Antigener Beskyttet Funktionelle røde blodlegemer ved The Membrane podning af Compact hyperforgrenet Polyglyceroler

Summary

Cellemembranen modifikation af røde blodlegemer (RBC) med hyperbranched polyglycerol (HPG) præsenteres. Modificerede RBC blev karakteriseret ved vandig tofase partitionering, osmotisk skrøbelighed og komplement medieret lyse. Camouflage af overfladeproteiner og antigener blev evalueret under anvendelse af flowcytometri og Micro Typing System (MTS) blod fænotypebestemmelse kort.

Abstract

Røde blodlegemer (RBC) transfusion er afgørende for behandling af en række akutte og kroniske medicinske problemer såsom thalassæmi og seglcelle-anæmi ^1-3. Som følge af tilstedeværelsen af mange antigener på RBC overflade (~ 308 kendte antigener ^4), patienter i kronisk blodtransfusion terapi udvikler alloantistoffer grund af miss match af mindre antigener på transfunderet RBC'er ^{4, 5.} Podning af hydrofile polymerer, såsom polyethylenglycol (PEG) og hyperforgrenede polyglycerol (HPG) danner en udelukkelse lag på RBC membran, der forhindrer vekselvirkning af antistoffer med overfladeantigener uden at påvirke passagen af små molekyler såsom oxygen, glucose og ioner ^3. I dag ingen metoder for frembringelsen af ​​universelle røde blodlegemer donorceller til dels på grund af den overvældende udfordring ved tilstedeværelsen af ​​store antal antigener (protein og kulhydrat baseret) på RBC overflade og ddvikling af sådanne metoder vil forbedre transfusion sikkerhed, og dramatisk forbedre adgangen til og brugen af ​​røde blodlegemer. I denne rapport er de eksperimenter, der bruges til at udvikle antigen beskyttede funktionelle RBC'er af membranen podning af HPG og deres karakterisering præsenteret. HPGs er yderst biokompatible kompakte polymerer ^{6, 7,} og forventes at være placeret i cellen glycocalyx, der omgiver lipidmembran ^{8, 9} og maske RBC overfladeantigener ^{10, 11.}

Protocol

A. hyperforgrenede Polyglycerol Modification (SS-HPG)

1. Sted lyofiliseret HPG 60 kDa (0,5 g, 0,0083 mmol) i en rundbundet kolbe og tørres natten over under vakuum ved 90 ° C.
2. Afkøles kolben til stuetemperatur, og opløs tørrede HPG i vandfrit pyridin (3 ml).
3. At funktionalisere cirka otte hydroxylgrupper på HPG med carboxylgrupper, tilsættes katalytisk mængde dimethylaminopyridin (en dråbe af 5 mg / ml opløsning i pyridin) til HPG opløsningen. Til denne blanding ravsyreanhydrid tilsættes, (0,0067 g, 0,0664 mmol) opløst i 0,5 ml pyridin dråbevis i løbet af 10 min. Omrør blandingen natten over ved stuetemperatur under argon.
4. Udfælde blandingen i 40 ml kold acetone (4 ° C) i et 50 ml centrifugerør og centrifugeres under anvendelse af en Beckman J2-MC-centrifuge ved 27.000 x g i 15 minutter. Supernatanten dekanteres fra, og fjerne resterende acetone ved skylning med argon ved stuetemperatur.
5. For at aktivere carboxyl grupper med succinimidylsuccinat (SS) grupper, opløses carboxyl-funktionaliserede HPG i 3 ml vandfrit DMF. Tilsættes N-hydroxysuccinimid (0,0077 g, 0,0664 mmol) og N, N'-diisopropylcarbodiimid (0,0084 g, 0,0664 mmol) til HPG opløsning og omrør blandingen natten over ved stuetemperatur under argon.
6. Oprense SS-HPG ved præcipitation i kold acetone.
7. Fjerne resterende acetone ved skylning med argon.
8. Bestemme renheden af modificerede HPG og graden af carboxyl-og SS funktionalisering ved proton ⁽¹ H) - NMR-analyse.

