Summary
I detta dokument beskriver vi en användbar metod för att studera ligand-gated funktion jonkanal i nervceller i akut isolerade hjärnsnitt. Denna metod innefattar användning av en drog-fyllda mikropipett för lokal applicering av läkemedel till neuroner som spelats in med standardtekniker patch clamp.
Abstract
Tobaksbruk leder till många hälsoproblem, inklusive cancer, hjärtsjukdomar, emfysem och stroke. Beroende av cigarettrökning är en utbredd neuropsykiatrisk störning som härrör från de biofysiska och cellulära åtgärder nikotin på nikotinacetylkolinreceptorer (nAChR) hela det centrala nervsystemet. Förstå olika nAChR subtyper som finns i områden i hjärnan som är relevanta för nikotinberoende är en viktig prioritering.
Experiment som använder elektrofysiologi tekniker såsom hela celler patch clamp eller två-elektrodspänningen inspelningar klämma är användbara för farmakologisk karakteristik av nAChR av intresse. Celler som uttrycker nAChR, såsom däggdjursceller vävnadsodlingskolvar eller Xenopus laevis oocyter, är fysiskt isolerade och är därför lätt studeras med hjälp av verktygen i modern farmakologi. Stora framsteg har gjorts med användning av dessa tekniker, särskilt när målreceptorn var redan känt ennd ektopisk uttryck lätt att uppnå. Ofta är det dock nödvändigt att studera nAChR i sin naturliga miljö: i nervceller i hjärnan skivor akut skördas från laboratorium möss eller råttor. Till exempel möss som uttrycker "överkänsliga" nAChR subenheter såsom α4 L9'A möss 1 och α6 L9'S möss 2, möjliggöra entydig identifikation av neuroner baserat på deras funktionella uttryck av en specifik nAChR subenhet. Även hel-cell patch clamp inspelningar från nervceller i hjärnan skivor rutinmässigt görs av skickliga electrophysiologist, är det svårt att lokalt tillämpa läkemedel såsom acetylkolin eller nikotin till det inspelade cell inom en hjärna skiva. Utspädning av läkemedel i superfusate (bad ansökan) är inte snabbt reversibla, och U-rör-system är inte lätt anpassas för att arbeta med hjärnsnitt.
I detta dokument beskriver vi en metod för att snabbt applicera nAChR-aktiverande läkemedel till nervceller som spelats in i vuxen mOuse hjärnsnitt. Standard helcells-inspelningar görs från neuroner i skivor, och en andra mikropipett fylld med ett läkemedel av intresse manövreras i läge nära den inspelade cellen. En injektion av trycksatt luft eller inert kväve i läkemedels-fyllda pipett orsakar en liten mängd läkemedel lösning som skall sprutas ut från pipetten på det inspelade cellen. Med denna metod, nAChR-medierade strömmar kan lösas med millisekund noggrannhet. Drug Application gånger kan lätt varieras, och läkemedlet fyllda pipett kan dras tillbaka och ersättas med en ny pipett, vilket möjliggör koncentration-respons-kurvor skapas för en enda neuron. Även beskrivet i samband med nAChR neurobiologi, bör denna teknik vara användbar för att studera många typer av ligandstyrda jonkanaler eller receptorer i neuroner från hjärnsnitt.
Protocol
1. Beredning av lösningar för Brain skiva Förberedelser och elektrofysiologi
- Lösningar för framställning av hjärnsnitt har tidigare beskrivits 3, 4. Framställning av N-metyl-D-glukamin (NMDG)-baserad skärning och återvinning lösning med följande sammansättning (i mM): 93 N-metyl-D-glukamin, 2,5 KCl, 1,2 NaH 2 PO 4, 30 NaHCOs 3, 20 HEPES, 25 glukos, 5 Na + askorbat, 2 tiourea, 3 Na + pyruvat, 10 MgSO 4 • 7H 2 O, 0,5 CaCl 2 • 2H 2 O. Justera till 300-310 mOsm med NMDG. Justera pH-värdet till 7,3-7,4 med 10 N HCl.
