Antigener skyddade funktionella röda blodkroppar av membranet Ympning av kompakt Hyperförgrenade Polyglyceroler

Summary

Cellmembranet modifiering av röda blodkroppar (RBC) med hyperförgrenad polyglycerol (HPG) presenteras. Modifierade RBC präglades av vatten två fas partitionering osmotisk bräcklighet och komplement lys. Kamouflage av ytproteiner och antigener utvärderades med användning av flödescytometri och Micro Typing System (MTS) blod fenotypning kort.

Abstract

Röda blodkroppar (RBC) transfusion är avgörande för behandling av ett antal akuta och kroniska medicinska problem såsom thalassemi major och sicklecellanemi ^1-3. På grund av närvaron av många antigener på RBC ytan (~ 308 kända antigener ^4), patienter i kronisk blodtransfusion terapi utveckla alloantikroppar grund av miss matchen mindre antigener på transfunderade RBC ^{4, 5.} Ympning av hydrofila polymerer, såsom polyetylenglykol (PEG) och hyperförgrenad polyglycerol (HPG) bildar ett undantag skikt på RBC-membran som förhindrar interaktionen av antikroppar med ytantigener utan att påverka passagen av små molekyler såsom syre, glukos, och joner ^3. För närvarande finns ingen metod tillgänglig för alstring av universella röda blodkroppar donator delvis på grund av den skrämmande utmaning genom närvaron av ett stort antal antigener (protein och kolhydrat baserad) på RBC ytan och dUTVECKLING sådana metoder kommer att avsevärt förbättra transfusion säkerhet och dramatiskt förbättra tillgängligheten och användningen av RBC. I denna rapport är experiment som används för att utveckla antigen skyddade funktionella RBC genom membranet ympning av HPG och deras karakterisering presenteras. HPGs är biokompatibla mycket kompakta polymerer ^{6, 7,} och förväntas ligga inom cellen glykokalyx som omger lipidmembranet ^{8, 9} och mask RBC ytantigener ^{10, 11.}

Protocol

A. hyperförgrenad Polyglycerol Ändring (SS-HPG)

1. Plats lyofiliserades HPG 60 kDa (0,5 g, 0,0083 mmol) i en rundbottnad kolv och torka över natten under vakuum vid 90 ° C.
2. Kylförvara kolven till rumstemperatur, och upplösa den torkade HPG i vattenfri pyridin (3 ml).
3. Att funktionalisera cirka åtta hydroxylgrupper på HPG med karboxylgrupper, tillsätt katalytisk mängd dimetylaminopyridin (en droppe av 5 mg / ml lösning i pyridin) till HPG lösningen. Till denna blandning, tillsätt bärnstenssyraanhydrid, (0,0067 g, 0,0664 mmol) upplöst i 0,5 ml pyridin droppvis under 10 minuter. Omrör blandningen över natten vid rumstemperatur under argon.
4. Fälla ut blandningen i 40 ml kall aceton (4 ° C) i en 50 ml centrifugrör, och centrifugera med en Beckman J2-MC centrifug vid 27.000 xg under 15 minuter. Dekantera supernatanten, och avlägsna kvarvarande aceton genom spolning med argon vid rumstemperatur.
5. För att aktivera karboxil grupper med succinimidylsuccinat (SS) grupper, lös den karboxyl-funktionaliserade HPG i 3 ml vattenfri DMF. Tillsätt N-hydroxisuccinimid (0,0077 g, 0,0664 mmol) och N, N'-diisopropylkarbodiimid (0,0084 g, 0,0664 mmol) till lösningen HPG och omrör blandningen över natten vid rumstemperatur under argon.
6. Rena SS-HPG genom utfällning i kall aceton.
7. Avlägsna kvarvarande aceton genom spolning med argon.
8. Bestäm renheten hos modifierade HPG och graden av karboxyl-och SS-funktionalisering genom proton ⁽¹ H) - NMR-analys.

B. helblodstappning och separation av röda blodkroppar (RBC)

1. Samla helblod (40% hematokrit, 3 ml) från samtyckt friska humana donatorer i en citrat vacutainer rör.
2. Centrifugera citratrör vid 1.000 x g under 4 min.
3. Avlägsna supernatanten som innehåller plasma och trombocyter, och den mellanliggande buffy coat som innehåller vita blodkroppar och platelets med en Pasteur-pipett.
4. Överför packade RBC (80% hematokrit, 1,2 ml) i en 12 ml Falcon centrifugrör, och tillsätt PBS-buffert (8 ml, pH = 8,0) för att tvätta RBC.
5. Blanda RBC genom inversion för att få jämn cellfördelning.
6. Centrifugera Falcon-rör vid 1.000 x g under 4 min, och avlägsna supernatanten.
7. Tvätta RBCs med PBS två gånger genom att upprepa steg 5 och 6.
8. Plats packade RBC-(100 pl) i 1,6 ml Eppendorf-rör och tillsätt PBS-buffert (300 | il, pH = 8,0) för erhållande av 20% hematokrit RBC.

