Antigener Beskyttet Funksjonell røde blodceller av membranen Pode av kompakt hyperforgrenede Polyglycerols

Summary

Cellemembranen modifisering av røde blodceller (RBC) med hyperforgrenede polyglycerol (HPG) presenteres. Modifiserte RBCs var preget av vandig to fase partisjonering, osmotisk skjørhet og utfyller mediert lysis. Kamuflasje av overflateproteiner og antigener ble evaluert med flowcytometri og Micro Typing System (MTS) blod fenotyping kort.

Abstract

Røde blodceller (RBC) transfusjon er avgjørende for behandlingen av en rekke akutte og kroniske medisinske problemer som thalassemia major og sigdcelleanemi ^1-3. På grunn av tilstedeværelsen av mange antigener på RBC overflaten (~ 308 kjente antigener ^4), pasienter i kronisk blodoverføring terapi utvikle alloantibodies grunn glipp samsvarer med mindre antigener på transfused ^{4 RBCs, 5.} Pode av hydrofile polymerer slik som polyetylenglykol (PEG) og hyperforgrenede polyglycerol (HPG) danner et lag på uttrekk RBC membran som hindrer interaksjon av antistoffer med overflateantigener uten å påvirke passasje av små molekyler slik som oksygen, glukose, og ioner ^3. I dag ingen fremgangsmåte er tilgjengelig for dannelsen av universelle røde blod donor cellene delvis på grunn av den skremmende utfordringen i tilstedeværelsen av et stort antall antigener (protein og karbohydrat basert) på RBC overflaten og development av slike metoder vil forbedre transfusjon sikkerhet, og dramatisk forbedre tilgjengeligheten og bruken av RBCs. I denne rapporten er de forsøk som er brukt for å utvikle antigen beskyttede funksjonelle RBCs av membranen pode av HPG og deres karakterisering presenteres. HPGs er svært biokompatible kompakte polymerer ^{6, 7,} og er forventet å bli lokalisert i cellen glycocalyx som omgir lipid membran ^{8, 9} og maske RBC overflateantigener ^{10, 11.}

Protocol

A. hyperforgrenede polyglycerol Modification (SS-HPG)

1. Plass lyofilisert HPG 60 kDa (0,5 g, 0,0083 mmol) i en rundbunnet kolbe og tørk over natten under vakuum ved 90 ° C.
2. Kjøle kolben til romtemperatur, og oppløs tørket HPG i vannfri pyridin (3 ml).
3. Å functionalize ca åtte hydroksylgrupper på HPG med karboksylgrupper, legge katalytisk mengde av dimetylaminopyridin (en dråpe på 5 mg / ml oppløsning i pyridin) til HPG løsningen. Til denne blanding, legge ravsyreanhydrid, (0,0067 g, 0,0664 mmol) oppløst i 0,5 ml pyridin slipp klok over 10 min. Omrør blandingen over natten ved romtemperatur under argon.
4. Utfelle blandingen i 40 ml kald aceton (4 ° C) i et 50 ml sentrifugerør og sentrifuger bruke en Beckman J2-MC sentrifuge ved 27.000 xg i 15 min. Dekanter supernatanten, og fjerne rester aceton ved å spyle med argon ved romtemperatur.
5. For å aktivere den karboksyl grupper med succinimidyl succinate (SS) gruppene, oppløse den carboxyl-funksjonalisert HPG i 3 ml vannfri DMF. Legg N-hydroksysuccinimid (0,0077 g, 0,0664 mmol) og N, N'-diisopropylkarbodiimid (0,0084 g, 0,0664 mmol) til HPG løsning og omrør blandingen over natten ved romtemperatur under argon.
6. Rense SS-HPG av nedbør i kalde aceton.
7. Fjerne rester aceton ved å spyle med argon.
8. Bestem renhet modifisert HPG og graden av karboksyl og SS funksjonalisering ved proton ⁽¹ H) - NMR-analyse.