- Lös MgSO 4 • 7H 2 O och CaCl 2 • 2H 2 O i Millipore vatten till 2 M stamlösningar av varje.
- Väg ut andra komponenter i angiven ordning och lägga till en mätkolv delvis fylld med Millipore vatten under omrörning för upplösning. När allt är till, fyllmätkolv med Millipore vatten.
- Mät pH och justera med 10 N HCl.
- Mät osmolaritet och justera med NMDG vid behov.
- Förbered HEPES innehar artificiell cerebrospinalvätska (aCSF) med följande sammansättning (i mM): 92 NaCI, 2,5 KCl, 1,2 NaH 2 PO 4, 30 NaHCOs 3, 20 HEPES, 25 glukos, 5 Na + askorbat, 2 tiourea, 3 Na + pyruvat, 2 MgSO 4 • 7H 2 O, 2 CaCl 2 • 2H 2 O. Justera till 300-310 mOsm med sackaros. Justera pH till 7,3-7,4 med 1 N HCl eller NaOH.
- Väg ut komponenter i angiven ordning och lägga till en mätkolv delvis fylld med Millipore vatten under omrörning för upplösning. När allt är till, fyll mätkolv med Millipore vatten.
- Mät pH och justera med NaOH eller HCl vid behov.
- Mät osmolariteten och justera med sackaros vid behov.
- Bered standard aCSF inspelning lösning med följande sammansättning (i mM): 124 NaCl, 2,5 KCl, 1,2 NaH 2 PO 4, 24 NaHCOs 3, 12,5 glukos, 2 MgSO 4 • 7H 2 O, 2 CaCb 2 • 2H 2 O. Justera till 300-310 mOsm med sackaros. Justera pH till 7,3-7,4 med 1 N HCl eller NaOH.
2. Beredning av akut hjärnan skivor
- Brain skiva skärning och återvinning görs som tidigare beskrivits 3, 4. Bubble två kristall rätter fyllda med NMDG återhämtning lösning med 95% syre / 5% CO 2 gas (karbogen), en maträtt på is, den andra vid 33 ° C.
- Bubblan en kristall skålen fylld med HEPES håller aCSF med karbogen vid rumstemperatur.
- Söva vuxen mus (i åldern 2 till 12 månader) med Na + pentobarbital (200 mg / kg, ip). Fortsätt med proceduren när djuret har inget svar på en tå-nypa.
- Om det behövs, skär ett prov svans vävnad för senare genotypning av djuret.
- Öppna brösthålan, exponera hjärtat och klämma nedåtgående aorta. Sarga det högra förmaket.
- Transkardiellt perfundera djur med 5-10 ml 0-4 ° C NMDG-recovery-lösning.
- Halshugga djur, ta bort hjärnan och placera den i 4 ° C NMDG-recovery-lösning under 1 minut.
- På en is-kyld metallplatta, trimma hjärnan i önskad riktning (koronalt, parasagittal, horisontella, etc.) för att inkludera det intressanta området.
- Fäst hjärnan blocket med superlim till den torra stadiet ytan av en vibrerande skärorganet (DSK-Zero 1, Dosaka), dränka hjärnan blocket 4 ° C NMDG-återhämtning lösning, och kontinuerligt bubbla lösningen med karbogen.
- Skär skivor av hjärnan området av intresse. Snittjocklek är 200-400 nm, beroende på den specifika hjärnan intresseområde, djur ålder, och experimentera som ska utföras.
- Omedelbart efter styckning, carbogenated inkubera önskade skivor i, 33 ° C NMDG-återhämtning Solutipå för exakt 12 minuter, sedan överföra till carbogenated, HEPES rumstemperatur håller lösning för en inledande period på 60 minuter. Efter denna 60 minuters inkubation, kan skivor användas för inspelning. Skivor hålls i HEPES håller lösning hela dagen tills de används för inspelning.
