वेंट्रल चिकी midbrain में microRNA की ओवो अभिव्यक्ति में
Summary
अस्थानिक अभिव्यक्ति मस्तिष्क के विकास में microRNAs भूमिका स्पष्ट करने के लिए एक तकनीक है. हालांकि, ओवो electroporation में उपयोग कर विशिष्ट क्षेत्रों को लक्षित चुनौती दे रहा है. यहाँ, हम एक कारगर तरीका चुनिंदा Electroporate उदर और पृष्ठीय मध्यमस्तिष्क क्षेत्रों को दिखाते हैं.
Abstract
गैर कोडन RNAs जीन अभिव्यक्ति को विनियमित करने में अतिरिक्त खिलाड़ी हैं. विशिष्ट क्षेत्रों के ओवो electroporation में लक्षित अस्थानिक microRNA अभिव्यक्ति के स्थानिक और लौकिक नियंत्रण के लिए एक अनूठा उपकरण प्रदान करता है. हालांकि, उदर मध्यमस्तिष्क तरह उदर मस्तिष्क संरचना किसी भी जोड़तोड़ के लिए तक पहुँचने के लिए नहीं बल्कि मुश्किल है. यहाँ, हम पतली प्लैटिनम इलेक्ट्रोड का उपयोग उदर मध्यमस्तिष्क में miRNA electroporate करने के लिए एक कारगर तरीका प्रदर्शित करता है. इस विधि मध्यमस्तिष्क और vivo अध्ययन के लिए एक उपयोगी उपकरण के विशिष्ट क्षेत्रों transfect करने के लिए एक विश्वसनीय तरीका प्रदान करता है.
Introduction
जीन अभिव्यक्ति के लिए अतिरिक्त खिलाड़ी के रूप में छोटे गैर कोडन RNAs के मान्यता जीनोमिक प्रोग्रामिंग / जीन विनियमन के लिए एक नया जटिलता का शुभारंभ किया. गैर कोडन RNAs के विभिन्न प्रजातियों के छोटे गैर कोडन RNAs 1-4 सहित तंत्रिका कोशिकाओं में कार्यात्मक महत्व है. उदाहरण के लिए, MicroRNAs (मीर या miRNA) विकासशील दिमाग 5 में अलग और बदलते अभिव्यक्ति प्रोफाइल दिखा. विकास के दौरान जीन अभिव्यक्ति और मुंह बंद करने के अस्थायी और स्थानिक नियंत्रण के लिए एक अनूठा अवसर लड़की भ्रूण के ओवो electroporation में प्रदान करता है लक्षित.
इस वीडियो electroporation 6-10 ओवो में उपयोग करते हुए लड़की मध्यमस्तिष्क के विशिष्ट क्षेत्रों में miRs के अस्थानिक अभिव्यक्ति के प्रदर्शन के विभिन्न चरणों को दर्शाता है. कोशिकाओं में इन छोटे गैर कोडन RNAs के एक लंबे समय तक चलने प्रभाव को सुनिश्चित करने के लिए, miRs के डीएनए अनुक्रम मोनो या द्वि cistronic वैक्टर में क्लोन किया गया. ओवो electroporation में के लिए, मीर वी युक्तector अंडे का खोल में एक छोटी सी खिड़की बनाने के बाद भ्रूण को उजागर करके मध्यमस्तिष्क न्यूरल ट्यूब में इंजेक्ट किया जाता है. मध्यमस्तिष्क छोटे प्लस (एनोड) और ऋण (कैथोड) के विशिष्ट क्षेत्रों transfect प्लैटिनम इलेक्ट्रोड विशिष्ट पदों पर रखा जाता है. उदर मध्यमस्तिष्क अभिकर्मक के लिए, एनोड बाईं उदर मध्यमस्तिष्क और एक मौजूदा लागू करने से पहले मध्यमस्तिष्क के ठीक आधे से ऊपर कैथोड के नीचे रखा गया है. खोल में उद्घाटन टेप के साथ बंद हो गया है और भ्रूण के रूप में लंबे समय तक किसी भी विश्लेषण के लिए आवश्यक के रूप में के लिए incubated हैं. इस विधि मूल रूप से Muramatsu एट अल. 6 से वर्णित और विशिष्ट क्षेत्र अभिकर्मक के लिए Momose एट अल. 8 से सुधार हुआ है.
योजनाबद्ध सिंहावलोकन.
- अंडा में भ्रूण वें में एक छोटी सी खिड़की काटने से अवगत कराया हैई eggshell.
- भंग वेक्टर (एस) एक सूक्ष्म केशिका का उपयोग मध्यमस्तिष्क में इंजेक्ट किया जाता है.
- दो इलेक्ट्रोड – समानांतर या भ्रूण के तहत और ऊपर रखा – एक स्पंदित विद्युत क्षेत्र उत्पन्न करते हैं.
- बिजली के क्षेत्र अस्थायी एनोड 11,12 करने के लिए आकर्षित नकारात्मक आरोप लगाया डीएनए (या आरएनए) द्वारा कोशिका में प्रवेश की सुविधा है, जो कोशिका झिल्ली में pores, बनाता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
इस वीडियो लड़की मध्यमस्तिष्क के विशिष्ट क्षेत्रों की neuroepithelial कोशिकाओं में प्लाज्मिड transfect करने के लिए एक प्रभावी तरीका दर्शाता है. कम वोल्टेज के आयताकार बिजली दालों 6,16 ओवो में लड़की न्यूरल ट्यूब ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम मीर तस्वीर के लिए इस फिल्म और एम. Nicolescu के प्रारंभिक चरण के लिए जो योगदान दिया लालकृष्ण Mikic स्वीकार करते हैं. सी. ह्यूबर Universtitätsklinikum Tübingen के भाग्य कार्यक्रम द्वारा Universtitätsklinikum के Tübingen IZKF, ए Alwin प्रेम आनंद का एक फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Model | |
| Borosillicate glass capillaries | Hartenstein | Model: 0.9 mm | |
| Microcapillary puller | WPI, Berlin | Model: Pul1-E | |
| Electroporator | Intracel | Model: TSSIC | |
| Stereomicroscope – fluorescence | LEICA | Model: MZFLIII | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Model: Stemi | |
| Camera and software | Zeiss | Model: Axiocam MRc/ Axiovision Re. 4.8 |
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