B. Hele Blodprøvetaking og Løsrivelse av røde blodceller (RBC)

1. Samle helblod (40% hematokritt, 3 ml) fra samtykket friske humane givere i en citrat Vacutainer-rør.
2. Sentrifuger citrat røret ved 1000 xg i 4 minutter.
3. Supernatanten fjernes som inneholder plasma og blodplater, og det mellomliggende buffy coat som inneholder hvite blodceller og platelets hjelp en Pasteur pipette.
4. Overfør pakket RBCs (80% hematokritt, 1,2 ml) i en 12 ml Falcon sentrifugerør, og legge PBS buffer (8 ml, pH = 8,0) for å vaske RBCs.
5. Bland RBCs ved inversjon for å få jevn celle distribusjon.
6. Sentrifuger Falcon rør ved 1000 xg i 4 min, og fjern supernatanten.
7. Vask RBCs med PBS to ganger ved å gjenta trinn 5 og 6.
8. Sted pakket-RBCs (100 ul) i 1,6 ml Eppendorf-rør, og legge PBS buffer (300 pl, pH = 8,0) for å oppnå 20% hematokritt RBC.

C. HPG Pode til RBC

1. Umiddelbart etter utfelling av modifisert HPG i aceton i trinn A6, place SS-HPG (150 mg) i et hetteglass (1 dram), og oppløse den i PBS-buffer (300 pl, pH = 8,0).
2. Legg SS-HPG polymeroppløsning i 20% hematokritt vasket RBCs å oppnå et endelig volum på 400 pl og SS-HPG konsentrasjon som varierer fra 0,5 mm til 3 mm. For eksempel for å forberede RBCs behandlet med 0,5 mM SS-HPG, fjerne 36 pl PBS fra den vaskede RBC og plassere 36 pl SS-HPG polymerløsning.
3. Vortex suspensjonen forsiktig og plasser Eppendorf-rør på en orbital rister ved romtemperatur i 1 time.
4. Sentrifuger Eppendorf-rør ved 1000 xg i 4 min, og pipetteres ut supernatanten.
5. Tilsett 1 ml PBS for å vaske RBCs, sentrifuger og fjern supernatanten.
6. Tilsett 1 ml saltvann og vask RBCs dobbelt så i trinn 5.
7. Legg 300 pl saltvann til 100 ul av pakkede RBCs (80% hematokritt) til en endelig konsentrasjon på 20% hematokritt.

D. Karakterisering av HPG Forandringer RBC

I. komplement mediert lysis

1. Utlevering rundt 8 ml helblod fra friske humane givere inn BD Vacutainer glass serum rør, og tillater blodet koagulere ved romtemperatur i 30 min.
2. Sentrifuger røret ved 2000 xg i 10 min, og samle seg 3 ml serum.
3. En milliliter av Serum ble plassert i et vannbad ved 60 ° C i 30 minutter til å forberede varmeinaktivert serum.
4. Legg 60 pl fersk serum eller varme inaktivert serum i en Eppendorf rør som inneholder 60 pl 20% hematokritt HPG modifiserte RBCs eller uendrede RBCs.
5. Inkuber RBCs for en time ved 37 ° C.
6. For å kvantifisere mengden av hemoglobin i cellesuspensjonen, sted 5,9 pl 20% hematokritt på HPG modifiserte RBCs eller umodifisert celler i triplikat i 96 brønns plate. Legg 294 pl Drabkin reagens (et reagens som brukes for å kvantifisere mengden av hemoglobin spectrophotomerically). Bland celler med Drabkin reagens ved pipettering inn og ut. Mål absorbansen av hemoglobin cyanoderivative ved 540 nm ved hjelp av SPECTRA MAX 190 plateavleser.
7. For å kvantifisere mengden av hemoglobin i supernatanten, sentrifuger cellene ved 13.000 xg i 1 min. Plass 50 pl av supernatanten i triplikat i en 96 brønns plate. Tilsett 250 ul Drabkin reagens. Mix celler med Drabkin reagensved å pipettere inn og ut. Mål absorbansen av hemoglobin cyanoderivative ved 540 nm ved hjelp av SPECTRA MAX 190 plateavleser.
8. Kvantifisere mengden av lyserte celler fra forholdet av hemoglobin i supernatanten (trinn 7) og det totale hemoglobin i prøven (trinn 6) ^{8, 11, 12.}

