Summary
In dit artikel beschrijven we een bruikbare methode om ligand-gated ionkanalen functie te bestuderen in neuronen van acuut geïsoleerd hersenen plakjes. Deze methode omvat het gebruik van een geneesmiddel gevulde micropipet voor lokale toepassing van geneesmiddelen voor neuronen opgenomen met standaard patch-clamp technieken.
Abstract
Het gebruik van tabak leidt tot tal van gezondheidsproblemen, zoals kanker, hart-en vaatziekten, longemfyseem, en beroerte. Verslaving aan het roken van sigaretten is een wijdverspreide neuropsychiatrische aandoening die voortkomt uit de biofysische en cellulaire acties van nicotine op nicotine acetylcholine receptoren (nAChRs) in het hele centrale zenuwstelsel. Inzicht in de verschillende nAChR subtypes die bestaan in hersengebieden die relevant zijn voor nicotine verslaving is een belangrijke prioriteit.
Experimenten die elektrofysiologie technieken zoals whole-cell patch clamp of twee-elektrode spanningsklem opnames in dienst zijn nuttig voor farmacologische karakterisering van nAChRs van belang. Cellen die nAChRs, zoals zoogdieren weefselkweek cellen of Xenopus laevis oöcyten, zijn fysiek geïsoleerd en zijn dus gemakkelijk bestudeerd met behulp van de instrumenten van de moderne farmacologie. Er is veel vooruitgang gemaakt met behulp van deze technieken, in het bijzonder wanneer het doel-receptor werd al bekend eennd ectopische expressie werd gemakkelijk bereikt. Vaak echter moet nAChRs in hun oorspronkelijke omgeving studeren: in neuronen in hersencoupes acuut geoogst laboratorium muizen of ratten. Bijvoorbeeld, muizen die "overgevoelig" nAChR subunits zoals α4 L9'A muizen 1 en α6 L9 MICE 2, zorgen voor eenduidige identificatie van neuronen basis van hun functionele expressie van een specifieke nAChR subeenheid. Hoewel whole-cell patch clamp opnamen van neuronen in de hersenen plakjes wordt routinematig gedaan door de deskundige elektrofysioloog, is het een uitdaging om lokaal toe te passen geneesmiddelen zoals acetylcholine of nicotine om de opgenomen cel binnen een brein slice. Verdunning van drugs in de superfusate (bad toepassing) is niet snel omkeerbaar, en U-buis systemen zijn niet gemakkelijk worden aangepast om te werken met de hersenen plakjes.
In dit artikel beschrijven we een methode voor het snel aanbrengen nAChR-activerende drugs aan neuronen die in volwassen mOuse hersenen plakjes. Standaard whole-cell opnamen zijn gemaakt van neuronen in plakjes, en een tweede micropipet gevuld met een medicijn plaats wordt gemanoeuvreerd positie nabij de opgenomen cel. Een injectie van perslucht of stikstof inert in de drug gevulde pipet veroorzaakt een kleine hoeveelheid geneesmiddel oplossing wordt uitgestoten uit de pipet op de gemaakte cel. Met behulp van deze methode, nAChR-gemedieerde stromen kunnen worden opgelost op de milliseconde nauwkeurig. Drug Application tijden kunnen gemakkelijk worden gevarieerd, en het medicijn gevulde pipet kan worden teruggetrokken en vervangen door een nieuwe pipet, waardoor concentratie-reactiekrommen te creëren voor een neuron. Hoewel beschreven in de context van nAChR neurobiologie zou deze techniek nuttig voor het bestuderen van vele soorten ligand-gated ionkanalen of receptoren in neuronen van hersencoupes.
Protocol
1. Bereiding van oplossingen voor Brain Slice Voorbereiding en Elektrofysiologie
- Oplossingen voor bereiding van hersencoupes werden eerder beschreven 3, 4. Voorbereiden N-methyl-D glucamine (NMDG) gebaseerde snijden en herstel oplossing van de volgende samenstelling (in mM): 93 n-methyl D-glucamine, 2,5 KCl, 1,2 NaH 2PO 4, 30 NaHCO 3, 20 HEPES, 25 glucose, 5 Na + ascorbaat, 2 thioureum, 3 Na + pyruvaat, 10 MgSO 4 • 7H 2 O, 0,5 CaCl2 • 2H 2 O. Aan te passen aan 300 tot 310 mOsm met NMDG. Breng de pH op 7,3-7,4 met 10 N HCl.