B. Fuldblod Indsamling og Adskillelse af røde blodlegemer (RBC)

1. Indsaml fuldblod (40% hæmatokrit, 3 ml) fra sit samtykke raske humane donorer i et citrat Vacutainer rør.
2. Centrifuger citrat røret ved 1000 x g i 4 min.
3. Fjern supernatanten, der indeholder plasma og blodplader, og den mellemliggende buffy coat som indeholder hvide blodlegemer og platelets under anvendelse af en Pasteur-pipette.
4. Overfør pakkede RBCs (80% hæmatokrit, 1,2 ml) i et 12 ml Falcon-centrifugerør, og der tilsættes PBS-buffer (8 ml, pH = 8,0) at vaske RBC'erne.
5. Bland RBC'er ved inversion for at opnå en ensartet celle-fordeling.
6. Centrifuger Falcon-rør ved 1000 x g i 4 minutter, og fjern supernatanten.
7. Vaskes RBC'er med PBS to gange mere ved at gentage trin 5 og 6.
8. Sted pakket-RBC'er (100 ul) i 1,6 ml Eppendorf-rør, og der tilsættes PBS-buffer (300 pi, pH = 8,0) til opnåelse af 20% hæmatokrit RBC'er.

C. HPG Podning til RBC

1. Umiddelbart efter udfældning af modificeret HPG i acetone i trin A6, place SS-HPG (150 mg) i et hætteglas (1 dram), og opløse den i PBS-buffer (300 pi, pH = 8,0).
2. Tilføj SS-HPG polymeropløsning i 20% hæmatokrit vaskes RBC'er til opnåelse af et slutvolumen på 400 gl og SS-HPG koncentration, der ligger i området fra 0,5 mM til 3 mM. For eksempel til fremstilling af RBC'er behandlet med 0,5 mM SS-HPG, fjernes 36 pi PBS fra den vaskede RBC og placere 36 pi SS-HPG polymeropløsningen.
3. Vortex suspensionen forsigtigt og læg Eppendorf-rør på en orbitalryster ved stuetemperatur i 1 time.
4. Centrifuger Eppendorf-rør ved 1000 x g i 4 minutter, og pipetteres ud i supernatanten.
5. Der tilsættes 1 ml PBS at vaske RBC'erne, centrifugeres og fjern supernatanten.
6. Tilsæt 1 ml saltvand og vaskes RBC'er to gange som i trin 5.
7. Tilsæt 300 pi af saltvand til 100 pi pakkede RBCs (80% hæmatokrit) til en slutkoncentration på 20% hæmatokrit.

D. Karakterisering af HPG Modified RBC'er

I. Komplement-medieret lysis

1. Indsamle omkring 8 ml helblod fra sunde humane donorer i BD Vacutainer glas serum rør og lade blodet størkne ved stuetemperatur i 30 minutter.
2. Centrifuger røret ved 2000 x g i 10 minutter og opsamles omkring 3 ml serum.
3. En milliliter af SERUm blev anbragt i et vandbad ved 60 ° C i 30 minutter til fremstilling af varmeinaktiveret serum.
4. Tilsæt 60 gl frisk serum eller varme-inaktiveret serum i et eppendorfrør, der indeholder 60 pi af 20% hæmatokrit HPg modificerede RBC'er eller umodificerede RBC'er.
5. Inkuber RBC'er i 1 time ved 37 ° C.
6. At kvantificere mængden af ​​hæmoglobin i cellesuspensionen, place 5,9 pi 20% hæmatokrit HPG modificerede RBC'er eller umodificerede celler in triplo i 96 brønds plade. Tilsættes 294 ul Drabkin reagens (et reagens, som anvendes til at kvantificere mængden af ​​hæmoglobin spectrophotomerically). Bland celler med Drabkin reagens ved pipettering ind og ud. Måles absorbansen af ​​hæmoglobin cyanoderivative ved 540 nm under anvendelse af Spectra MAX 190 pladelæser.
7. At kvantificere mængden af ​​hæmoglobin i supernatanten, centrifuger cellerne ved 13.000 x g i 1 min. Sted 50 ul supernatant in triplo i en 96 brønds plade. Tilsæt 250 pi af Drabkin reagens. Mix celler med Drabkin reagensved pipettering ind og ud. Måles absorbansen af ​​hæmoglobin cyanoderivative ved 540 nm under anvendelse af Spectra MAX 190 pladelæser.
8. Kvantificere mængden af lyserede celler fra forholdet af hæmoglobin i supernatanten (trin 7) og det samlede hæmoglobin i prøven (trin 6) ^{8, 11, 12.}