II. Kamuflasje av store og små antigener ved hjelp MTS kort

1. Plass 50 ul HPG modifisert RBC (10% hematokritt) i et Eppendorf-rør, sentrifuger ved 1000 xg i 1 min, og fjern supernatanten.
2. Legg 110 pl MTS fortynningsmiddel til cellepelleten og homogenisere cellesuspensjonen ved å pipettere inn og ut.
3. Legg 11 pl cellesuspensjon til hver mini gelkolonne. Unngå å berøre gelen under tilsetningen.
4. Finn MTS kortene inn i en sentrifuge kortholderen, og sentrifuger ved 156 xg i 6 min.
5. Beskyttelse av overflateantigener bestemmes fra plasseringen av RBC i mini gelkolonne, basert på fremstillingr beskrivelse.

III. Vandige to fase partisjon målinger

1. Forbered Dextran 500 kDa / PEG 8 kDa to faseseparasjon system sammensatt av (5% dekstran 500k, 4% 8K PEG, 150 mM NaCl, 10 mM fosfat) i henhold til ^13.
2. Sentrifuger ved 433 xg i 10 min ved romtemperatur for å oppnå en to fasesystem (dekstran i bunnen).
3. Separer de to fasene nøye.
4. Alikvot 1,0 ml av den øvre PEG fase inn en merket rør (med konkav bunn), tilsett 20 ul av 20% hematokritt HPG modifisert RBC, og bland celler forsiktig ved å smekke.
5. Tilsett 0,5 ml av den øvre fase som inneholder cellene til 0,5 ml av en lavere fase, og bland forsiktig ved systemet sveipe.
6. Plasser røret på benken for ~ 2 min for systemet å skille, og bestemme plasseringen av celler i systemet. Lokalisering av RBCs (i øvre PEG fase, i nedre dekstran fase eller i begge) er funksjonen til graden av modifikasjon og molekylærvekt HPG.

IV. Osmotiske skjørhet målinger

1. Forbered NaCl løsninger med konsentrasjoner som er fra 0 til 0,9 (w / v)%.
2. Plass 0,4 ml NaCl løsninger i 1,5 ml Eppendorf-rør.
3. Tilsett 20 pl av RBCs (20% hematokrit) inn i NaCl-løsninger.
4. Mix celler forsiktig ved inversjon og plassere dem i et vannbad ved 37 ° C i 30 min.
5. Suspendere celler nøye ved inversjon. Ta 50 ul RBC suspensjon og legge den til en 1 ml Drabkin reagens, plassert i en kyvette. Bland celler med Drabkin reagens ved pipettering inn og ut. Mål absorbansen av hemoglobin cyanoderivative ved 540 nm ved hjelp av BECKMAN COULTER DU 730 UV / VIS-leser.
6. For å kvantifisere mengden av hemoglobin i supernatanten, sentrifuger cellene ved 1000 xg i 1 min. Tilsett 200 pl av supernatanten til 1 ml av Drabkin reagens i en kyvette. Bland celler med Drabkin reagens ved pipettering inn og ut. Måle absorbansen til hemoglObin cyanoderivative ved 540 nm ved hjelp BECKMAN COULTER DU 730 UV / VIS-leser.
7. Beregne mengden av celler lysert i forskjellige NaCl-løsning fra forholdet mellom mengden hemoglobin i supernatanten (trinn 6) til den totale mengden av hemoglobin i cellesuspensjonen (trinn 5).

