और electroporation के लिए भ्रूण का एक बेहतर पहुँच प्राप्त करने के लिए एक तेज टंगस्टन सुई के साथ पीतक झिल्ली में एक कटौती करें.

3. Electroporation और ऊष्मायन

  1. भ्रूण पर गर्म घंटी समाधान की कुछ बूँदें जोड़ें. इस भ्रूण को कम overheating रोकने, ऊतक के लिए इलेक्ट्रोड के चिपके हुए हैं और दो इलेक्ट्रोड के बीच वर्तमान के लिए एक माध्यम प्रदान करेगा.
  2. मध्यमस्तिष्क स्तर पर न्यूरल ट्यूब के लुमेन में वेक्टर समाधान इंजेक्षन. अपने डीएनए अभिव्यक्ति वेक्टर कोई रिपोर्टर जीन (जैसे EGFP) होता है, डीएनए समाधान के लिए एक से थोड़ा कम केंद्रित रिपोर्टर जीन वेक्टर (1 ग्राम / μl मीर 0.9 माइक्रोग्राम / μl रिपोर्टर जीन वेक्टर वेक्टर व्यक्त) जोड़ें. यह आपको ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं बाद में 8 को पहचान सुनिश्चित करेगा. हम fro तथाकथित pCAX वेक्टर, एक तरह का उपहार का उपयोगएम सी क्रुल 13.
  3. मध्यमस्तिष्क की एक व्यापक अभिकर्मक के लिए, मध्यमस्तिष्क की ऊंचाई पर छोड़ दिया इलेक्ट्रोड और भ्रूण का सही जगह है. इलेक्ट्रोड के बीच की दूरी लगभग 3-5 मिमी होना चाहिए. अन्य सेटिंग्स 15V, 20 मिसे दालों और एच एच 10 के लिए 50 मिसे देरी कर रहे हैं. थोड़ा मध्यमस्तिष्क के dorso-उदर (डीवी) अक्ष के साथ दो इलेक्ट्रोड की स्थिति को बदलने की कोशिकाओं का एक और अधिक एक व्यापक अभिकर्मक DV अक्ष अभिकर्मक का आश्वासन दिया.
  4. उदर अभिकर्मक के लिए, जर्दी झिल्ली से सिर उठाना और उदर मध्यमस्तिष्क नीचे एनोड जगह पर कुछ घंटी जोड़ें. सिर न्यूरल ट्यूब की चिलचिलाती से बचने के लिए की जर्दी और भ्रूण को अलग करने वाली झिल्ली के नीचे इलेक्ट्रोड धक्का वृद्धि नहीं है. कैथोड मध्यमस्तिष्क dorso-laterally विपरीत एनोड को ऊपर रखा जाना चाहिए. न्यूरल ट्यूब को हाथ मत लगाओ. हम दिल के विकास के साथ किसी भी कठिनाइयों से बचने के लिए मध्यमस्तिष्क की बाईं उदर आधा transfect. इलेक्ट्रोड के बीच की दूरीचारों ओर 1-0.5 मिमी, सेटिंग्स के बाकी रहे 10V, 20 मिसे चौड़ाई और 50 मिसे देरी है.
  5. यह शांत और हवाई बुलबुले को दूर करने के लिए भ्रूण के शीर्ष पर खारा की एक बूंद लागू करें.
  6. टेप के साथ अंडे को सील करने और कम से कम 4 घंटे के लिए सेते, वेक्टर अभिव्यक्ति के लिए आवश्यक न्यूनतम समय.

4. चिकन भ्रूण का निर्धारण

  1. उनके अंडे से भ्रूण निकालें.
  2. एक stereomicroscope के तहत और एक फ्लोरोसेंट स्टीरियो माइक्रोस्कोप के साथ अभिकर्मक की सीमा का आकलन स्वच्छ भ्रूण.
  3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 4% पीएफए ​​में रात में भ्रूण फिक्स ट्रांसफ़ेक्ट क्षेत्र में परिवर्तन का विश्लेषण करने के लिए (सीटू संकरण, immunohistochemistry में) सेक्शनिंग और / या धुंधला के साथ आगे बढ़ें.