- Los MgSO 4 • 7H 2 O en CaCl 2 • 2H 2 O in Millipore water tot 2 M voorraadoplossingen van elk merk.
- Afgewogen andere componenten in de aangegeven volgorde en aan een maatkolf gedeeltelijk gevuld met Millipore water onder roeren op te lossen. Zodra alles is toegevoegd, vulmaatkolf met Millipore water.
- Meet de pH en pas met 10 N HCl.
- Meet de osmolariteit en stel met NMDG indien nodig.
- Bereid HEPES dat kunstmatige cerebrospinale vloeistof (aCSF) met de volgende samenstelling (in mM): 92 NaCl, 2,5 KCl, 1,2 NaH 2PO 4, 30 NaHCO 3, 20 HEPES, 25 glucose, 5 Na + ascorbaat, 2 thioureum, 3 Na + pyruvaat, 2 MgSO 4 • 7H 2 O, 2 CaCl 2 • 2H 2 O. Aan te passen aan 300 tot 310 mOsm met sucrose. Breng de pH op 7,3-7,4 met 1 N HCl of NaOH.
- Afgewogen componenten in de aangegeven volgorde en aan een maatkolf gedeeltelijk gevuld met Millipore water onder roeren op te lossen. Zodra alles is toegevoegd, vul maatkolf met Millipore water.
- Meet de pH en stel met NaOH of HCl, indien nodig.
- Meet de osmolariteit en stel met sucrose indien nodig.
- Standaardformulieren aCSF opname oplossing van de volgende samenstelling (in mM): 124 NaCl, 2,5 KCl, 1,2 NaH 2PO 4, 24 NaHCO3, 12,5 glucose, 2 MgSO 4 • 7H 2 O, 2 CaCl2 • 2H 2 O. Aan te passen aan 300 tot 310 mOsm met sucrose. Breng de pH op 7,3-7,4 met 1 N HCl of NaOH.
2. Voorbereiding van Acute Brain Slices
- Brain slicen en terugwinning uitgevoerd zoals eerder beschreven 3, 4. Bubble twee kristallen schalen gevuld met NMDG recovery-oplossing met 95% zuurstof / 5% CO 2-gas (carbogen), een schotel op het ijs, de andere op 33 ° C.
- Bubble een kristal schaal gevuld met HEPES houden aCSF met carbogen bij kamertemperatuur.
- Verdoven volwassen muizen (2 tot 12 maanden) met Na + pentobarbital (200 mg / kg, ip). Ga verder met procedure bij het dier heeft geen reactie op een teen-snuifje.
- Indien nodig, knip een staart weefselmonster voor later genotypIng van het dier.
- Open de borstholte, bloot te leggen het hart, en klem de aorta descendens. Verscheuren het rechter atrium.
- Transcardiaal perfuseren dier met 5-10 ml van 0-4 ° C NMDG-recovery oplossing.
- Onthoofden dier, de hersenen verwijderd en plaats het in 4 ° C NMDG-recovery oplossing gedurende 1 min.
- Op een ijs-gekoeld metalen plaat, trim de hersenen in de gewenste richting (coronaal, parasagittal, horizontaal, enz.) om het gebied in de omgeving zijn.
- Bevestig de hersenen blok met superlijm aan de droge fase oppervlak van een trillende snijmachine (DSK-Zero 1, Dosaka), dompel de hersenen blok in 4 ° C NMDG-recovery-oplossing, en continu zeepbel van de oplossing met carbogen.
- Snijd plakjes van de hersenen gebied van belang. Plakdikte is 200-400 urn, afhankelijk van de specifieke hersengebied plaats, dierlijke leeftijd en experiment uit te voeren.
- Onmiddellijk na het snijden, incubeer gewenste plakjes in carbogenated, 33 ° C NMDG-herstel Solutiop precies 12 minuten, vervolgens over te dragen aan carbogenated, kamertemperatuur HEPES houdt oplossing voor een eerste periode van 60 minuten. Na deze 60 min incubatie, kunnen segmenten gebruikt worden voor opname. Plakjes worden gehandhaafd HEPES oplossing die gedurende de dag tot ze worden gebruikt voor opname.
