Neste trabalho, nós descrevemos um método útil para o estudo ligante fechado função de canal iônico em neurônios de fatias de cérebro de forma aguda isolados. Este método envolve a utilização de uma micropipeta cheia de medicamento para aplicação local de medicamentos para os neurónios gravados utilizando técnicas padrão de fixação de patch.
O uso do tabaco leva a inúmeros problemas de saúde, incluindo câncer, doenças cardíacas, enfisema e infarto. Vício de fumar cigarro é uma doença prevalente neuropsiquiátrica que decorre das ações biofísicas e celulares da nicotina sobre os receptores nicotínicos de acetilcolina (nAChRs) em todo o sistema nervoso central. Compreender os subtipos nAChR vários que existem em áreas do cérebro importantes para a dependência da nicotina é uma das prioridades.
Experimentos que empregam técnicas de eletrofisiologia, como célula inteira braçadeira patch ou dois eletrodos gravações braçadeira de tensão são úteis para a caracterização farmacológica de nAChRs de interesse. Células que expressam nAChRs, tais como as células do tecido de mamífero de cultura ou oócitos de Xenopus laevis, são fisicamente isoladas e são, portanto, facilmente estudado usando as ferramentas da farmacologia moderna. Muito progresso foi feito utilizando essas técnicas, particularmente quando o receptor alvo, já era conhecido umª expressão ectópica foi facilmente alcançado. Muitas vezes, no entanto, é necessário estudar nAChRs no seu ambiente nativo: em neurónios dentro fatias de cérebro de forma aguda colhidas a partir de ratos de laboratório ou ratos. Por exemplo, os ratos que expressa "hipersensíveis" subunidades nAChR tais como α4 ratinhos e ratos L9'A um α6 L9 é 2, permitir uma identificação inequívoca dos neurónios com base na sua expressão funcional de uma subunidade de nAChR específico. Apesar de célula inteira gravações remendo da braçadeira de neurônios em fatias de cérebro é feito rotineiramente pelo eletrofisiologista hábil, é um desafio para aplicar localmente drogas como a nicotina ou acetilcolina para a célula gravado dentro de uma fatia do cérebro. A diluição de drogas para os superfusate (aplicação do banho) não é rapidamente reversível, e tubo em U de sistemas não são facilmente adaptados para funcionar com fatias de cérebro.
Neste artigo, descrevemos um método para rapidamente aplicar nAChR drogas ativadoras de neurônios registrados em adultos mOuse fatias de cérebro. Padrão de célula inteira gravações são feitas a partir de neurónios em fatias, e uma segunda micropipeta cheia com uma droga de interesse é manipulado para a posição perto da célula registada. Uma injecção de ar comprimido ou de azoto inerte para a pipeta cheia de medicamento provoca uma pequena quantidade de solução de fármaco a ser ejectada a partir da pipeta da célula registada. Usando este método, nAChR mediadas correntes podem ser resolvidos com a precisão de milissegundos. Tempos de aplicação de drogas pode ser facilmente variada, e a pipeta cheia de medicamento pode ser recolhido e substituído por uma nova pipeta, permitindo curvas concentração-resposta para ser criado por um único neurónio. Embora tenha sido descrita no contexto de nAChR neurobiologia, esta técnica deverá ser útil para o estudo de muitos tipos de canais iónicos dependentes do ligando ou de receptores nos neurónios de fatias de cérebro.
O método apresentado neste artigo é de grande utilidade para o estudo de ligante fechado função de canal iônico em preparações fatia do cérebro. No entanto, há uma série de factores que irão afectar significativamente a qualidade e reprodutibilidade dos dados experimentais, que resultam da utilização deste método. Por exemplo, as correntes evocadas são muito sensíveis ao diâmetro da ponta da pipeta e recheada de drogas. Pequenas dicas irá causar dificuldade com esvaziando a solução de drogas, e dicas…
Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health (NIH) concessão DA030396. Graças aos membros do laboratório Drenan para discussão útil e crítica do manuscrito. Agradecimentos especiais a Mi Ran Kim para assistência técnica e Thomas Jonathan Ting para aconselhamento sobre fatias de cérebro de rato adulto.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
N-Methyl D-glucamine | Sigma | M2004 |
KCl | Sigma | P3911 |
NaH2PO4 | Sigma | S9638 |
NaHCO3 | Sigma | S6014 |
HEPES | Sigma | H3375 |
glucose | Sigma | G5767 |
Na+ ascorbate | Sigma | A4034 |
thiourea | Sigma | T8656 |
Na+ pyruvate | Sigma | P2256 |
MgSO4•7H2O | Sigma | 230391 |
CaCl2•2H20 | Sigma | 223506 |
NaCl | Sigma | S9625 |
Na+ pentobarbital | Vortech Pharmaceuticals | 76351315 |
potassium gluconate | Sigma | G4500 |
EGTA | Sigma | E3889 |
Mg-ATP | Sigma | A9187 |
GTP | Sigma | G8877 |
DSK-Zero 1 Vibrating slicer | Ted Pella, Inc. | |
P-97 Flaming/Brown micropipette puller | Sutter | |
RC-27 Recording chamber | Warner | |
TC-344B Perfusion heater controller | Warner | 640101 |
SH-27B Solution heater | Warner | 640102 |
Nikon FN-1 | Nikon | |
C-7500 CCD Video camera | Hamamatsu | |
Picospritzer III | General Valve Co. | |
MP-285 Micromanipulator | Sutter | |
PA-100 Piezoelectric translator | piezosystem jena, Inc. | |
12V40 piezo amplifier | piezosystem jena, Inc. | |
Axopatch 200B | Molecular Devices Corp. | |
Digidata 1440A | Molecular Devices Corp. |