Antigene geschützten funktionellen Red Blood Cells durch die Membran Pfropfung von Compact hyperverzweigten Polyglycerinen

Summary

Die Zellmembran Modifikation von roten Blutkörperchen (Erythrozyten) mit hyperverzweigten Polyglycerin (HPG) präsentiert wird. Geändert RBCs wurden durch wässrige Zwei-Phasen-Partitionierung, osmotische Fragilität und Komplement-vermittelte Lyse gekennzeichnet. Die Tarnung der Oberflächenproteine ​​und Antigene wurde anhand der Durchflusszytometrie und Micro Typing System (MTS) Blut Phänotypisierung Karten.

Abstract

Roten Blutkörperchen (RBC) Transfusion ist für die Behandlung einer Reihe von akuten und chronischen medizinischen Problemen wie Thalassämie major und Sichelzellenanämie ^1-3. Aufgrund des Vorhandenseins der Vielzahl von Antigenen auf der RBC Oberfläche (~ 308 bekannten Antigene ^4), Patienten im chronischen Bluttransfusion Therapie entwickeln Alloantikörpern aufgrund der Übereinstimmung von untergeordneter Fehltreffer Antigenen auf Erythrozyten transfundiert ^{4, 5.} Pfropfung von hydrophilen Polymeren, wie Polyethylenglykol (PEG) und hyperverzweigten Polyglycerin (HPG) einen Ausschluss Schicht auf RBC Membran, die die Wechselwirkung der Antikörper mit Oberflächenantigenen ohne Beeinträchtigung verhindert den Durchtritt von kleinen Molekülen wie Sauerstoff, Glukose und Ionen ^3. Gegenwärtig keine Methode ist für die Erzeugung von universellen Erythrozyten Donorzellen zum Teil wegen der großen Herausforderung durch das Vorhandensein einer großen Anzahl von Antigenen (Protein-und Kohlenhydrat-Basis) auf der Oberfläche und der RBC d vorgestelltntwicklung solcher Methoden wird erheblich zur Verbesserung der Transfusion Sicherheit und dramatisch verbessern die Verfügbarkeit und Nutzung von RBC. In diesem Bericht sind die Versuche, die verwendet werden, um Antigen geschützten funktionellen RBCs durch die Membran Pfropfung von HPG und deren Charakterisierung zu entwickeln vorgestellt. HPGs sind hoch biokompatibel kompakten Polymeren ^{6, 7,} und werden voraussichtlich innerhalb der Zelle Glykokalyx, die die Lipid-Membran ^{8, 9} und Maske RBC Oberflächenantigene ^{10, 11} umgibt befinden.

Protocol

A. Hyperverzweigte Polyglycerin Modification (SS-HPG)

1. Ort lyophilisiert HPG 60 kDa (0,5 g, 0,0083 mmol) in einem Rundkolben und trocknen über Nacht unter Vakuum bei 90 ° C.
2. Gekühlt wird der Kolben auf Raumtemperatur und lösen das getrocknete HPG in wasserfreiem Pyridin (3 ml).
3. Bis etwa acht Hydroxylgruppen auf HPG mit Carboxylgruppen funktionalisiert, fügen katalytischen Menge von Dimethylaminopyridin (ein Tropfen von 5 mg / ml Lösung in Pyridin) zu der HPG Lösung. Zu dieser Mischung hinzuzufügen Bernsteinsäureanhydrid, (0,0067 g, 0,0664 mmol), gelöst in 0,5 ml Pyridin tropfenweise über 10 min. Rühren Sie die Mischung über Nacht bei Raumtemperatur unter Argon.
4. Ausfällen des Gemisches in 40 ml kaltem Aceton (4 ° C) in einem 50 ml-Zentrifugenröhrchen und zentrifugieren mit einem Beckman J2-MC-Zentrifuge bei 27.000 g für 15 min. Den Überstand umfüllen, und entfernen Sie Restaceton durch Spülen mit Argon bei Raumtemperatur.
5. Um die Aktivierung Carboxyl Gruppen mit Succinimidylsuccinat (SS)-Gruppen, löst den Carboxyl-funktionalisierten HPG in 3 ml wasserfreiem DMF. Add N-Hydroxysuccinimid (0,0077 g, 0,0664 mmol) und N, N'-Diisopropylcarbodiimid (0,0084 g, 0,0664 mmol) der HPG-Lösung und rühren Sie die Mischung über Nacht bei Raumtemperatur unter Argon.
6. Reinigen die SS-HPG durch Fällung in kaltem Aceton.
7. Entfernen Restaceton durch Spülen mit Argon.
8. Bestimmen die Reinheit von modifizierten HPG und den Grad der Carboxyl-und SS Funktionalisierung durch Proton ⁽¹ H) - NMR-Analyse.