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Representative Results

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मीर के साथ ट्रांसफ़ेक्ट मध्यमस्तिष्क क्षेत्र की हद तक मीर व्यक्त वेक्टर (चित्रा 2) के साथ इंजेक्शन एक संवाददाता वेक्टर से GFP की अभिव्यक्ति के माध्यम से दिखाई दे रहा है. 0.5 मिमी की एक व्यास के साथ प्लैटिनम इलेक्ट्रोड का उपयोग और मध्यमस्तिष्क पश्चमस्तिष्क, और कभी कभी diencephalon (आंकड़े 2A और बी) सहित DV और एपी-अक्ष के साथ एक व्यापक क्षेत्र के अभिकर्मक, करने के लिए सामान्य रूप से मध्यमस्तिष्क सुराग के एपी धुरी के समानांतर रखा. एक विस्तृत बिजली के क्षेत्र में इलेक्ट्रोड के परिणाम के आकार मस्तिष्क क्षेत्र है और इस तरह एक विस्तृत ट्रांसफ़ेक्ट क्षेत्र के लिए लागू होता है.

यह सही उदाहरण के लिए उदर मध्यमस्तिष्क की तरह एक क्षेत्र को लक्षित करने के लिए मुश्किल है. एक छोटे बिजली के क्षेत्र को प्राप्त करने के लिए 0.5 मिमी इलेक्ट्रोड के बीच की दूरी को कम करना अक्सर भ्रूण के लिए विषाक्त है और कलाकृतियों की ओर जाता है. हम अधिक स्थानीय टीआरए की पेशकश जो छोटे व्यास (0.2 मिमी, 0.25 मिमी प्लैटिनम या 0.1 मिमी तेज टंगस्टन तार), के साथ इलेक्ट्रोड का इस्तेमाल किया(आंकड़े -2 सी आई) तक पहुँचने के लिए मुश्किल है जो उदर मस्तिष्क, की तरह है कि nsfection. छोटे इलेक्ट्रोड आवेदन बिजली क्षेत्र को कम करने और ऊतकों को बहुत करीब इलेक्ट्रोड डालने के लिए सक्षम. चित्रा 2 एफ पूरे उदर मध्यमस्तिष्क ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था, जहां एक उदाहरण से पता चलता है. आंकड़े 2 जी और 2H में ट्रांसफ़ेक्ट उदर क्षेत्रों में छोटे होते हैं, लेकिन पश्चमस्तिष्क (2 एफ) या diencephalon (2H) का हिस्सा भी ट्रांसफ़ेक्ट हैं. चित्रा 2 जी में, एनोड उदर क्षेत्रों दोनों transfect करने के लिए मध्य और पश्चमस्तिष्क के तहत रखा गया था. चित्रा 2H अच्छी तरह शाफ्ट साथ नेल वार्निश के साथ अलग नहीं एक anode के एक उदाहरण से पता चलता है. इस प्रकार, MHB के आसपास उदर क्षेत्र न केवल मीर / GFP व्यक्त लेकिन यह भी पृष्ठीय पूर्वकाल एमईएस और डि अंतःकपाल, एनोड की शाफ्ट रखा गया था, जहां. आंकड़े -2 सी-I में विशिष्ट उदर मीर / GFP वितरण स्थानीय से एक परिणाम हैबिजली के क्षेत्र में हम छोटे इलेक्ट्रोड के साथ लागू होते हैं. हम उदर मध्यमस्तिष्क की तरह अधिक प्रतिबंधित क्षेत्रों में डीएनए / आरएनए व्यक्त कर सकते हैं छोटे इलेक्ट्रोड और बिजली क्षेत्रों के साथ, साथ में ले ली.

