Modification génétique et la recombinaison des cultures d'organes salivaires Gland

Summary

Une technique pour manipuler génétiquement les cellules épithéliales au sein de l'ensemble<em> Ex vivo</em> Embryonnaires de souris en culture glandes sous-maxillaires (SMG) en utilisant le transfert de gènes viraux est décrite. Cette méthode tire parti de la capacité innée de SMG épithélium et le mésenchyme spontanément recombiner après la séparation et l'infection des rudiments épithéliales avec des vecteurs adénoviraux.

Abstract

Morphogenèse de ramification se produit pendant le développement de nombreux organes, et la glande sous-maxillaire embryonnaire de souris (SMG) est un modèle classique pour l'étude de la morphogenèse de ramification. Dans la GSM développement, ce processus itératif implique des mesures de bourgeon épithélial et conduit la formation, en fin de compte à donner naissance à un réseau ramifié de complexe acini et des canaux, qui servent à produire et à modifier / transport de la salive, respectivement, dans la cavité buccale ^{1 – 3.} La membrane basale épithéliale associée et les aspects du compartiment mésenchymateux, y compris les cellules mésenchymateuses, facteurs de croissance et la matrice extracellulaire, produites par ces cellules, sont essentiels pour le mécanisme de branchement, bien que la façon dont les événements cellulaires et moléculaires sont coordonnés reste mal comprise ⁴ . L'étude des mécanismes moléculaires de conduite avancées morphogenèse épithéliale notre compréhension des mécanismes du développement et donne un aperçu possible régénérerapproches de médecine Ative. Ces études ont été entravées par le manque de méthodes efficaces pour la manipulation génétique de l'épithélium salivaire. À l'heure actuelle, la transduction adénovirale représente la méthode la plus efficace pour cibler les cellules épithéliales des glandes adultes in vivo ^5. Toutefois, dans des explants embryonnaires, mésenchyme dense et la membrane basale entourant les cellules épithéliales entrave l'accès virale dans les cellules épithéliales. Si le mésenchyme est supprimée, l'épithélium peuvent être transfectées en utilisant des adénovirus, et rudiments épithéliales peut reprendre la morphogenèse de ramification en présence de Matrigel ou la laminine-111 ^6,7. Mésenchyme croissance sans rudiment épithélial nécessite également un supplément additionnel de facteurs de croissance solubles et n'est pas totalement récapituler morphogenèse de ramification comme cela se produit dans les glandes intactes ^8. Nous décrivons ici une technique qui facilite la transduction adénovirale des cellules épithéliales et de la culture de l'e transfectéespithelium avec mésenchyme associé. Après microdissection des PM embryonnaires, l'enlèvement du mésenchyme, et l'infection virale de l'épithélium avec un adénovirus GFP contenant, nous montrons que l'épithélium se recombine spontanément avec mésenchyme non infecté, récapitulant intacte la structure SMG glandulaire et morphogenèse de ramification. La population de cellules génétiquement modifiées épithéliale peut être facilement contrôlé en utilisant les méthodes classiques de microscopie par fluorescence, si étiquetées par fluorescence constructions adénovirales sont utilisés. Le procédé de recombinaison tissu décrit ici est actuellement la méthode la plus efficace et accessible pour la transfection de cellules épithéliales avec un vecteur de type sauvage ou mutant dans une construction complexe tissu 3D qui ne nécessite pas la production d'animaux transgéniques.

Protocol

Le protocole comporte quatre grandes étapes, comme le montre la figure 1. Toutes les étapes sont décrites en détail. Construction d'adénovirus et de purification virale doit être effectuée avant la collecte d'organes destiné à être utilisé dans la transduction génétique des ébauches découpées épithéliales. Toutes les précautions de sécurité standard BSL-2 doivent être suivies lorsque l'on travaille avec des adénovirus. 1. Embryonnaires de sou…

Representative Results

Le flux des principales étapes expérimentales est présentée dans la figure 1. Un exemple d'une SMG intacte, un rudiment isolé épithéliale, et son mésenchyme correspondant sont présentés dans la figure 2. Images en fond clair de mitraillettes recombinés, qui continuent à subir morphogenèse de ramification lorsque cultivées ex vivo pendant les temps indiqués, sont présentés dans la figure 3. Glandes recombinés cultivées pendant 48 heures é…

Discussion

La technique ex vivo recombinaison épithélio-mésenchymateuse a d'abord été publié pour glandes salivaires sous-maxillaires en 1981 ^16. Dans ce protocole, on élargir la méthode d'origine, en utilisant une infection adénovirale de manipuler l'expression des gènes de cellules épithéliales dans le cadre d'une glande recombiné. Nous montrons que le pourcentage des cellules épithéliales infectées par l'adénovirus, alors que le pourcentage de cellules qui sont infectées…

Materials

Name of the Reagent	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/Ham’s F12 Medium without phenol red	Life Technologies	21041-025
Penicillin and Streptomycin	Life Technologies	15070-163	10X stock
Dispase	Life Technologies	17105-041	Freeze single use aliquots at -20C
BSA	Sigma	A2934-100G	Fraction V, low endotoxin
Adeno-X-GFP	BD Biosciences	8138-1	Should be high titer (1×1010 pfu/ml). CsCl purified viruses are more effective than column-purified viruses in this assay.
16% Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710	Diluted to 2% in PBS with 5% sucrose (w/v)
1X Phosphate-buffered saline (PBS)	Life Technologies	70011-044	Prepared from 10X stock
Hank’s Balanced Salt Solution	Life Technologies	14175095	no Calcium, no Magnesium, no Phenol Red
Transferrin	Sigma	T8158	25 mg/ml stock solution in DMEM/F12 media. Freeze single-use aliquots at -20C
L- Ascorbic acid (Vitamin C)	Sigma	A4403	75 mg/ml stock solution in DMEM/F12 media.Freeze single-use aliquots at -20C
			Table 1. List of reagents required for SMG recombination protocol.
10 cm sterile plastic dishes	Corning	430167	Non-tissue culture-treated plates can also be used.
Stereo dissecting microscope with transmitted light base	Nikon	SMZ645	Any stereo dissecting microscope can be used that has a transmitted light base.
35 mm tissue culture dishes	Falcon	353001	Non-tissue culture-treated plates can also be used.
50 mm diameter microwell dishes	MatTek Corporation	P50-G-1.5-14F
Nuclepore Track-Etch membrane filters	Whatman	110405	13 mm diameter, 0.1 mm pore size
Widefield fluorescence microscope	Carl Zeiss, USA	Axio Observer Z1	Any fluorescence microscope (upright, inverted or stereo dissecting microscope) can be used to monitor GFP expression at low magnification with an attached digital camera.
Confocal microscope	Leica Microsystems	TCS SP5	Confocal microscopy is necessary to see detailed cell structures. Any confocal microscope can be used.
Timed-pregnant female mice, strain CD-1 or ICR	Charles River Labs		Embryos are harvested on day 13 (with day of plug discovery designated as day 0).
Scalpel blade #11	Fine Science Tools	10011-00
Scalpel handle #3	Fine Science Tools	10003-12
Dumont #5 forceps inox alloy, 0.05mm X 0.02mm	Fine Science Tools	11252-20	Ideal for harvesting glands from embryos
Dumont #5 forceps dumostar alloy, 0.05mm X 0.01mm	Fine Science Tools	11295-20	Fine tips are required for removing mesenchyme from epithelium. Tungsten needles can also be used.
			Table 2. Equipment used in SMG recombination protocol.