3. Patch Clamp Inspelning från neuroner i hjärnan skivor
- Dra en vanlig lapp mikropipett med en programmerbar Flaming-Brown avdragare (Sutter P-97 eller motsvarande vertikala avdragare). Pipetter som är optimala för giga-ohm tätning bildas har typiskt en resistans av 4-6 MQ
- Överför en skiva till inspelningen kammaren (RC-27L, Warner Instruments) på scenen av en upprätt mikroskop (Nikon FN-1). Kontinuerligt superfuse (1,5 - 2,0 ml / min) segmentet med carbogenated, standard inspelning aCSF värms och hålls vid 32 ° C. Alternativt kan skivor hållas vid rumstemperatur.
- Leta reda på och mitt i hjärnan intresseområde meden 10X luft mål (Nikon Plan Fluor 10X, NA 0,3, WD: 16 mm).
- Visualisera enskilda nervceller med hjälp av en 40X nära infraröd (IR) objektiv nedsänkning i vatten (Nikon APO 40XW, NA: 0,80; WD: 3,5 mm) är ansluten till IR-differential interferens kontrast (DIC) optik och en snabb nära infraröd ut coupled device (CCD) videokamera (Hamamatsu C-7500). Enligt IR-DIC observation, friska nervceller uppvisar en jämn, ljusgrå plasmamembranet.
- Fyll en mikropipett med en lämplig intracellulär inspelning lösning. För de flesta tillämpningar, använder vi följande lösning (i mM): 135 kaliumglukonat, 5 EGTA, 0,5 CaClj 2, 2 MgCla 2, 10 HEPES, 2 Mg-ATP, och 0,1 GTP (pH justerat till 7,25 med Tris-bas, osmolaritet justerades till 290 mOsm med sackaros). Upprätta en hel-cell inspelning från en visualiserad neuron.
4. Lokal applicering av läkemedel till nervceller i skivor
- Dra en vanlig mikropipett patch clamp såsom beskrivits ovan. Användaen pipett avdragare såsom en Sutter P-97 som producerar två identiska "syster" tips från samma glasbit är fördelaktig när flera läkemedelslösningar skall användas på samma cell. Tips storlekar som skulle ha ett motstånd på ~ 5 Mohm om de fylldes med den intracellulära lösningen som beskrivs ovan är optimala.
- Återfyllning mikropipetten med en lösning av läkemedel i utspädd carbogenated, vanlig inspelning aCSF. Rikta nedåt och bläddra drogen fyllda mikropipett för att ta bort eventuella luftbubblor instängda i kolumnen lösning.
- Montera läkemedlet fyllda mikropipett i en pipetthållare förbunden med slang till ett lämpligt tryck utmatning system, såsom en Picospritzer III (General Valve Co). Den pipetthållare ska monteras på en mikromanipulator med samma upplösning som manipulatorer vanligen används för patch clamp inspelning (t.ex. Sutter MP-285). Dessutom bör manipulatorn medger diagonal rörelse in i och ut ur skivan. Människanellt mata tryck 3 till 4 gånger i mikropipett för att bygga upp tillräckligt tryck bakom vätskepelare.
- Använda mikromanipulator kontroller sänker drogen pipetten i segmentet samtidigt visualisera spetsen under IR-DIC optik. Helst ska man identifiera visuellt och centrum en neuron som ska spelas in från, följt av placering av läkemedlet pipetten nära cellen innan sänka inspelningen mikropipett i segmentet. Placering av drogen pipetten kan orsaka förflyttning av vävnad i närheten av den inspelade cellen som kan störa inspelningen om läkemedlet pipetten förs i läge efter att ha etablerat en gigaohm tätning.