II. Det camouflage af større og mindre antigener under anvendelse af MTS-kort

1. Sted 50 pi HPG modificeret RBC (10% hæmatokrit) i et Eppendorf-rør, centrifugeres ved 1.000 x g i 1 minut og fjern supernatanten.
2. Tilsættes 110 pi MTS fortyndingsmiddel til cellepellet og homogeniseres cellesuspensionen ved pipettering ind og ud.
3. Tilsættes 11 gl cellesuspension til hver mini gelsøjle. Undgå at røre ved gelen under tilsætningen.
4. Find MTS kort i en centrifuge kortholderen, og centrifuger ved 156 xg i 6 min.
5. Beskyttelse af overfladeantigener bestemmes ud fra placeringen af ​​RBC i mini gelsøjle, baseret på fremstillingr beskrivelse.

III. Vandige to fase partition målinger

1. Forbered Dextran 500 kDa / PEG 8 kDa to faseseparation system bestående af (5% dextran 500k, 4% PEG 8K, 150 mM NaCI, 10 mM phosphat) ifølge ^13.
2. Centrifuger ved 433 x g i 10 minutter ved stuetemperatur til opnåelse af et tofasesystem (dextran i bunden).
3. De to faser adskilles omhyggeligt.
4. Alikvot 1,0 ml af den øvre PEG-fasen i et mærket rør (med konkav bund), tilsættes 20 ul 20% hæmatokrit HPG modificeret RBC, og bland celler forsigtigt ved at tænde.
5. Tilsæt 0,5 ml af den øvre fase, der indeholder cellerne til 0,5 ml af en nedre fase, og bland systemet forsigtigt ved at tænde.
6. Glasset anbringes på bordet i ~ 2 min for systemet at adskille, og bestemme placeringen af ​​celler i systemet. Lokalisering af RBC'er (i den øvre PEG-fasen, i den nedre dextran fase eller i begge) er funktionen for graden af ​​modifikation og molekylærvægt af HPG.

IV. Osmotiske skrøbelighed målinger

1. Forbered NaCl-opløsninger med koncentrationer, der går fra 0 til 0,9 (w / v)%.
2. Place 0,4 ml NaCl-opløsninger i 1,5 ml Eppendorf-rør.
3. Der tilsættes 20 pi af RBC'er (20% hæmatokrit) ind i NaCl-opløsninger.
4. Bland celler omhyggeligt ved inversion og placere dem i et vandbad ved 37 ° C i 30 min.
5. Suspendér cellerne omhyggeligt ved inversion. Tag 50 pi RBC-suspension og føje den til en 1 ml Drabkin reagens, anbragt i en kuvette. Bland celler med Drabkin reagens ved pipettering ind og ud. Mål absorbansen af ​​hæmoglobin cyanoderivative ved 540 nm med BECKMAN COULTER DU 730 UV / VIS læser.
6. At kvantificere mængden af ​​hæmoglobin i supernatanten, centrifugeres celler ved 1.000 x g i 1 min. Der tilsættes 200 pi supernatant til 1 ml Drabkin reagens i en kuvette. Bland celler med Drabkin reagens ved pipettering ind og ud. Mål absorbansen af ​​hemoglobin cyanoderivative ved 540 nm med BECKMAN COULTER DU 730 UV / VIS læser.
7. Beregne mængden af ​​celler lyseret i forskellige NaCI-opløsning fra forholdet mellem mængden hæmoglobin i supernatanten (trin 6) til den totale mængde hæmoglobin i cellesuspensionen (trin 5).