3. Patch Clamp Opnemen vanaf Neuronen in Brain Slices
- Trek een standaard patch micropipet met een programmeerbare Flaming-Brown trekker (Sutter P-97 of gelijkwaardig verticale trekker). Pipetten die optimaal zijn voor giga-ohm seal vorming gewoonlijk een weerstand van 4-6 MQ
- Overdracht een schijfje naar de opname kamer (RC-27L; Warner Instruments) op het podium van een rechtopstaande microscoop (Nikon FN-1). Continu superfuse (1,5 - 2,0 ml / min) het segment met carbogenated, standaardoptekenmodus aCSF verwarmd en op 32 ° C. Als alternatief kunnen segmenten worden op kamertemperatuur gehouden.
- Zoek en het centrum van de hersenen gebied van belang met behulp vaneen 10X lucht doelstelling (Nikon Plan Fluor 10X, NA 0,3; WD: 16 mm).
- Visualiseer individuele neuronen met behulp van een 40x nabij-infrarood (IR) water immersie objectief (Nikon APO 40XW; NA: 0,80; WD: 3,5 mm) aangesloten op de IR-differentieel interferentie contrast (DIC) optiek en een high-speed nabij-infrarood Charged Coupled Device (CCD) videocamera (Hamamatsu C-7500). Onder IR-DIC observatie, gezonde neuronen vertonen een gladde, lichtgrijze plasmamembraan.
- Vul een micropipet met een geschikte intracellulaire opnameoplossing. Voor de meeste toepassingen gebruiken we de volgende oplossing (in mM): 135 kalium gluconaat, 5 EGTA, 0,5 CaCl2, 2 MgCl2, 10 HEPES, 2 Mg-ATP, GTP en 0,1 (pH ingesteld op 7,25 met Tris base, osmolariteit aangepast tot 290 mOsm met sucrose). Opzetten van een whole-cell opname van een gevisualiseerd neuron.
4. Lokale toepassing van geneesmiddelen te Neuronen in Slices
- Trek een standaard patch clamp micropipet zoals hierboven beschreven. Gebruikeen pipet trekker zoals een Sutter P-97 dat twee identieke "zuster" tips uit hetzelfde stuk glas produceert is voordelig als multiple drug oplossingen worden gebruikt op dezelfde cel. Tipformaten dat een weerstand van ~ 5 MQ zouden hebben indien zij werden gevuld met het intracellulaire oplossing hierboven beschreven optimaal.
- Backfill de micropipet met een oplossing van verdund geneesmiddel in carbogenated, standaardoptekenmodus aCSF. Naar beneden Richt de tip, en flick de drug gevulde micropipet om eventuele luchtbellen gevangen in de kolom van de oplossing te verwijderen.
- Monteer het geneesmiddel gevulde micropipet in een pipethouder verbonden met een buis op een geschikte spanning uitwerpsysteem, zoals een Picospritzer III (General Valve Co.) De pipet houder wordt gemonteerd op een micromanipulator met dezelfde resolutie als manipulators gebruikt voor patch clamp-opname (bijvoorbeeld Sutter MP-285). Bovendien moet de manipulator mogelijk een diagonale beweging in en uit het segment. Manhandmatig uitwerpen druk 3 tot 4 keer in de micropipet om te bouwen voldoende druk achter de kolom van vloeistof.
- Met behulp van de micromanipulator controles, laat het medicijn pipet in de plak, terwijl het visualiseren van de tip onder IR-DIC optiek. Idealiter zou een visueel herkennen en midden een neuron worden geregistreerd uit, gevolgd door plaatsing van het geneesmiddel pipet bij de cel voorafgaand aan het verlagen van de opname micropipet in de plak. Positioneren van de drug pipet kan beweging van weefsel in de nabijheid van de opgenomen cel die de opname kunnen verstoren als het geneesmiddel pipet wordt gebracht nadat een gigaohm afdichting.
- IR met video, plaats het geneesmiddel micropipet op het bovenoppervlak van het weefsel slice. Voeren en een druk uitwerpen monitor 1) nabij de tip voor beweging van vuil over het uitwerpen, en 2) de micropipet tip op tekenen de punt verstopt of geblokkeerd. Als de tip verstopt is / verstopt, trek de pipette en vervang deze door een nieuwe.
- Diagonaal benaderen opgenomen cel van de top van het segment zodanig dat wanneer de laatste plaats, de punt van het geneesmiddel gevulde pipet 1) in hetzelfde brandpuntvlak (of iets onder) de geregistreerde cel en de punt van de registratie-elektrode en 2) 10 tot 40 urn van de cel opgenomen. Als de drug gevulde pipet boven de cel opgenomen, kan de kracht van de druk uitwerpen verstoren gigaohm afdichting.