V. flowcytometri målinger - Beskyttelse av rhesus-D (RHD) antigen

1. Tilsett 5 ul kontroll eller HPG modifiserte RBCs (20% hematokrit) i triplikat til PBS buffer supplert med 0,5% BSA til et totalt volum på 25 pl.
2. Legg 25 pl av FITC monoklonale anti-rhesus D (RHD) kjøpt fra Quotient Biodiagnostics (PA, USA).
3. Inkuber blandingen i 30 minutter ved 37 ° C i et vannbad.
4. Vask blandingen med 1,5 ml PBS-buffer to ganger. Sentrifuger ved 1000 xg i 1 min for å fjerne supernatanten.
5. Suspendere RBCs inn 1 ml saltvann, og overføre suspensjonen i 4 ml flyt BD strømningscytometri tube.
6. Analyser ved hjelp FACSCanto II flow cytometer anskaffe 5000 hendelser på RBC kontroll gate, og bruke hele hendelser for analyse.

VI. Flowcytometri målinger - Expression of CD47

1. Legg 1,54 ul kontroll eller HPG modifiserte RBCs (20% hematokrit) i triplikat til PBS buffer supplert med 0,5% BSA til et totalt volum på 44 pl.
2. Tilsett 6 ul phycoerythrin (PE) merket mouse anti-humane CD47 kjøpt fra BD Biosciences (NJ, USA).
3. Inkuber blandingen i 30 minutter ved 37 ° C i et vannbad.
4. Vask blandingen med 1,5 ml PBS-buffer i to ganger. Sentrifuger ved 1000 xg i 1 min for å fjerne supernatanten.
5. Suspendere RBCs inn 1 ml saltvann, og passerer gjennom 26 G 5/8 nålen å minimere celle klumpdannelse.
6. Overfør suspensjonen i 4 ml flyt BD flowcytometri tube.
7. Analyser ved hjelp FACSCanto II flowcytometer, anskaffe 10000 hendelser på RBC kontroll gate.

Representative Results

Kamuflasje av Rhesus D antigen og CD47 RBC overflateprotein ble kvantifisert ved strømningscytometri hjelp fluorescerende merkede monoklonale antistoffer, og et representativt resultat er gitt i figur 1. I tilfelle av HPG-podet RBCs (grå), reduserte intensiteten av signalet (peak skiftet til venstre) i forhold til kontrollen RBCs (rød og grønn) som indikerer en reduksjon i binding til antistoffer til celleoverflate som indikerer maskering av overflateproteiner .

Figur 1. Evaluering av kamuflasje av overflateantigener og proteiner ved hjelp av strømningscytometri. A) Rhesus D (RHD) beskyttelse: Black skyggelagt topp representerer den negative kontrollen (ikke-modifiserte RBCs behandlet med PE-merket IgG1), den grønne topp representerer den positive control (umodifiserte RBCs behandlet med anti-RHD fluorescerende antistoff), og det grå topp representerer HPG modifiserte RBCs ble behandlet med samme mengde av anti-RHD fluorescerende antistoff. B) CD47: Svart skyggelagt topp representerer den negative kontrollen (ikke-modifiserte RBCs behandlet med PE-merket IgG1), den røde peak representerer den positive kontrollen (ikke-modifiserte RBCs behandlet med anti-CD47 fluorescerende antistoff), og den grå topp representerer HPG modifiserte RBCs behandlet med samme mengde anti-CD47 fluorescerende antistoff. Klikk her for å se større figur .