B. Vollblut Sammlung und Trennung von Red Blood Cells (RBC)

1. Vollblut (40% Hämatokrit, 3 ml) von zugestimmt gesunden menschlichen Spendern in ein Citrat Vacutainer-Röhrchen.
2. Zentrifugieren Citrat Röhrchen bei 1.000 xg für 4 min.
3. Entfernen Sie den Überstand, Plasma und Blutplättchen enthält, und die Zwischen-Buffy-Coat, der weißen Blutkörperchen und platele enthältts mit einer Pasteurpipette.
4. Übertragen aus roten Blutkörperchen (80% Hämatokrit, 1,2 ml) in ein 12 ml-Falcon-Zentrifugenrohr und fügen PBS-Puffer (8 ml, pH = 8,0), um Erythrozyten zu waschen.
5. Mix RBCs durch Inversion einheitlichen Zellverteilung erhalten.
6. Zentrifugieren Falcon-Röhrchen bei 1.000 xg für 4 min, und entfernen Sie den Überstand.
7. Waschen mit PBS RBCs zwei weitere Male durch Wiederholen der Schritte 5 und 6.
8. Ort gepackte Erythrozyten (100 ul) in 1,6 ml Eppendorf-Röhrchen, und fügen PBS-Puffer (300 ul, pH = 8,0) zu 20% Hämatokrit RBCs erhalten.

C. HPG Pfropfen zu RBCs

1. Unmittelbar nach der Fällung von modifizierten HPG in Aceton in Schritt A6 Ort SS-HPG (150 mg) in einem Glasfläschchen (1 dram) und löst ihn in PBS-Puffer (300 ul, pH = 8,0).
2. Hinzufügen SS-HPG Polymerlösung in 20% Hämatokrit gewaschen RBCs, um ein Endvolumen von 400 ul und SS-HPG Konzentration, die von 0,5 mm bis 3 mm reicht erhalten. Zum Beispiel zur Vorbereitung RBCs mit 0,5 mM behandelt SS-HPG, entfernen Sie 36 ul PBS aus der gewaschenen RBC und legen 36 ul der SS-HPG Polymerlösung.
3. Vortex die Aussetzung vorsichtig und legen Sie die Eppendorf-Röhrchen auf einem Schüttler bei Raumtemperatur für 1 Stunde.
4. Zentrifugieren Eppendorf-Röhrchen bei 1.000 xg für 4 min, und Pipette aus dem Überstand.
5. 1 ml PBS, um Erythrozyten zu waschen, zentrifugieren und den Überstand.
6. 1 ml Kochsalzlösung und waschen RBCs zweimal wie in Schritt 5.
7. Fügen Sie 300 ul Kochsalzlösung zu 100 ul roten Blutkörperchen (80% Hämatokrit) bis zu einer Endkonzentration von 20% Hämatokrit.

D. Charakterisierung von HPG Modified RBCs

I. Komplement-vermittelte Lyse

1. Sammle rund 8 ml Vollblut von gesunden menschlichen Spendern in BD Vacutainer Glas Serum-Röhrchen, und erlauben die Blutgerinnung bei Raumtemperatur für 30 min.
2. Zentrifugieren bei 2.000 xg für 10 min und sammeln rund 3 ml Serum.
3. Ein Milliliter der serum wurde in einem Wasserbad bei 60 ° C für 30 min bis hitzeinaktiviertes Serum vorzubereiten platziert.
4. Fügen Sie 60 ul frisches Serum oder Hitze inaktivierten Serum in ein Eppendorf-Röhrchen, die 60 ul 20% Hämatokrit HPG veränderten Erythrozyten oder unmodifizierte RBCs enthalten.
5. Inkubieren RBCs für 1 Stunde bei 37 ° C.
6. Um die Menge an Hämoglobin in der Zellsuspension, erfolgt 5,9 ul 20% Hämatokrit von HPG modifizierten oder unmodifizierten RBCs Zellen in dreifacher Ausfertigung in 96-Well-Platte zu quantifizieren. Hinzufügen 294 ul Drabkin-Reagenz (ein Reagenz, mit dem die Menge an Hämoglobin spectrophotomerically quantifizieren ist). Mix-Zellen mit Drabkin-Reagenz durch Pipettieren in und out. Messen Sie die Absorption des Hämoglobins cyanoderivative bei 540 nm mit SPECTRA MAX 190 Plattenlesegerät.
7. Um die Menge an Hämoglobin im Überstand quantifizieren, zentrifugieren Zellen bei 13.000 × g für 1 min. Platz 50 ul des Überstandes in dreifacher Ausfertigung in einer 96-Well-Platte. Fügen Sie 250 ul Drabkin-Reagenz. Mischung Zellen mit Drabkin-Reagenzdurch Pipettieren in und out. Messen Sie die Absorption des Hämoglobins cyanoderivative bei 540 nm mit SPECTRA MAX 190 Plattenlesegerät.
8. Quantifizierung der Menge an lysierten Zellen aus dem Verhältnis von Hämoglobin im Überstand (Schritt 7) und dem Gesamt-Hämoglobin in der Probe (Schritt 6) ^{8, 11, 12.}