- Noteer de gewenste cellulaire respons terwijl u de cel in spanning klem modus of stroomtang modus. We routinematig vastleggen acetylcholine en / of nicotine-opgewekt cellulaire stromen terwijl neuronen in spanningsklem modus. Hoewel druk uitwerpen kunnen handmatig worden geactiveerd wanneer een Picospritzer III, meer reproduceerbare resultaten verdient het aanbeveling de druk activeren uitwerpen met het meetsysteem (Axon Digidata 1440 en pClamp 10.3) met een digitale TTL pulse.
5. Controllingde Drug gevulde Micropipet met een piëzo-elektrische Vertaler
- Indien mogelijk dient het geneesmiddel gevulde pipethouder een eendimensionale piëzo vertaler (bijv. Piezojena PA-100 of Burleigh PZM-150) die in staat is het aanvaarden van een analoge ingangsspanning (weer van het acquisitiesysteem), die dan gemonteerd op de hoge-precisie micromanipulator (Sutter MP-285). Een piëzo-elektrisch vertaler is nuttig omdat de beweging van het geneesmiddel gevulde pipet in en uit het segment, zoals de timing en de snelheid van binnenkomst / uitgang, gemakkelijker worden gecontroleerd en gereproduceerd van experiment tot experiment. Bij het bestuderen nAChRs, de effecten van nicotine ongevoelig lekkage van het geneesmiddel gevulde pipet, moeten zij ooit voorkomen, worden geminimaliseerd wanneer de pipet wordt alleen verplaatst nabij de cel met een piëzo vertaler moment van uitwerpen druk.
- Met behulp van de handmatig bestuurde potentiometer op de piëzo-elektrische spanning regelversterker, kiest u het voltagezijn maximale waarde.
- Met de micromanipulator Plaats de drug gevulde pipet in het segment waar de pipet wordt de inhoud werpen op de gemaakte cel en trekken de pipet door handmatig reduceren van de spanning op nul piëzo spanning regelversterker.
- Met een analoog uitgangssignaal van de opname acquisitiesysteem Verplaats de drug gevulde pipet in de plak gedurende 250 msec vanaf 300 msec voordat de druk uitstoten TTL pulse optreedt. Trek de pipet gedurende 250 msec, beginnend 50 msec na de TTL signaal eindigt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In onze experimenten hebben we routinematig opnemen van dopamine (DA)-producerende neuronen van de ventrale tegmentale gebied (VTA) en de substantia nigra pars compacta (SNC). In voltage-clamp mode zal de druk toepassing van acetylcholine nicotine of deze cellen typisch resulteren in een snel, binnen kation stroom die piek bereikt binnen 100-200 msec (Figuur 1A-B). Verval van de stroom grotendeels bepaald door diffusie van het geneesmiddel uit de plaats van werking en of enzymen in het segment aanwezig zijn te metaboliseren van het geneesmiddel in een inactieve vorm. Bijvoorbeeld ACh wordt snel gehydrolyseerd door acetylcholinesterases die zich op het oppervlak van cellen in hersengebieden die rijk zijn aan DA neuronen 5. Dit resulteert in een snelle afbraak van de opgewekte stroom (Figuur 1A). In tegenstelling nicotine niet gehydrolyseerd en nicotine opgewekte stroom niet zo snel verval stromen (fig. 1B), waardoor het sterk ACTIV ACh geïnduceerdeaten en ongevoelig nAChRs 6.
Druk ejectie systeem kan de bestuurder het moment van de drukpuls variëren. Deze functie is nuttig bij het bestuderen nAChRs op het oppervlak van neuronen in hersencoupes, omdat zij de onderzoeker te bepalen of de maximum opgewekte stroom is bereikt in reactie op een puls van geneesmiddel. Bijvoorbeeld, de twee sporen in figuur 2 blijkt dat 250 msec van Drug Application (grijze spoor) al dan niet onthullen definitieve maximum opgewekte stroom, terwijl 1000 msec van Drug Application (zwarte trace) levert een duidelijk maximum stroom plus een steady -state desensibilisatie. Het oplossen van dergelijke "piek" stromen is cruciaal bij de bouw van een nauwkeurige concentratie-respons curve, of bij het bestuderen van nAChR desensibilisatie.