C. HPG Ympning till RBC

1. Omedelbart efter utfällning av modifierad HPG i aceton i steg A6, plats SS-HPG (150 mg) i en glasflaska (1 dram), och upplösa den i PBS-buffert (300 | il, pH = 8,0).
2. Lägg SS-HPG polymerlösning i 20% hematokrit tvättade RBC för att erhålla en slutlig volym av 400 | il och SS-HPG koncentration som sträcker sig från 0,5 mM till 3 mM. Till exempel för att framställa RBC behandlade med 0,5 mM SS-HPG, ta bort 36 | il PBS från den tvättade RBC och placera 36 il SS-HPG polymerlösning.
3. Vortexblanda suspensionen försiktigt och placera Eppendorf-rör på en orbital skakanordning vid rumstemperatur under 1 timme.
4. Centrifugera Eppendorf-rör vid 1.000 x g under 4 min, och pipettera ut supernatanten.
5. Tillsätt 1 ml PBS för att tvätta RBC, centrifugera och avlägsna supernatanten.
6. Tillsätt 1 ml koksaltlösning och tvätta RBC två gånger som i steg 5.
7. Lägg 300 pl saltlösning till 100 pl packade RBC (80% hematokrit) till en slutlig koncentration av 20% hematokrit.

D. Karaktärisering av HPG Modifierad RBC

I. Komplement medierad lys

1. Samla cirka 8 ml helblod från friska humana donatorer i BD Vacutainer glas serum röret, och låta blodet koagulera vid rumstemperatur under 30 minuter.
2. Centrifugera röret vid 2.000 xg i 10 min och samla ca 3 ml serum.
3. En milliliter av Serum placerades i ett vattenbad vid 60 ° C under 30 minuter för att framställa värmeinaktiverat serum.
4. Lägg 60 il färskt serum eller värmeinaktiverat serum i ett Eppendorf-rör som innehåller 60 | il av 20% hematokrit modifierade HPG RBC eller omodifierade RBC.
5. Inkubera RBC för 1 h vid 37 ° C.
6. För att kvantifiera mängden av hemoglobin i cellsuspensionen, plats 5,9 pl 20% hematokrit av HPG modifierade RBC eller omodifierade celler i triplikat i 96-brunnsplatta. Lägg 294 pl Drabkin reagens (ett reagens som används för att kvantifiera mängden hemoglobin spectrophotomerically). Blanda celler med Drabkin reagens genom pipettering in och ut. Mät absorbansen hos hemoglobin cyanoderivative vid 540 nm med användning av SPECTRA MAX 190 plattläsare.
7. För att kvantifiera mängden hemoglobin i supernatanten, centrifugera celler vid 13.000 xg under 1 minut. Placera 50 | il supernatant i triplikat i en 96-brunnsplatta. Tillsätt 250 | il Drabkin reagens. Mix celler med Drabkin reagensgenom pipettering in och ut. Mät absorbansen hos hemoglobin cyanoderivative vid 540 nm med användning av SPECTRA MAX 190 plattläsare.
8. Kvantifiera mängden lyserade celler från förhållandet av hemoglobin i supernatanten (steg 7) och totalt hemoglobin i provet (steg 6) ^{8, 11, 12.}

II. Den kamouflage av större och mindre antigener med MTS kort

1. Placera 50 | il HPG modifierad RBC (10% hematokrit) i ett Eppendorf-rör, centrifugera vid 1.000 x g under 1 min, och avlägsna supernatanten.
2. Lägg 110 pl av MTS spädningsmedel till cellpelleten och homogenisera cellsuspensionen genom pipettering in och ut.
3. Lägg 11 il cellsuspension till varje mini gelkolonn. Undvik att vidröra gelén under tillsatsen.
4. Leta MTS kort i en centrifug korthållaren och centrifugera vid 156 xg under 6 min.
5. Skydd av ytantigener bestäms från läget av RBC i mini gelkolonn, baserat på tillverkningR Beskrivning.