V. Flowcytometri målinger - Beskyttelse af Rhesus-D (RhD) antigen

1. Tilsættes 5 pi kontrol-eller HPG modificerede RBCs (20% hæmatokrit) i tre eksemplarer med PBS-puffer suppleret med 0,5% BSA i et totalvolumen på 25 ul.
2. Tilsæt 25 ul FITC monoklonalt anti-Rhesus D (RhD) indkøbt fra Quotient Biodiagnostics (PA, USA).
3. Inkuber blandingen i 30 minutter ved 37 ° C i et vandbad.
4. Vaskes blandingen med 1,5 ml PBS-buffer to gange. Centrifuger ved 1.000 x g i 1 minut for at fjerne supernatanten.
5. Suspender RBC'er i 1 ml saltvand, og overfør suspensionen i 4 ml flow BD flowcytometri rør.
6. Analyser bruge FACSCanto II flow cytometeret, erhverve 5.000 begivenheder på RBC styregaten, og bruge hele hændelser til analyse.

VI. Flowcytometri målinger - udtryk af CD47

1. Tilsættes 1,54 pi af kontrol eller HPG modificerede RBCs (20% hæmatokrit) i tre eksemplarer med PBS-puffer suppleret med 0,5% BSA i et totalvolumen på 44 ul.
2. Yderligere 6 pi phycoerythrin (PE)-mærket muse-anti-humane CD47 købt hos BD Biosciences (NJ, USA).
3. Inkuber blandingen i 30 minutter ved 37 ° C i et vandbad.
4. Vaskes blandingen med 1,5 ml PBS-buffer for to gange. Centrifuger ved 1.000 x g i 1 minut for at fjerne supernatanten.
5. Suspender RBC'er i 1 ml saltvand, og passere gennem 26 G 5/8 nål for at minimere celle-sammenklumpning.
6. Overfør suspensionen i 4 ml flow BD flowcytometri rør.
7. Analyser bruge FACSCanto II flowcytometer, erhverve 10.000 begivenheder på RBC styregaten.

Representative Results

Camouflere af Rhesus D antigen og CD47 RBC overfladeprotein blev kvantificeret ved strømningscytometri under anvendelse af fluorescerende mærkede monoklonale antistoffer, og et repræsentativt resultat er vist i figur 1.. Ved HPG-podede RBCs (grå), intensiteten af ​​signalet faldt (top forskudt mod venstre), sammenlignet med kontrollen RBC (røde og grønne), hvilket indikerer en reduktion i binding til antistoffer mod celleoverflade som angiver maskering af overfladeproteiner .

Fig. 1. Evaluering af camouflage af overfladeantigener og proteiner ved anvendelse af flowcytometri. A) Rhesus D (RhD) beskyttelse: Sort skraverede top repræsenterer den negative kontrol (ikke-modificerede RBC'er behandlet med PE-mærket IgG1), grøn top repræsenterer positive control (ikke-modificerede RBC'er behandlet med anti-RhD fluorescerende antistof), og den grå peak repræsenterer HPg modificerede RBC'er behandlet med den samme mængde anti-RhD fluorescerende antistof. B) CD47: Sort skraverede top repræsenterer den negative kontrol (ikke-modificerede RBC'er behandlet med PE-mærket IgG1), den røde peak repræsenterer den positive kontrol (ikke-modificerede RBC'er behandlet med anti-CD47 fluorescerende antistof), og den grå peak repræsenterer HPG modificerede RBC'er behandlet med den samme mængde af anti-CD47 fluorescerende antistof. Klik her for at se større figur .