DA neuronen in het ventrale middenhersenen vaak vuren spontane actiepotentialen bij opname in acute hersenen plakjes 7, 8. α6 L9'S muizen, die exnAChRs druk die sterk reageren 10 tot 100-voudig lagere concentraties van nicotine ACh of 2, 9-11, vertonen verhoogde beweging in reactie op nicotine injecties. Om neuronale activiteit (actiepotentiaal afvuren) correleren met gedrag, is het nuttig om nicotine van toepassing op α6 L9'S DA neuronen opgenomen in de huidige-klem-modus. Kenmerkend zal lokale toepassing van nicotine (1 uM) aan α6 L9 da neuronen resulteren in een snelle en voorbijgaande versnelling van bakken die terug vervalt de basislijn binnen 30-40 sec 2 (Figuur 3, bovenste paneel). Dergelijke reacties op nicotine gemakkelijk meetbaar (figuur 3, onderste paneel) met geschikte analyse software (bijv. pClamp; Molecular Devices Corp.)
Experimenten in gekweekte cellen of Xenopus oöcyten met ectopisch tot expressie nAChRs genieten het voordeel dat een reeks concentraties van het geneesmiddel kan worden toegepast op elke gemeten cel 12. Inneuronen in hersencoupes, kenmerkend een concentratie-respons curve niet mogelijk en reacties op een concentratie van geneesmiddel worden vaak gerapporteerd 1. Echter, een medicijn gevulde pipet zoals beschreven in dit document herhaaldelijk worden gewijzigd om voor meerdere concentraties geneesmiddel worden toegepast op dezelfde opgenomen cel in de hersenen schijf 2, 8, 13, 14. Figuur 4 toont representatieve gegevens van een enkele opgenomen DA neuron die werd gestimuleerd met drie concentraties van ACh. De ervaring van de onderzoeker, in combinatie met een zeer stabiele micromanipulator houden van de drug gevulde pipet, zijn kritische factoren die leiden tot succes in dit type experiment. Bij succes, deze aanpak biedt waardevolle farmacologische informatie over inheemse nAChRs.
Neuronen in de hersenen plakjes, met inbegrip van ongekarakteriseerde celtypes of die aanwezig zijn in de hersenen gebieden met een heterogene populatie, worden vaak geclassificeerd met behulp van verschillende fundamentele elementenctrophysiological en / of morfologische maatregelen 15. Bijvoorbeeld, de expressie van I h stroom rust membraanpotentiaal, spontane stooksnelheid en celgrootte typisch maatstaven voor DA neuronen 2, 7, 8, 16, 17 karakteriseren. Met deze methode, is het ook mogelijk te karakteriseren neuronen op basis van hun respons op lokaal toegepast nicotine ACh of 18, 19. Bijvoorbeeld, de superior colliculus (SC) is een heterogene en relatief ongekarakteriseerde hersengebied met extreem hoge expressie van verschillende nAChRs, inclusief die α6 subunits 20 bevatten. In hersenplakjes van α6 L9'S muizen namen we van verschillende SC neuronen en toegepast nicotine (1 uM) met druk uitwerpen met nicotine gevulde pipet. Twee verschillende types respons waargenomen: 1) activering van remmende postsynaptische stroom (iPSCs) (Figuur 5, Type I reacties) en 2) grote stromen binnen kation enkele inductieen van excitatoire postsynaptische stroom (EPSCs) (Figuur 5, Type II reacties).
Het gebruik van een piëzo vertaler biedt het voordeel dat het geneesmiddel gevulde pipet kan worden gehouden in een stationaire positie ten minste 100 urn afstand van de opgeslagen cel totdat het snel naast de cel de druk uitwerpen verplaatst. Dit is nuttig omdat de pipet beweging kan worden geautomatiseerd en is consistent van cel naar cel en op dag tot dag. Het is ook nuttig bij hoge concentraties van nicotine (die ongevoelig nAChRs) worden toegepast op de cel opgenomen, zoals minimaliseert het effect van nicotine lekkage van het geneesmiddel gevulde tube moet het ooit bij. Om de samenhang van nAChR stromingen aan te tonen bij het gebruik van een piëzo-elektrisch vertaler, noteerden we van VTA DA neuronen in de hersenen plakjes van α6 L9'S muizen. Figuur 6 toont opeenvolgende reacties in hetzelfde α6 L9'S VTA DA neuron in reactie op concentraties van nicotine die sterk activeren overgevoelig α6 * nAChRs (1 uM: Figuur 6A, 10 uM: Figuur 6B). Als men continu lekken op de gemaakte cel, zou deze concentraties van nicotine worden verwacht nAChRs ongevoelig op het celoppervlak, en de tweede reactie zou verzwakt ten opzichte van de eerste respons.
