I ovo Expression av mikroRNA i ventral Chick midthjernen

Summary

Ektopisk uttrykk er en teknikk for å belyse den microRNAs rolle i hjernens utvikling. Men, rettet mot bestemte områder ved hjelp av i ovo electroporation er utfordrende. Her viser vi en effektiv måte å selektivt electroporate ventrale og dorsale midthjernen regioner.

Abstract

Ikke-kodende RNA er flere spillere i regulering av genuttrykk. Målrettet i ovo electroporation av bestemte områder gir et unikt verktøy for romlig og tidsmessig kontroll av ektopisk mikroRNA uttrykk. Men ventral strukturer i hjernen som ventral midthjernen er ganske vanskelig å nå for noen manipulasjoner. Her viser vi en effektiv måte å electroporate miRNA inn ventral midthjernen ved hjelp av tynne platina elektroder. Denne metoden gir en pålitelig måte å transfektere bestemte områder av midthjernen og et nyttig verktøy for in vivo studier.

Introduction

Erkjennelsen av små ikke-kodende RNA som flere spillere for genuttrykk lansert en ny kompleksitet til genomisk programmering / genregulering. Forskjellige arter av ikke-kodende RNA har funksjonell betydning i nerveceller, inkludert små ikke-kodende RNA ^1-4. MicroRNAs (MIR eller miRNA), for eksempel vise distinkte og skiftende uttrykk profiler i utviklings hjerner ^fem. Målrettet i ovo electroporation av kyllingembryo gir en unik mulighet for temporal og romlig kontroll av genuttrykk og lyddemping under utvikling.

Denne videoen viser de ulike trinnene i å utføre ektopisk uttrykk for Mirs i bestemte områder av dama midthjernen bruker i ovo elektroporering ^6-10. For å sikre en langvarig effekt av disse små ikke-kodende RNA i celler, ble DNA-sekvensen av Mirs klonet inn mono-eller bi-cistronic vektorer. For i ovo electroporation, Mir inneholder vEctor injiseres i midthjernen nevralrøret ved å utsette fosteret etter at et lite vindu i eggeskallet. For å transfektere bestemte områder av midthjernen plus (anode) og minus (katoden) platina elektroder er plassert på bestemte posisjoner. For ventral midthjernen transfeksjon, blir anode plassert under den venstre ventral midthjernen og katoden over den høyre halvdelen av midthjernen før påføring av en strøm. Åpningen i eggeskallet er lukket med tape, og embryoene ble inkubert så lenge som er nødvendig for en hvilken som helst analyse. Denne fremgangsmåte ble opprinnelig beskrevet av Muramatsu et al. ^6. og forbedret av Momose et al. ⁸ for bestemt område transfeksjon.

Skjematisk oversikt.

1. Embryoet i egget er eksponert ved å skjære et lite vindu inn i the eggeskall.
2. Det oppløste vektor (e) blir injisert inn i midthjernen ved hjelp av et mikrokapillært.
3. To elektroder – som er lagt inn parallelt eller under og over embryoet – å generere et pulset elektrisk felt.
4. Det elektriske feltet timelig skaper porene i cellemembranen, noe som letter adgang til cellen av den negativt ladede DNA (eller RNA) tiltrekkes til anoden ^11,12.

Protocol

En. Krav til In ovo Electroporation Klargjøring av vektorkonstruksjon: Mir fornuft og antisense primere ble utformet etter instruksjoner fra Ambion, glødet og legert inn ApaI / EcoRI fordøyd pSilencer U6.1 vektor. Etter vellykket endring av en av de resulterende klonene ble dyrket og pSilencer plasmid ble isolert ved alkalisk lysis metoden ved hjelp av et Quiagen midi preparat kit. Elektroder: Elektroder kan kjøpes eller kan lett bygges 13.. …

Representative Results

Omfanget av midthjernen område transfektert med miR er synlig gjennom ekspresjon av GFP fra en reporter vektor injisert sammen med miR uttrykker vektoren (figur 2). Ved å bruke platina-elektroder med en diameter på 0,5 mm og plassert parallelt med ap-aksen av midthjernen fører normalt til transfeksjon av et bredt område langs DV-og AP-aksen, inklusive hindbrain, midthjernen og noen ganger diencephalon (figurene 2A og B). Størrelsen av elektrodene resulterer i et stort elektrisk fe…

Discussion

Denne videoen viser en effektiv metode for å transfektere plasmid inn i neuroepithelial cellene i bestemte områder av dama midthjernen. Rektangulære elektriske pulser av lav spenning kan innføre DNA i cellene i chick nevralrøret i ovo ^6,16. Imidlertid er nøyaktigheten av DNA målretting ofte hindret av den store elektriske felt, som stiger opp gjennom den relativt store elektroder (Φ = 0,5 mm). Vi prøvde å takle det problemet ved hjelp av elektroder mindre i diameter følge retningslinjene f…

Materials

Name	Company		Model
Borosillicate glass capillaries	Hartenstein		Model: 0.9 mm
Microcapillary puller	WPI, Berlin		Model: Pul1-E
Electroporator	Intracel		Model: TSSIC
Stereomicroscope – fluorescence	LEICA		Model: MZFLIII
Stereomicroscope	Zeiss		Model: Stemi
Camera and software	Zeiss		Model: Axiocam MRc/ Axiovision Re. 4.8