Discussion

Universal donor RBC har et stort potentiale i at øge blod tilgængelighed og sikkerhed for blodtransfusion terapi. RBC betragtes også lovende drug delivery køretøjer på grund af deres lange cirkulation og iboende biokompatibilitet ^{14, 15.} Forsøg i dette papir evaluere in vitro-egenskaber HPG modificerede RBC'er. Den in vitro-egenskaber og in vivo cirkulation af hpG modificerede RBCs er blevet undersøgt i vores gruppe for nylig ^{8, 11.} Opdelingen af RBC'er i Dextran500K/PEG8K vandigt tofasesystem, suppleret med NaCl og natriumphosphat, afhænger af erythrocyt overfladeladning og overfladeglycoprotein sammensætning ^16. Afhængig af omfanget af RBC glycocalyx modifikation med HPGs, tendens modificerede RBC til partition fra den nedre dextran til den øvre PEG-fasen. Det tofasede system tilvejebringer en let vurdering af omfanget af RBC overflademodifikation. Lysis of RBC'er i autolog serum er vigtig test for at undersøge, hvorvidt HPG modificerede RBCs udløser komplementaktivering, efter indførelsen af nye materialer til celler og biologiske overflader gør dem fremmede og underlagt immunsystem medieret lyse og clearance ^17. Den osmotiske skrøbelighed forsøget, på den anden side angiver, om mekaniske egenskaber og deformerbarheden af ​​RBC membranen er blevet kompromitteret som følge af HPG podning. Deformerbarheden af RBC'er er vigtig for den fysiologiske funktion af _O2 levering til forskellige dele af kroppen. I dette forsøg modificerede RBC'er udsættes for deformation stress ved behandling med forskellige koncentrationer af NaCI og kvantificering procent af lyserede celler.

Flowcytometri anvendes til at evaluere omfanget af overfladeantigen og overfladeprotein beskyttelse (fig. 1) ved omsætning af et særligt antigen på overfladen af RBC med dens tilsvarende fluorescerende-labelled antistof. Omfanget af Rhesus D antigen beskyttelse bedømmes ved anvendelse af flowcytometri. Maskering af antigener fremgår af faldet i antistofbinding til RBC'erne. Rhesus D antigen maskering evalueres også ved MTS-kort. MTS kort er meget udbredt i hæmatologi laboratorier på hospitaler for fænotypebestemmelse af røde blodlegemer. For eksempel når A-gruppen RBC ligger i A-type MTS card celler agglutinere som følge af reaktion med det tilsvarende monoklonale antistof. Men B-gruppen blodet ikke agglutinat og bevæger sig til bunden af ​​mini gel. Begrebet agglutination blev anvendt til at evaluere det beskyttelsesniveau, der HPG podning tilvejebringer for RBC'er. HPG-podede RBC'er gennemtrænger mini gelsøjle, afhængigt af niveauet af overfladeantigen beskyttelse.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glycidol	Sigma Aldrich		(ON, Canada)
Trimethylolpropane	Fluka		(ON, Canada)
Potassium methylate	Sigma Aldrich		(ON, Canada)
Anhydrous pyridine	Sigma Aldrich		(ON, Canada)
4-Dimethylaminopyridine	Sigma Aldrich		(ON, Canada)
Succinic anhydride	Sigma Aldrich		(ON, Canada)
Acetone	Fisher Scientific		(ON, Canada)
Anhydrous dimethyl formamide	Sigma Aldrich		(ON, Canada)
N-Hydroxysuccinimide	Sigma Aldrich		(ON, Canada)
N,N'-Diisopropylcarbodiimide	Sigma Aldrich		(ON, Canada)
MTS cards			Micro Typing System (MTS) cards (FL, USA)
Dextran 500 kDa	Pharmacia Fine Chemicals		(Sweden)
PEG 8 kDa	Sigma Aldrich		(ON, Canada)
FITC monoclonal anti-Rhesus D (RhD)	Quotient Biodiagnostics		(PA, USA)
PE monoclonal anti-CD47	BD Biosciences		(NJ, USA)
Drabkin's reagent	Sigma Aldrich		(ON, Canada)
Table. Chemicals and reagents used for the grafting of HPG polymers to RBC membrane and their analysis.