Figuur 1. Representative nAChR responsen in neuronen DA. A. Een DA neuron in een WT muizenhersenen slice was voltage geklemd, gevolgd door plaatselijke toepassing van ACh (100 uM) via druk ejectie (250 msec) met een tweede geneesmiddel gevulde pipet. Scale bar: 100 pA, 3 sec B.. Experiment werd uitgevoerd zoals beschreven in A, behalve dat nicotine (100 uM) werd op de DA neuron. Scale bar: 60 pA, 3 sec.
Figuur 2. Het oplossen van piekstromen door het variëren van Drug Application tijd. Een DA neuron in een WT muizenhersenen slice was voltage geklemd, gevolgd door plaatselijke toepassing van ACh (100 uM). Twee reacties worden getoond voor dezelfde opgenomen cel, waar ACh werd de drug gevulde pipet uitgeworpen 250 msec (grijs trace) of 1000 msec (zwarte trace). Scale bar: 50 Pa.
Figuur 3. Studeren actiepotentiaal afvuren na lokale Drug Application. Een DA neuron in een muis α6 L9 brein plakje werd opgenomen in stroomklem (I = 0) mode, en spontane actiepotentialen waargenomen. Nicotine (1 uM) werd aangebracht met druk ejectie (250 msec), en veranderingen in actiepotentiaal vuren en rust membraanpotentiaal zijnwaargenomen. Met pClamp software (drempel search) werd momentane stooksnelheid afgeleid en is getoond in het onderste paneel.
Figuur 4. Meerdere geneesmiddel applicaties om dezelfde geregistreerd cel. Een DA neuron in muis een α6 L9 de hersenen slice werd opgenomen in spanningsklem modus. Een geneesmiddel gevulde pipet werd gebruikt om lokaal toepassen ACh (1 uM, 250 msec). En tegelijkertijd opnemen van de cel werd het geneesmiddel gevulde pipet uit de plak en vervangen door een andere pipet gevuld met 3 uM ACh. Een antwoord op 3 uM ACh opgenomen, en het proces werd herhaald voor 10 uM ACh. Scale bar: 100 pA, 1,5 sec.
Figuur 5. Classificatie van neuronen door nAChR reactie type.Een groep superior colliculus (SC) neuronen in een muis α6 L9 brein slice was voltage geklemd, gevolgd door plaatselijke toepassing van nicotine (1 uM) via druk uitwerpen. Type I neuronen verhoogd iPSCs tentoongesteld na nicotine toepassing. Type II neuronen grote innerlijke stromen en verhoogde EPSCs tentoongesteld in reactie op nicotine toepassing. Scale bar: 20 pA, 3 sec.
Figuur 6. Piëzo-elektrische vertaler biedt consistentie en beschermt tegen drugs lekkage. A. Een VTA DA neuron in de hersenen slice van de muis een α6 L9'S werd opgenomen in spanningsklem wijze tijdens het aanbrengen van 1 uM nicotine. De nicotine gevulde pipet werd gemanoeuvreerd uiteindelijke positie voordat de druk uitwerpen en teruggetrokken na het uitwerpen met behulp van een piëzo-elektrisch vertaler. Een tweede reactie werd opgenomen 2 min na de fiRST om aan te tonen dat er geen nAChR desensibilisatie had plaatsgevonden. Scale bar: 100 pA, 8 sec B.. nAChR reacties in α6 L9'S VTA DA neuronen werden geregistreerd als in A, maar 10 uM nicotine toegepast. Scale bar: 100 pA, 8 sec.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De methode die in dit artikel is in grote lijnen bruikbaar voor het bestuderen van ligand-gated ionkanalen functie in de hersenen slice preparaat. Er zijn echter een aantal factoren die een belangrijke invloed op de kwaliteit en reproduceerbaarheid van experimentele gegevens die voortkomen uit het gebruik van deze methode. Bijvoorbeeld opgeroepen stromen erg gevoelig voor de diameter van de punt van het geneesmiddel gevulde pipet. Kleine tips zal leiden tot moeite met het uitwerpen van de drug oplossing, en grote tips met een lage weerstand zal meer kans om de gigaohm afdichting tussen de opgenomen cel en de registratie-elektrode verstoren. Een andere beperking van de gepresenteerde methode is dat cellen in 10 urn van de cel opgenomen kan worden blootgesteld aan drugs van het medicijn gevulde pipet die hun activiteit kunnen verhogen en zou kunnen beïnvloeden de opgenomen cel.