III. Vattenhaltiga två fas partition mätningar

1. Förbered Dextran 500 kDa / PEG 8 kDa tvåfas separationssystem bestående av (5% dextran 500k, 4% PEG 8K, 150 mM NaCl, 10 mM fosfat) enligt ^13.
2. Centrifugera vid 433 x g under 10 minuter vid rumstemperatur för att erhålla ett tvåfassystem (dextran i botten).
3. Separera de två faserna noggrant.
4. Alikvotera 1,0 ml av den övre PEG-fasen till en märkt rör (med konkav botten), tillsätt 20 pl 20% hematokrit HPG modifierad RBC, och celler blanda försiktigt genom att ställa.
5. Tillsätt 0,5 ml av den övre fasen som innehåller celler till 0,5 ml av en undre fas, och blanda försiktigt systemet genom snärta.
6. Placera röret på bänken för ~ 2 minuter för systemet att separera, och bestämma platsen för celler i systemet. Lokalisering av RBC (i den övre PEG-fasen, i den undre fasen dextran eller i båda) är funktion av graden av modifiering och molekylärvikt HPG.

IV. Osmotiska bräcklighet mätningar

1. Förbered NaCl-lösningar med koncentrationer som sträcker sig från 0 till 0,9 (vikt / volym)%.
2. Placera 0,4 ml av NaCl-lösningar i 1,5 ml Eppendorf-rör.
3. Tillsätt 20 | il av RBC (20% hematokrit) i NaCl-lösningar.
4. Blanda celler försiktigt genom inversion och placera dem i ett vattenbad vid 37 ° C i 30 min.
5. Avbryta celler försiktigt genom inversion. Ta 50 il RBC fjädring och lägga till en 1 ml Drabkin reagens, placeras i en kyvett. Blanda celler med Drabkin reagens genom pipettering in och ut. Mät absorbansen hos hemoglobin cyanoderivative vid 540 nm med användning av BECKMAN COULTER DU 730 UV / VIS-läsare.
6. För att kvantifiera mängden hemoglobin i supernatanten, centrifugera celler vid 1.000 x g under 1 min. Tillsätt 200 | il av supernatanten till 1 ml av Drabkin reagens i en kyvett. Blanda celler med Drabkin reagens genom pipettering in och ut. Mät absorbansen hos hemoglObin cyanoderivative vid 540 nm med BECKMAN COULTER DU 730 UV / VIS läsare.
7. Beräkna mängden celler som lyserats i olika NaCl-lösning från förhållandet av mängden hemoglobin i supernatanten (steg 6) till den totala mängden hemoglobin i cellsuspensionen (steg 5).

V. Flödescytometri mätningar - Skydd av Rhesus-D (RhD) antigen

1. Tillsätt 5 pl av kontroll eller HPG modifierade RBC (20% hematokrit) i tre exemplar till PBS-buffert kompletterad med 0,5% BSA till en total volym av 25 pl.
2. Tillsätt 25 ul FITC monoklonala anti-Rhesus D (RhD) köpt från Quotient Biodiagnostics (PA, USA).
3. Inkubera blandningen i 30 minuter vid 37 ° C i ett vattenbad.
4. Tvätta blandningen med 1,5 ml PBS-buffert två gånger. Centrifugera vid 1.000 x g under 1 min för att avlägsna supernatanten.
5. Suspendera RBC i 1 ml saltlösning, och överför suspensionen till 4 ml flöde BD flödescytometri rör.
6. Analysera med FACSCanto II flow cytometer, skaffa 5.000 händelser på RBC styret och använda hela händelser för analys.

VI. Flödescytometri mätningar - Expression av CD47

1. Lägg 1,54 il kontroll eller HPG modifierade RBC (20% hematokrit) i tre exemplar till PBS-buffert kompletterad med 0,5% BSA till en total volym av 44 pl.
2. Tillsätt 6 il fykoerytrin (PE)-märkt mus-anti-humana CD47 inköpta från BD Biosciences (NJ, USA).
3. Inkubera blandningen i 30 minuter vid 37 ° C i ett vattenbad.
4. Tvätta blandningen med 1,5 ml PBS-buffert två gånger. Centrifugera vid 1.000 x g under 1 min för att avlägsna supernatanten.
5. Suspendera RBC i 1 ml saltlösning, och passerar genom 26 G 5/8 nål för att minimera cell-hopklumpning.
6. Överför suspensionen i 4 ml flöde BD flödescytometri rör.
7. Analysera med FACSCanto II flödescytometer, förvärva 10.000 händelser på RBC styrelektroden.

Representative Results

Kamouflera av Rhesus D-antigen och CD47 RBC ytprotein kvantifierades genom flödescytometri med användning av fluorescerande märkta monoklonala antikroppar, och ett representativt resultat ges i figur 1. Vid HPG-ympade RBC (grå), minskade intensiteten av signalen (topp skiftas till vänster) jämfört med kontrollen RBC (röd & grön) indikerar en minskning i bindning till antikroppar till cellytan som indikerar maskering av ytproteiner .

