I ovo Angivelse af MicroRNA i Ventral Chick Midbrain
Summary
Ektopisk udtryk er en teknik til at belyse microRNA rolle i hjernens udvikling. Men rettet mod specifikke områder ved hjælp af in ovo elektroporation er udfordrende. Her viser vi en effektiv måde til selektivt elektroporere ventrale og dorsale midthjernen regioner.
Abstract
Ikke-kodende RNA er yderligere spillere i regulering af genekspression. Målrettet in ovo elektroporation specifikke områder giver et unikt værktøj til rumlige og tidsmæssige styring af ektopisk microRNA udtryk. Men er temmelig svært at nå for eventuelle manipulationer ventrale hjernens strukturer som ventrale midthjernen. Her viser vi en effektiv måde at elektroporere miRNA i ventrale midthjernen hjælp af tynde platinelektroder. Denne metode giver en pålidelig måde til at transficere bestemte områder af midthjernen og et nyttigt redskab til in vivo-undersøgelser.
Introduction
Anerkendelsen af små ikke-kodende RNA som ekstra spillere til genekspression lanceret en ny kompleksitet til genomisk programmering / genregulering. Forskellige arter af ikke-kodende RNA har funktionel betydning i neurale celler, herunder små ikke-kodende RNA 1-4. MicroRNA (MIR eller miRNA) for eksempel viser forskellige og skiftende udtryk profiler i udviklingslandene hjerner 5. Målrettet in ovo elektroporation af kyllingeembryoer giver en enestående mulighed for tidslige og rumlige kontrol af genekspression og lyddæmpning under udviklingen.
Denne video viser de forskellige trin i at udføre ektopisk udtryk for Mirs i bestemte områder af chick midthjernen hjælp i ovo elektroporation 6-10. For at sikre en langvarig effekt af disse små ikke-kodende RNA i cellerne, blev DNA-sekvensen af Mirs klonet i mono-eller bi-cistroniske vektorer. For i ovo elektroporation, miR indeholdende vektor injiceres i midthjernen neuralrøret ved at udsætte embryo efter at et lille vindue i æggeskallen. Til transfektion af specifikke områder af midthjernen lille plus (anode) og minus (katode) Platin elektroder placeres på bestemte positioner. For ventrale midthjernen transfektion, er anoden placeret under den venstre ventrale midthjernen og katoden over den højre halvdel af midthjernen, før påføring af en strøm. Åbningen i æggeskallen er lukket med tape og embryoner inkuberes i så længe som nødvendigt for enhver analyse. Denne metode blev oprindeligt beskrevet af Muramatsu et al. 6 og forbedret af Momose et al. 8 for specifikt område transfektion.
Skematisk oversigt.
- Embryoet i ægget er eksponeret ved at skære et lille vindue i the æggeskal.
- Det opløste vektor (er) injiceres i midthjernen under anvendelse af en mikrokapillarbøsninger.
- To elektroder – placeret parallelt eller over og under embryo – generere et pulserende elektrisk felt.
- Det elektriske felt tidsmæssigt skaber porer i cellemembranen, der letter indgang i cellen ved den negativt ladede DNA (eller RNA), tiltrækkes til anoden 11,12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne video viser en effektiv metode til at transficere plasmid ind i de neuroepitelceller for specifikke områder af chick midthjernen. Rektangulære elektriske impulser med lav spænding kan indføre DNA i celler af chick neuralrøret in ovo 6,16. Imidlertid er nøjagtigheden af DNA målretning ofte hindret af den brede elektriske felt, som stiger op gennem de relativt store elektroder (Φ = 0,5 mm). Vi forsøgte at løse dette problem ved hjælp af elektroder mindre i diameter følge retning…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi anerkender K. Mikic, der har bidraget til den indledende fase af denne film og M. Nicolescu for miR billedet. C. Huber blev støttet af et fællesskab af IZKF af Universtitätsklinikum Tübingen, A. Alwin Prem Anand af Fortune program Universtitätsklinikum Tübingen.
Materials
| Name | Company | Model | |
| Borosillicate glass capillaries | Hartenstein | Model: 0.9 mm | |
| Microcapillary puller | WPI, Berlin | Model: Pul1-E | |
| Electroporator | Intracel | Model: TSSIC | |
| Stereomicroscope – fluorescence | LEICA | Model: MZFLIII | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Model: Stemi | |
| Camera and software | Zeiss | Model: Axiocam MRc/ Axiovision Re. 4.8 |
References
- Kutter, C., Svoboda, P. miRNA, siRNA, piRNA: Knowns of the unknown. RNA Biol. 5, 181-188 (2008).
- Szell, M., Bata-Csorgo, Z., Kemeny, L. The enigmatic world of mRNA-like ncRNAs: their role in human evolution and in human diseases. Semin. Cancer Biol. 18, 141-148 (2008).
- Li, X., Jin, P. Roles of small regulatory RNAs in determining neuronal identity. Nature reviews. Neuroscience. 11, 329-338 (2010).
- Riedmann, L. T., Schwentner, R. miRNA, siRNA, piRNA and argonautes: news in small matters. RNA Biol. 7, 133-139 (2010).
- Coolen, M., Bally-Cuif, L. MicroRNAs in brain development and physiology. Curr. Opin. Neurobiol. 19, 461-470 (2009).
- Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo. Biochem. Biophys. Res. Commun. 230, 376-380 (1997).
- Itasaki, N., Bel-Vialar, S., Krumlauf, R. Shocking’ developments in chick embryology: electroporation and in ovo gene expression. Nat. Cell Biol. 1, 203-207 (1999).
- Momose, T., et al. Efficient targeting of gene expression in chick embryos by microelectroporation. Dev. Growth Differ. 41, 335-344 (1999).
- Nakamura, H., Watanabe, Y. Misexpression of genes in brain vesicles by in ovo electroporation. Dev. Growth Differ. 42, 199-201 (2000).
- Voiculescu, O., Papanayotou, C., Stern, C. D. Spatially and temporally controlled electroporation of early chick embryos. Nat. Protoc. 3, 419-426 (2008).
- Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Gene Hofschneider, P. H. transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. The EMBO journal. 1, 841-845 (1982).
- Potter, H., Weir, L., Leder, P. Enhancer-dependent expression of human kappa immunoglobulin genes introduced into mouse pre-B lymphocytes by electroporation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81, 7161-7165 (1984).
- Krull, C. E. A primer on using in ovo electroporation to analyze gene function. Dev. Dyn. 229, 433-439 (2004).
- Canto-Soler, M. V., Adler, R. Optic cup and lens development requires Pax6 expression in the early optic vesicle during a narrow time window. Developmental biology. , 294-2119 (2006).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Dev Dyn. 195, 231-272 (1992).
- Muramatsu, T., Nakamura, A., Park, H. M. In vivo electroporation: a powerful and convenient means of nonviral gene transfer to tissues of living animals (Review). Int J Mol Med. 1, 55-62 (1998).
- Agoston, Z., Li, N., Haslinger, A., Wizenmann, A., Schulte, D. Genetic and physical interaction of Meis2, Pax3 and Pax7 during dorsal midbrain development. BMC Dev Biol. 12, 10 (2012).
- De Pietri Tonelli, D., et al. Single-cell detection of microRNAs in developing vertebrate embryos after acute administration of a dual-fluorescence reporter/sensor plasmid. Biotechniques. 41, 727-732 (2006).