Bij toepassing van geneesmiddel aan een cel meerdere keren met hetzelfde geneesmiddel pipet, is het cruciaal dat de pipet weer inprecies dezelfde positie in het segment voor elke toepassing. Zelfs kleine afwijkingen (bijvoorbeeld 1-2 urn) in plaatsing van een antwoord op de volgende zal vaak resulteren in aanzienlijke verschillen in de waargenomen piekrespons. Een programmeerbare piëzo vertaler (zoals hierboven beschreven) of robot micromanipulator is voordelig voor het positioneren van de drug pipet. Een andere belangrijke overweging is de diepte van de cel opgenomen binnen het segment. Drug vaak weg te diffunderen van een cel op het oppervlak van de plak sneller, terwijl geneesmiddel kan worden "opgesloten" in het segment wanneer uitgeworpen op een cel die diep binnen de plak. Dit is vaak een belangrijke overweging bij de toepassing van nicotine, die gemakkelijk ongevoelig nAChRs wanneer de blootstelling tijden zijn langer dan 100 tot 200 msec. Ook de druk (in psi) die wordt uitgestoten in de drug gevulde pipet en de hoeveelheid tijd die druk wordt uitgeoefend (figuur 2) zijn belangrijke overwegingen voor interpretatie nAChR huidige data. We routinematig gebruik 10 tot 12 psi druk, en we vinden dat 250 msec voldoende tijd is om nAChR piekstromen op te lossen zonder het veroorzaken van vergaande receptor desensitisatie.
Een belangrijk voordeel van de werkwijze beschrijven we de mogelijkheid uit te wisselen drug gevulde pipetten tips zodat meerdere geneesmiddelconcentraties kan op dezelfde neuron. Belangrijke overwegingen bij het uitwisselen van pipetten zijn 1) variatie in pipetpunt locatie van een concentratie naar de volgende, en 2) de variabiliteit in pipetpunt diameter. Pipetpunt locatie kan meestal zorgvuldig gecontroleerd met een hoge resolutie nabij-IR videocamera en een nauwkeurige micromanipulator. Variabiliteit in pipetpunt diameter kan worden bestuurd door middel van "zuster pipetten" waar mogelijk, en door een pipet trekker die micropipetten trekt met een hoge nauwkeurigheid en consistentie.
Over het geheel genomen de drug gevulde pipet methode beschreven in dit document is een zeer nuttige aanpak bij studying inheemse nAChRs uitgedrukt in neuronen gevonden in acute hersenen plakjes. Naast bruikbaar voor het bestuderen van de neurobiologie van nicotineafhankelijkheid en nicotine cholinergische biologie deze methode is gemakkelijk toepasbaar op andere ligand-gated ionenkanalen. 5-HT3-receptoren, GABA-receptoren, en glycine receptoren verschillende andere "cys-loop" receptoren die kunnen worden onderzocht met behulp van deze technieken 21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health (NIH) subsidie DA030396. Dankzij de leden van de Drenan lab voor nuttige discussie en kritiek op het manuscript. Speciale dank aan Mi Ran Kim voor technische bijstand en Jonathan Thomas Ting voor advies met betrekking tot volwassen hersenen van muizen plakjes.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| N-Methyl D-glucamine | Sigma | M2004 | |
| KCl | Sigma | P3911 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S9638 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| glucose | Sigma | G5767 | |
| Na+ ascorbate | Sigma | A4034 | |
| thiourea | Sigma | T8656 | |
| Na+ pyruvate | Sigma | P2256 | |
| MgSO4∙7H2O | Sigma | 230391 | |
| CaCl2∙2H20 | Sigma | 223506 | |
| NaCl | Sigma | S9625 | |
| Na+ pentobarbital | Vortech Pharmaceuticals | 76351315 | |
| potassium gluconate | Sigma | G4500 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Mg-ATP | Sigma | A9187 | |
| GTP | Sigma | G8877 | |
| DSK-Zero 1 Vibrating slicer | Ted Pella, Inc. | ||
| P-97 Flaming/Brown micropipette puller | Sutter | ||
| RC-27 Recording chamber | Warner | ||
| TC-344B Perfusion heater controller | Warner | 640101 | |
| SH-27B Solution heater | Warner | 640102 | |
| Nikon FN-1 | Nikon | ||
| C-7500 CCD Video camera | Hamamatsu | ||
| Picospritzer III | General Valve Co. | ||
| MP-285 Micromanipulator | Sutter | ||
| PA-100 Piez–lectric translator | piezosystem jena, Inc. | ||
| 12V40 piezo amplifier | piezosystem jena, Inc. | ||
| Axopatch 200B | Molecular Devices Corp. | ||
| Digidata 1440A | Molecular Devices Corp. |
References
- Tapper, A. R. Nicotine activation of ?4* receptors: sufficient for reward, tolerance, and sensitization. Science. 306, 1029-1032 (2004).