Discussion

Universelle donor RBCs har stort potensial i å forbedre blod tilgjengelighet og sikkerhet for blodoverføring terapi. RBCs regnes også lovende levering av legemidler kjøretøy på grunn av sin lange sirkulasjon og iboende biokompatibilitet ^{14, 15.} Eksperimenter presenteres i denne artikkelen evaluere in vitro karakteristika HPG modifiserte RBCs. In vitro egenskaper og in vivo sirkulasjon av HPG modifiserte RBCs er undersøkt i vår gruppe nylig ^{8, 11.} Delingen av RBCs i Dextran500K/PEG8K vandig to fasesystem, supplert med NaCl og natriumfosfat, avhenger erytrocytt overflateladning og på overflaten glykoprotein sammensetning ^16. Avhengig av omfanget av rbc glycocalyx modifisering med HPGs, modifiserte RBCs tendens å partisjonere fra nedre dekstran til øvre PEG fase. Tofase-systemet gir en lettvinte evaluering av omfanget av RBC overflatemodifisering. Lysis of RBCs i autologt serum er signifikant test for å undersøke, om HPG modifiserte RBCs utløser komplementaktivering, siden innføre nye materialer til celler og biologiske overflater gjør dem utenlandske og underlagt immunsystem mediert lysis og klarering ^17. Det osmotiske skjørhet eksperimentet, på den annen side, indikerer hvorvidt mekaniske egenskaper og deformerbarhet av rbc membran har blitt kompromittert som følge av HPG pode. Den deformerbarhet av RBCs er viktig for den fysiologiske funksjon av O ₂ produksjonstid til ulike deler av kroppen. I dette eksperimentet modifiserte RBCs utsettes for deformasjon stresset ved behandling med forskjellige konsentrasjoner av NaCl, og kvantifisering prosent av lyserte celler.

Strømningscytometri er brukt til å evaluere graden av overflateantigen og overflateprotein beskyttelse (figur 1) ved omsetning av et spesielt antigen på overflaten av RBC med tilhørende lysstoffrør-labelled antistoff. Omfanget av rhesus D antigen beskyttelse er vurdert etter strømningscytometri. Maskering av antigener er tydelig fra nedgangen i antistoffbinding til RBC. Rhesus D antigen maskering er også evaluert av MTS-kort. MTS kort er mye brukt i hematologi laboratorier på sykehus for fenotyping av RBCs. For eksempel, når A-gruppe RBC ligger i A-attraksjon MTS kort, celler agglutinere som et resultat av reaksjon med den tilsvarende monoklonalt antistoff. Men gjør B-gruppen blod ikke agglutinate og reiser til bunnen av mini gel. Begrepet agglutinasjon ble brukt til å vurdere nivået av beskyttelse som HPG pode gir til RBCs. HPG-podet RBCs penetrerer mini gelkolonne, avhengig av nivået av overflate antigen beskyttelse.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glycidol	Sigma Aldrich		(ON, Canada)
Trimethylolpropane	Fluka		(ON, Canada)
Potassium methylate	Sigma Aldrich		(ON, Canada)
Anhydrous pyridine	Sigma Aldrich		(ON, Canada)
4-Dimethylaminopyridine	Sigma Aldrich		(ON, Canada)
Succinic anhydride	Sigma Aldrich		(ON, Canada)
Acetone	Fisher Scientific		(ON, Canada)
Anhydrous dimethyl formamide	Sigma Aldrich		(ON, Canada)
N-Hydroxysuccinimide	Sigma Aldrich		(ON, Canada)
N,N'-Diisopropylcarbodiimide	Sigma Aldrich		(ON, Canada)
MTS cards			Micro Typing System (MTS) cards (FL, USA)
Dextran 500 kDa	Pharmacia Fine Chemicals		(Sweden)
PEG 8 kDa	Sigma Aldrich		(ON, Canada)
FITC monoclonal anti-Rhesus D (RhD)	Quotient Biodiagnostics		(PA, USA)
PE monoclonal anti-CD47	BD Biosciences		(NJ, USA)
Drabkin's reagent	Sigma Aldrich		(ON, Canada)
Table. Chemicals and reagents used for the grafting of HPG polymers to RBC membrane and their analysis.