- Med IR video placera läkemedlet mikropipett på den övre ytan av vävnaden skiva. Kör ett tryck utstötning och monitor 1) i närheten av spetsen för förflyttning av skräp i samband med utmatning och 2) mikropipetten spets för eventuella tecken på att spetsen är tilltäppt eller blockerad. Om spetsen är blockerad / igensatt, dra tillbaka pipette och ersätta den med en ny.
- Närma inspelade cellen diagonalt från toppen av skivan så att när den är i slutläge, är spetsen av läkemedlet fyllda pipett 1) i samma fokalplan (eller något under) som inspelade cellen och spetsen på inspelningen elektroden , och 2) från 10 till 40 | im från den inspelade cellen. Om läkemedlet fyllda pipettspets är över den inspelade cellen, skulle kraften från trycket utstötning störa gigaohm tätningen.
- Spela önskad cellulära svaret samtidigt som du håller cellen i spänning klämma läge eller strömtång läge. Vi registrerar rutinmässigt acetylkolin och / eller nikotin-framkallade cellulära strömmar medan du håller neuroner i spänning klämma läge. Även tryck utmatning kan utlösas manuellt när du använder en Picospritzer III, för mer reproducerbara resultat är det lämpligt att utlösa trycket utmatning med förvärvet systemet (Axon Digidata 1440 och pClamp 10,3) med en digital TTL puls.
5. StyraDrug-fyllda mikropipett med en piezoelektrisk Översättare
- Montera om möjligt drogen fyllda pipetthållare till en enda dimension piezoelektrisk översättare (t.ex. Piezojena PA-100 eller Burleigh PZM-150) som kan ta emot en analog spänningsingång (igen, från förvärvet systemet), som sedan monterat på hög precision mikromanipulator (Sutter MP-285). En piezoelektrisk översättare är användbar eftersom rörelsen av läkemedlet fyllda pipett in i och ut skivan, inklusive tidpunkt och hastighet för inresa / utresa, kan lättare kontrolleras och reproduceras från experiment till experiment. När man studerar nAChR, de desensibiliserande effekterna av nikotin läckage från drogen fyllda pipett, skulle de någonsin inträffar, minimeras när pipetten endast förflyttas nära cellen med en piezoelektrisk översättare för tillfället av trycket utstötning.
- Använda manuellt kontrollerad potentiometer på den piezoelektriska spänningsreglering förstärkare, slå spänningentill sitt maximala värde.
- Använda mikromanipulator, placera läkemedlet fyllda pipett i segmentet där pipetten kommer mata innehållet på inspelade cellen, och dra tillbaka pipetten genom att manuellt sänka spänningen till noll om den piezoelektriska spänningsreglering förstärkare.
- Använder en analog utsignal från inspelningen inhämtningssystemet, flytta läkemedlet fyllda pipett in skivan under en period av 250 msek med början 300 msek innan trycket utstötning TTL puls uppträder. Fäll pipetten under en period av 250 ms, med början 50 msek efter TTL pulsen slutar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoden som presenteras i detta dokument är i stort sett användbar för att studera ligand-gated funktion jonkanal i beredningar hjärnan slice. Det finns emellertid ett antal faktorer som väsentligt påverkar kvaliteten och reproducerbarheten av experimentella data som resulterar från användning av denna metod. Till exempel, framkallade strömmar är mycket känsliga för diametern av spetsen av läkemedlet fyllda pipett. Små tips kommer att orsaka problem med att mata ut läkemedelslösningen och stora tips med låg resistans kommer att vara mer benägna att störa gigaohm tätningen mellan det inspelade cellen och inspelningen elektroden. En annan begränsning av den presenterade metoden är att celler inom 10 um från den inspelade cellen kan utsättas för läkemedel från läkemedels-fyllda pipett, som kan öka sin aktivitet och kan eventuellt påverka den inspelade cellen.