- Drenan, R. M. In vivo activation of midbrain dopamine neurons via sensitized, high-affinity ?6* nicotinic acetylcholine receptors. Neuron. 60, 123-136 (2008).
- Zhao, S. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nat. Methods. 8, 745-7452 (2011).
- Peca, J. Shank3 mutant mice display autistic-like behaviours and striatal dysfunction. Nature. 472, 437-442 (2011).
- Zhou, F. M., Wilson, C. J., Dani, J. A. Cholinergic interneuron characteristics and nicotinic properties in the striatum. J. Neurobiol. 53, 590-605 (2002).
- Pidoplichko, V. I. Nicotine activates and desensitizes midbrain dopamine neurons. Nature. 390, 401-404 (1997).
- Nashmi, R. Chronic nicotine cell specifically upregulates functional ?4* nicotinic receptors: basis for both tolerance in midbrain and enhanced long-term potentiation in perforant path. J. Neurosci. 27, 8202-8218 (2007).
- Xiao, C. Chronic nicotine selectively enhances ?4?2* nicotinic acetylcholine receptors in the nigrostriatal dopamine pathway. J. Neurosci. 29, 12428-12439 (2009).
- Cohen, B. N. Nicotinic cholinergic mechanisms causing elevated dopamine release and abnormal locomotor behavior. Neuroscience. 200, 31-41 (2012).
- Drenan, R. M. Cholinergic modulation of locomotion and striatal dopamine release is mediated by α6β4* nicotinic acetylcholine receptors. J. Neurosci. 30, 9877-9889 (2010).
- Grady, S. R. Structural differences determine the relative selectivity of nicotinic compounds for native α4β2*-, α6β2*-, α3β4*- and α7-nicotine acetylcholine receptors. Neuropharmacology. 58, 1054-1066 (2010).
- Drenan, R. M. Subcellular trafficking, pentameric assembly, and subunit stoichiometry of neuronal nicotinic acetylcholine receptors containing fluorescently labeled α6 and β3 subunits. Mol. Pharmacol. 73, 27-41 (2008).
- Keath, J. R. Differential modulation by nicotine of substantia nigra versus ventral tegmental area dopamine neurons. J. Neurophysiol. 98, 3388-3396 (2007).
- Mansvelder, H. D. Bupropion inhibits the cellular effects of nicotine in the ventral tegmental area. Biochem. Pharmacol. 74, 1283-1291 (2007).
- Lee, S. The largest group of superficial neocortical GABAergic interneurons expresses ionotropic serotonin receptors. J. Neurosci. 30, 16796-16808 (2010).
- Margolis, E. B. Reliability in the identification of midbrain dopamine neurons. PLoS One. 5, e15222 (2010).
- Margolis, E. B. The ventral tegmental area revisited: is there an electrophysiological marker for dopaminergic neurons. J. Physiol. 577 (Pt 3), 907-924 (2006).
- Couey, J. J. Distributed network actions by nicotine increase the threshold for spike-timing-dependent plasticity in prefrontal cortex. Neuron. 54, 73-87 (2007).
- Yang, K. Distinctive nicotinic acetylcholine receptor functional phenotypes of rat ventral tegmental area dopaminergic neurons. J. Physiol. 587, 345-361 (2009).
- Endo, T. Nicotinic acetylcholine receptor subtypes involved in facilitation of GABAergic inhibition in mouse superficial superior colliculus. J. Neurophysiol. 94, 3893-3902 (2005).
- Bouzat, C. New insights into the structural bases of activation of Cys-loop receptors. J. Physiol. Paris. , (2011).