हमारे microRNA अभिव्यक्ति वेक्टर कोई रिपोर्टर जीन होता है, हम क्रमशः 0.9 माइक्रोग्राम / μl, के लिए 1 ग्राम / μl के अनुपात में वेक्टर व्यक्त GFP में मिश्रण. लगभग बराबर अनुपात microRNA और GFP ट्रांसफ़ेक्ट क्षेत्र लगभग पूरी तरह से ओवरलैप (Momose एट अल. 8 और अपने अनुभव को देखें) सुनिश्चित करता है. विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं से युक्त केवल एक छोटे से क्षेत्र ट्रांसफ़ेक्ट है या कोशिकाओं QRT-पीसीआर के लिए उपयोग किया जाता है जब ट्रांसफ़ेक्ट क्षेत्र की हद तक न्याय करने में सक्षम होने के लिए महत्वपूर्ण हो जाता है. पत्रकार जीन का एक बहुत कम एकाग्रता का पता लगाने के स्तर के नीचे GFP व्यक्त कोशिकाओं को जन्म दे सकता है. किसी भी ट्रांसफ़ेक्ट वेक्टर की अभिव्यक्ति की शक्ति का इस्तेमाल किया वेक्टर की एकाग्रता पर भी प्रमोटर पर ही नहीं निर्भर करता है. हमारे वैक्टर U6 प्रमोटर driv हैंएन (miRNA व्यक्त) और एसएस actin के प्रमोटर (फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त) संचालित और दोनों सर्वत्र और अनिवार्यता से सक्रिय लड़की भ्रूण में हैं.

हमारे भ्रूण के अधिकांश चित्रा -2 (दर्पण छवि) के लिए छोड़कर बाईं ओर electroporated कर रहे हैं. सबसे भ्रूण उनकी बाईं ओर सही और झूठ की ओर अपने सिर बारी के बाद से समय चूक प्रयोगों के लिए, भ्रूण के सही पक्ष की electroporation की सिफारिश की है.


चित्रा 2. प्रतिनिधि परिणाम है. भ्रूण HH10 और HH11 के बीच electroporated और चित्रों में दर्शाए गए चरणों में तय किया गया. उदर मध्यमस्तिष्क की (एसी) शो पृष्ठीय मध्यमस्तिष्क की electroporations, और (डीआई). (डी, ई) में तीर औदरीयता स्थित, GFP सकारात्मक कोशिकाओं से संकेत मिलता है. अधिक जानकारी के लिए पाठ देखें. एमईएस- Mesencephalon / मध्यमस्तिष्क, डि - diencephalon, दूरभाष - telencephalon, Rhom - rhombencephalon / पश्चमस्तिष्क.

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Discussion

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इस वीडियो लड़की मध्यमस्तिष्क के विशिष्ट क्षेत्रों की neuroepithelial कोशिकाओं में प्लाज्मिड transfect करने के लिए एक प्रभावी तरीका दर्शाता है. कम वोल्टेज के आयताकार बिजली दालों 6,16 ओवो में लड़की न्यूरल ट्यूब की कोशिकाओं में डीएनए को पेश कर सकते हैं. हालांकि, डीएनए लक्ष्यीकरण की सटीकता अक्सर अपेक्षाकृत बड़े इलेक्ट्रोड (Φ = 0.5 एमएम) के माध्यम से बढ़ जाता है, जो व्यापक बिजली के क्षेत्र, द्वारा बाधा है. हम Momose एट अल. 8 के दिशा निर्देशों का पालन व्यास में छोटे इलेक्ट्रोड का उपयोग करके कि समस्या से निपटने की कोशिश की. भ्रूण की उम्र सीधे उदर मध्यमस्तिष्क नीचे यह अनुमति देता है उदर मध्यमस्तिष्क अभिकर्मक के लिए, हम क्षेत्र pellucida या की झिल्ली के नीचे कैथोड जगह है. तंत्रिका / मध्यमस्तिष्क ट्यूब ऊतक एनोड से छुआ और क्षतिग्रस्त नहीं किया जाना चाहिए क्योंकि पिछले परिदृश्य अभ्यास का एक बिट की जरूरत है. घंटी जोड़ना अक्सर थोड़ा क्षेत्र pellucida कवर झिल्ली बंद भ्रूण के सिर उठाने के लिए मदद कर सकते हैं.