Vid tillämpning av läkemedel till en cell flera gånger med samma läkemedel pipetten, är det avgörande att pipetten återlämnas tillexakt samma position i segmentet för varje applikation. Även små avvikelser (t.ex. 1-2 um) i placering från en reaktion på nästa kommer ofta att resultera i betydande skillnader i det observerade maximala känslighet. En programmerbar piezoelektrisk översättare (såsom beskrivits ovan) eller robotliknande mikromanipulator är fördelaktig för positionering av pipetten läkemedlet. En annan viktig faktor är djupet av det inspelade cell i segmentet. Läkemedel kommer ofta diffundera bort från en cell på ytan av skivan snabbare, medan läkemedel kan "fångas" i segmentet när ut på en cell som är belägen djupt inne i segmentet. Detta är ofta en viktig aspekt vid tillämpningen nikotin, som lätt desensibiliserar nAChRs när exponeringstider är längre än 100-200 ms. Likaså, trycket (i psi) som sprutas in i den läkemedelsinnehållande fyllda pipett och den tid som tryck appliceras (figur 2) är viktiga överväganden för tolkning nAChR ström daTA. Vi använder rutinmässigt 10-12 psi tryck och vi finner att 250 ms hinner lösa nAChR toppströmmar utan att orsaka omfattande receptor hyposensibilisering.
En viktig fördel med den metod vi beskriver är förmågan att utbyta drog-fyllda pipetter tips så att flera läkemedelskoncentrationer kan tillämpas på samma neuron. Viktiga överväganden vid utbyte pipetter är 1) variation i pipettspets läge från en koncentration till nästa, och 2) variationen i pipettspets diameter. Pipettspetsen plats kan normalt kontrolleras tillräckligt med en högupplöst nära-IR-kamera och en exakt mikromanipulator. Variabilitet i pipettspetsen diameter kan regleras genom användning av "syster pipetter" när så är möjligt, och genom att använda en pipett avdragare som drar mikropipetter med en hög grad av noggrannhet och konsekvens.
Totalt sett är drog-fyllda pipett som beskrivs i detta dokument en mycket användbar metod när studying infödda nAChRs uttryckt i nervceller som finns i akuta hjärnan skivor. Förutom att vara användbara för att studera neurobiologi nikotinberoende och nikotinsyra kolinergisk biologi, är denna metod lätt kan tillämpas på andra ligand-jonkanaler. 5-HT 3-receptorer, GABA A-receptorer, och glycinreceptorer är flera av de andra "cys-loop"-receptorer som kan studeras med hjälp av dessa tekniker 21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Institutes of Health (NIH) bidrag DA030396. Tack vare medlemmarna i Drenan labbet för hjälp diskussion och kritik av manuskriptet. Särskilt tack till Mi Ran Kim för tekniskt bistånd och Jonathan Thomas Ting för råd om vuxna skivor mushjärna.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| N-Methyl D-glucamine | Sigma | M2004 | |
| KCl | Sigma | P3911 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S9638 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| glucose | Sigma | G5767 | |
| Na+ ascorbate | Sigma | A4034 | |
| thiourea | Sigma | T8656 | |
| Na+ pyruvate | Sigma | P2256 | |
| MgSO4∙7H2O | Sigma | 230391 | |
| CaCl2∙2H20 | Sigma | 223506 | |
| NaCl | Sigma | S9625 | |
| Na+ pentobarbital | Vortech Pharmaceuticals | 76351315 | |
| potassium gluconate | Sigma | G4500 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Mg-ATP | Sigma | A9187 | |
| GTP | Sigma | G8877 | |
| DSK-Zero 1 Vibrating slicer | Ted Pella, Inc. | ||
| P-97 Flaming/Brown micropipette puller | Sutter | ||
| RC-27 Recording chamber | Warner | ||
| TC-344B Perfusion heater controller | Warner | 640101 | |
| SH-27B Solution heater | Warner | 640102 | |
| Nikon FN-1 | Nikon | ||
| C-7500 CCD Video camera | Hamamatsu | ||
| Picospritzer III | General Valve Co. | ||
| MP-285 Micromanipulator | Sutter | ||
| PA-100 Piez–lectric translator | piezosystem jena, Inc. | ||
| 12V40 piezo amplifier | piezosystem jena, Inc. | ||
| Axopatch 200B | Molecular Devices Corp. | ||
| Digidata 1440A | Molecular Devices Corp. |
References
- Tapper, A. R. Nicotine activation of ?4* receptors: sufficient for reward, tolerance, and sensitization. Science. 306, 1029-1032 (2004).
