本稿では、急性単離した脳スライスのニューロンにおけるリガンド依存性イオンチャネルの機能を研究するための有用な方法を説明します。このメソッドは、標準パッチクランプ法を用いて記録された神経細胞への薬物のローカルアプリケーションのための薬剤を充填したマイクロピペットの使用を含む。
タバコの使用は、がん、心臓病、肺気腫、脳卒中を含む多数の健康上の問題につながる。喫煙への依存症は、中枢神経系全体のニコチン性アセチルコリン受容体(nAChRs)ニコチンの生物物理学的および細胞作用に由来する流行精神神経疾患である。ニコチン中毒に関連する脳領域に存在するさまざまなnAChRをサブタイプを理解することは、主要な優先事項です。
このような全細胞パッチクランプまたは二電極電圧クランプ記録として電気生理学的手法を採用した実験では、目的のnAChRsの薬理学的特性評価のために有用である。このような哺乳動物組織培養細胞やアフリカツメガエル卵母としてnAChRsを発現する細胞は、物理的に分離されているので、簡単に現代の薬理学のツールを用いて研究されている。標的受容体が既に知られていた場合は特に多くの進歩は、これらの技術を用いて製造されていますND異所性発現は容易に達成された。急性実験用マウスまたはラットから採取した脳スライス内のニューロンに:多くの場合、しかし、それは彼らのネイティブ環境でnAChRsを検討する必要がある。例えば、α4L9'Aマウス1およびα6L9のMICE 2として"過敏" nAChRをサブユニットを発現するマウスは、特定のnAChRをサブユニットのそれぞれの機能発現に基づいて神経細胞の明確な識別を可能にします。脳スライスのニューロンからホールセルパッチクランプ記録を日常的に熟練した電気生理学者によって行われていますが、局所的に、アセチルコリンや脳スライス内に記録された細胞にニコチンなどの薬物を適用するために挑戦している。 superfusateに薬の希釈(浴アプリケーション)は、急速に可逆的ではなく、U字管のシステムを容易に脳スライスで動作するように適合されていない。
本稿では、急速に大人メートルで記録ニューロンにnAChRを活性化薬を適用するための方法を説明します脳スライスをウーズ。標準細胞全体の録音は、スライスのニューロンから作られており、興味のある薬剤を充填した第二マイクロピペットは記録セルに近い位置に操縦される。薬剤を充填したピペットに加圧された空気または不活性窒素の注入は、記録されたセル上にピペットから吐出される薬液の少量を引き起こす。この方法を使用して、nAChRを媒介電流は、ミリ秒の精度で解決することができるようになりました。医薬品申請時間は簡単に変えることができ、薬剤を充填したピペットは、単一ニューロンのために作成される濃度応答曲線を可能にする、新しいピペットで後退して交換することができます。 nAChRを神経生物学の文脈で説明しているが、この技術は、脳スライスのニューロンにおけるリガンド依存性イオンチャネルや受容体の多くの種類を研究するための有用なはずである。
本論文で提示した方法は、脳スライス標本におけるリガンド依存性イオンチャネルの機能を研究するために広く便利です。しかし、かなりの実験データは、このメソッドを利用した結果としての品質と再現性に影響を与える要因がいくつかあります。例えば、誘発電流は、薬剤を充填したピペットの先端の直径に非常に敏感です。小さなヒントを吐出する薬液の難しさの原因となり、低抵抗?…
この作品は、国立衛生研究所(NIH)の助成DA030396によってサポートされていました。役立つ議論と原稿の批評のためにDrenanラボのメンバーに感謝します。 MIへの特別な感謝は成体マウスの脳スライスに関する助言のための技術支援とジョナサン·トーマスティンのために金を実行しました。
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
N-Methyl D-glucamine | Sigma | M2004 |
KCl | Sigma | P3911 |
NaH2PO4 | Sigma | S9638 |
NaHCO3 | Sigma | S6014 |
HEPES | Sigma | H3375 |
glucose | Sigma | G5767 |
Na+ ascorbate | Sigma | A4034 |
thiourea | Sigma | T8656 |
Na+ pyruvate | Sigma | P2256 |
MgSO4•7H2O | Sigma | 230391 |
CaCl2•2H20 | Sigma | 223506 |
NaCl | Sigma | S9625 |
Na+ pentobarbital | Vortech Pharmaceuticals | 76351315 |
potassium gluconate | Sigma | G4500 |
EGTA | Sigma | E3889 |
Mg-ATP | Sigma | A9187 |
GTP | Sigma | G8877 |
DSK-Zero 1 Vibrating slicer | Ted Pella, Inc. | |
P-97 Flaming/Brown micropipette puller | Sutter | |
RC-27 Recording chamber | Warner | |
TC-344B Perfusion heater controller | Warner | 640101 |
SH-27B Solution heater | Warner | 640102 |
Nikon FN-1 | Nikon | |
C-7500 CCD Video camera | Hamamatsu | |
Picospritzer III | General Valve Co. | |
MP-285 Micromanipulator | Sutter | |
PA-100 Piezoelectric translator | piezosystem jena, Inc. | |
12V40 piezo amplifier | piezosystem jena, Inc. | |
Axopatch 200B | Molecular Devices Corp. | |
Digidata 1440A | Molecular Devices Corp. |