Figur 1. Utvärdering av kamouflage av ytantigener och proteiner med användning av flödescytometri. A) Rhesus D (RhD) skydd: Svart skuggade topp representerar den negativa kontrollen (icke-modifierade röda blodkroppar behandlade med PE-märkt lgG1), den gröna toppen representerar den positiva samarbetetntrol (icke-modifierade RBCs behandlade med anti-RhD fluorescerande antikropp), och den grå topp representerar HPG modifierade RBC behandlade med samma mängd av anti-RhD-fluorescerande antikropp. B) CD47: Svart skuggade topp representerar den negativa kontrollen (icke-modifierade RBCs behandlade med PE-märkt lgG1), den röda toppen representerar den positiva kontrollen (icke-modifierade RBCs behandlade med anti-CD47 fluorescerande antikropp), och den grå topp representerar HPG modifierade RBC behandlats med samma mängd av anti-CD47 fluorescerande antikropp. Klicka här för att se större bild .

Discussion

Universal givare RBC har stor potential för att öka blod tillgänglighet och säkerhet för blodtransfusion terapi. RBC anses också lovande bärare av läkemedel på grund av deras långa cirkulation och inneboende biokompatibilitet ^{14, 15.} Experiment som presenteras i detta dokument utvärdera in vitro hos HPG modifierade RBC. In vitro fastigheter och in vivo cirkulation av HPG modifierade röda blodkroppar har undersökts i vår grupp nyligen ^{8, 11.} Delningen av RBC i Dextran500K/PEG8K vattenfasen tvåfassystem, kompletterad med NaCl och natriumfosfat, beror på den erytrocyt ytladdning och på ytglykoprotein komposition ^16. Beroende på omfattningen av RBC glykokalyx modifiering med HPGs, modifierade RBK tenderar att partitionera från nedre dextran till den övre PEG-fasen. Tvåfassystemet ger en enkel utvärdering av graden av RBC ytmodifiering. Lysis Of RBC i autologt serum är betydande test för att undersöka, om HPG modifierade RBC utlöser komplementaktivering, eftersom införandet av nya material till celler och biologiska ytor gör dem främmande och föremål för immunförsvaret lys och clearance ^17. Den osmotiska bräcklighet experimentet, å andra sidan, indikerar huruvida mekaniska egenskaper och deformerbarhet av RBC-membran har äventyrats på grund av HPG ympning. Den deformerbarhet RBC är viktig för den fysiologiska funktionen av O ₂ leverans till olika delar av kroppen. I detta experiment modifierade RBC utsätts för deformation stress genom behandling med olika koncentrationer av NaCl, och kvantifiera procent av lyserade celler.

Flödescytometri användes för att utvärdera omfattningen av ytantigen och ytprotein skydd (figur 1) genom omsättning av en speciell antigen på ytan av RBC med dess motsvarande fluorescerande-labelled antikropp. Omfattningen av Rhesus D-antigen skydd utvärderas med användning av flödescytometri. Maskering av antigener framgår av minskningen i antikroppsbindning till RBC. Rhesus D-antigenet maskering utvärderades också genom MTS kort. MTS kort används ofta i hematologi laboratorier på sjukhus för fenotypning av RBC. Till exempel, när A-grupp RBC ligger i A-typ MTS kort, celler agglutinera som ett resultat av reaktion med den motsvarande monoklonala antikroppen. Emellertid, inte B-gruppen blod inte agglutinerar och reser till botten av mini gelén. Begreppet agglutinering användes för att utvärdera den skyddsnivå som HPG ympning ger till RBC. HPG-ympade RBC tränger mini gelkolonn, beroende på graden av ytantigen skydd.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glycidol	Sigma Aldrich		(ON, Canada)
Trimethylolpropane	Fluka		(ON, Canada)
Potassium methylate	Sigma Aldrich		(ON, Canada)
Anhydrous pyridine	Sigma Aldrich		(ON, Canada)
4-Dimethylaminopyridine	Sigma Aldrich		(ON, Canada)
Succinic anhydride	Sigma Aldrich		(ON, Canada)
Acetone	Fisher Scientific		(ON, Canada)
Anhydrous dimethyl formamide	Sigma Aldrich		(ON, Canada)
N-Hydroxysuccinimide	Sigma Aldrich		(ON, Canada)
N,N'-Diisopropylcarbodiimide	Sigma Aldrich		(ON, Canada)
MTS cards			Micro Typing System (MTS) cards (FL, USA)
Dextran 500 kDa	Pharmacia Fine Chemicals		(Sweden)
PEG 8 kDa	Sigma Aldrich		(ON, Canada)
FITC monoclonal anti-Rhesus D (RhD)	Quotient Biodiagnostics		(PA, USA)
PE monoclonal anti-CD47	BD Biosciences		(NJ, USA)
Drabkin's reagent	Sigma Aldrich		(ON, Canada)
Table. Chemicals and reagents used for the grafting of HPG polymers to RBC membrane and their analysis.