सेल में हैं जीन सांद्रता पर विचार करना है. अलग जीन खुराक कोशिकाओं और ऊतकों पर अलग अलग प्रभाव हो सकता है. वहाँ (उदाहरण के लिए, Agoston एट अल. 17 देखें) शामिल एक सीमा प्रभाव हो सकता है या अलग, वर्गीकृत प्रभाव सकता है. हम सामान्य रूप से diffe का परीक्षणमीर का किराया सांद्रता (0.5-2 ग्राम / μl) वेक्टर व्यक्त और आकारिकी या प्रोटीन / जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन का विश्लेषण. प्रभाव immunohistochemistry का उपयोग vivo में परीक्षण किया जा सकता है, सेंसर स्वस्थानी संकरण में 18 या शाही सेना वैक्टर.

इस तकनीक को भी डे PIETRI Tonelli एट अल. 18 में वर्णित के रूप में उदाहरण के लिए एक दोहरी प्रतिदीप्ति संवाददाता / सेंसर सदिश का उपयोग vivo में एक विशिष्ट मीर की किसी भी गतिविधि की ताकत और स्थान का परीक्षण करने के लिए प्रदान करता है. वे एक GFP-रिपोर्टर और एक आरएफपी मीर सेंसर होता है कि एक सदिश का उपयोग करें. आरएफपी एक मानार्थ मीर अनुक्रम द्वारा पीछा किया जाता है. GFP अभिव्यक्ति सफलतापूर्वक ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं की पहचान करता है, जबकि लाल प्रतिदीप्ति (आरएफपी) की जांच मीर के अभाव का संकेत है, और लाल प्रतिदीप्ति के लापता होने के मीर की उपस्थिति को धोखा देता है. इस तकनीक को भी आरएफपी के बहाव में लक्ष्य अनुक्रम की 3'UTR का उपयोग करके, विवो में मीर लक्ष्य की विशिष्टता का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.इस तकनीक को साथ में ले ली विभिन्न ऊतकों में जीन अभिव्यक्ति और समारोह पर विकास अध्ययन के लिए बेहद उपयुक्त है.

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Disclosures

हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

हम मीर तस्वीर के लिए इस फिल्म और एम. Nicolescu के प्रारंभिक चरण के लिए जो योगदान दिया लालकृष्ण Mikic स्वीकार करते हैं. सी. ह्यूबर Universtitätsklinikum Tübingen के भाग्य कार्यक्रम द्वारा Universtitätsklinikum के Tübingen IZKF, ए Alwin प्रेम आनंद का एक फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Borosillicate glass capillaries Hartenstein Model: 0.9 mm
Microcapillary puller WPI, Berlin Model: Pul1-E
Electroporator Intracel Model: TSSIC
Stereomicroscope - fluorescence LEICA Model: MZFLIII
Stereomicroscope Zeiss Model: Stemi
Camera and software Zeiss Model: Axiocam MRc/ Axiovision Re. 4.8

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kutter, C., Svoboda, P. miRNA, siRNA, piRNA: Knowns of the unknown. RNA Biol. 5, 181-188 (2008).
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वेंट्रल चिकी midbrain में microRNA की <em>ओवो</em> अभिव्यक्ति <em>में</em>
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Huber, C., Prem Anand, A. A., Mauz, M., Künstle, P., Hupp, W., Hirt, B., Wizenmann, A. In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain. J. Vis. Exp. (79), e50024, doi:10.3791/50024 (2013).More

Huber, C., Prem Anand, A. A., Mauz, M., Künstle, P., Hupp, W., Hirt, B., Wizenmann, A. In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain. J. Vis. Exp. (79), e50024, doi:10.3791/50024 (2013).

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