- Drenan, R. M. In vivo activation of midbrain dopamine neurons via sensitized, high-affinity ?6* nicotinic acetylcholine receptors. Neuron. 60, 123-136 (2008).
- Zhao, S. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nat. Methods. 8, 745-7452 (2011).
- Peca, J. Shank3 mutant mice display autistic-like behaviours and striatal dysfunction. Nature. 472, 437-442 (2011).
- Zhou, F. M., Wilson, C. J., Dani, J. A. Cholinergic interneuron characteristics and nicotinic properties in the striatum. J. Neurobiol. 53, 590-605 (2002).
- Pidoplichko, V. I. Nicotine activates and desensitizes midbrain dopamine neurons. Nature. 390, 401-404 (1997).
- Nashmi, R. Chronic nicotine cell specifically upregulates functional ?4* nicotinic receptors: basis for both tolerance in midbrain and enhanced long-term potentiation in perforant path. J. Neurosci. 27, 8202-8218 (2007).
- Xiao, C. Chronic nicotine selectively enhances ?4?2* nicotinic acetylcholine receptors in the nigrostriatal dopamine pathway. J. Neurosci. 29, 12428-12439 (2009).
- Cohen, B. N. Nicotinic cholinergic mechanisms causing elevated dopamine release and abnormal locomotor behavior. Neuroscience. 200, 31-41 (2012).
- Drenan, R. M. Cholinergic modulation of locomotion and striatal dopamine release is mediated by α6β4* nicotinic acetylcholine receptors. J. Neurosci. 30, 9877-9889 (2010).
- Grady, S. R. Structural differences determine the relative selectivity of nicotinic compounds for native α4β2*-, α6β2*-, α3β4*- and α7-nicotine acetylcholine receptors. Neuropharmacology. 58, 1054-1066 (2010).
- Drenan, R. M. Subcellular trafficking, pentameric assembly, and subunit stoichiometry of neuronal nicotinic acetylcholine receptors containing fluorescently labeled α6 and β3 subunits. Mol. Pharmacol. 73, 27-41 (2008).
- Keath, J. R. Differential modulation by nicotine of substantia nigra versus ventral tegmental area dopamine neurons. J. Neurophysiol. 98, 3388-3396 (2007).
- Mansvelder, H. D. Bupropion inhibits the cellular effects of nicotine in the ventral tegmental area. Biochem. Pharmacol. 74, 1283-1291 (2007).
- Lee, S. The largest group of superficial neocortical GABAergic interneurons expresses ionotropic serotonin receptors. J. Neurosci. 30, 16796-16808 (2010).
- Margolis, E. B.
- Margolis, E. B. The ventral tegmental area revisited: is there an electrophysiological marker for dopaminergic neurons. J. Physiol. 577 (Pt 3), 907-924 (2006).
- Couey, J. J. Distributed network actions by nicotine increase the threshold for spike-timing-dependent plasticity in prefrontal cortex. Neuron. 54, 73-87 (2007).
- Yang, K. Distinctive nicotinic acetylcholine receptor functional phenotypes of rat ventral tegmental area dopaminergic neurons. J. Physiol. 587, 345-361 (2009).
- Endo, T. Nicotinic acetylcholine receptor subtypes involved in facilitation of GABAergic inhibition in mouse superficial superior colliculus. J. Neurophysiol. 94, 3893-3902 (2005).
- Bouzat, C. New insights into the structural bases of activation of Cys-loop receptors. J. Physiol. Paris. , (2011).