II. Die Tarnung von Dur und Moll Antigene mit MTS-Karten

1. Platz 50 ul der HPG modifizierte RBC (10% Hämatokrit) in ein Eppendorf-Röhrchen, Zentrifuge bei 1.000 xg für 1 min, und entfernen Sie den Überstand.
2. Fügen Sie 110 ul MTS Verdünnungsmittel zu dem Zellpellet und homogenisieren die Zellsuspension durch Pipettieren in und out.
3. Fügen Sie 11 ul der Zellsuspension in jedes Mini-Gel-Säule. Berühren Sie das Gel während der Zugabe.
4. Suchen Sie MTS-Karten in einer Zentrifuge Kartenhalter, und zentrifugieren bei 156 xg für 6 min.
5. Schutz der Oberflächenantigene von dem Standort der RBC in der Mini-Gel-Säule bestimmt, bezogen auf die Herstellungr Beschreibung.

III. Wässrige Zweiphasen-Partition Messungen

1. Planen Dextran 500 kDa / PEG 8 kDa Zweiphasentrennung System (5% Dextran 500k, 4% PEG 8K, 150 mM NaCl, 10 mM Phosphat) nach Anspruch ¹³ besteht.
2. Zentrifuge bei 433 × g für 10 min bei Raumtemperatur, um eine Zwei-Phasen-System (Dextran im Boden) zu erhalten.
3. Die zwei Phasen sorgfältig.
4. Aliquot 1,0 ml der oberen PEG-Phase in einem markierten Rohr (mit konkaven unten), mit 20 ul 20% Hämatokrit HPG modifizierte RBC und mischen Zellen vorsichtig durch Ausklopfen.
5. 0,5 ml der Oberphase, die Zellen zu 0,5 ml einer unteren Phase enthalten, und Mischen des Systems sanft durch flicking.
6. Das Röhrchen wird auf der Bank für ca. 2 Min. für das System zu trennen, und den Ort von Zellen in dem System. Lokalisierung von RBCs (in der oberen PEG-Phase, im unteren Dextran-Phase oder in beide) Funktion, um den Grad der Modifizierung und molekularenGewicht der HPG.

IV. Osmotische Fragilität Messungen

1. Planen NaCl-Lösungen mit Konzentrationen, die von 0 bis 0,9 (w / v)% liegen.
2. Platz 0,4 ml NaCl-Lösungen in 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen.
3. Fügen Sie 20 ul Erythrozyten (20% Hämatokrit) in die NaCl-Lösungen.
4. Mischung Zellen sorgfältig durch Inversion und sie in einem Wasserbad bei 37 ° C für 30 min.
5. Suspend-Zellen vorsichtig durch Inversion. Nehmen Sie 50 ul RBC-Suspension und fügen Sie ihn in eine 1 ml Drabkin-Reagenz in einer Küvette. Mix-Zellen mit Drabkin-Reagenz durch Pipettieren in und out. Messen Sie die Absorption des Hämoglobins cyanoderivative bei 540 nm mit BECKMAN COULTER DU 730 UV / VIS-Reader.
6. Um die Menge an Hämoglobin im Überstand quantifizieren, zentrifugieren Zellen bei 1.000 × g für 1 min. Gib 200 ul des Überstandes auf 1 ml Drabkin-Reagens in einer Küvette. Mix-Zellen mit Drabkin-Reagenz durch Pipettieren in und out. Messen Sie die Absorption der hemoglobin cyanoderivative bei 540 nm mit BECKMAN COULTER DU 730 UV / VIS-Reader.
7. Berechnen der Menge an Zellen in verschiedenen NaCl-Lösung aus dem Verhältnis der Menge Hämoglobin im Überstand (Schritt 6) lysiert, um die Gesamtmenge von Hämoglobin in der Zellsuspension (Schritt 5).

V. Durchflusszytometrie Messungen - Schutz der Rhesus-D (RhD)-Antigen

1. Add 5 ul der Kontrolle oder HPG veränderten Erythrozyten (20% Hämatokrit) in dreifacher Ausfertigung an PBS-Puffer mit 0,5% BSA auf ein Gesamtvolumen von 25 ul ergänzt.
2. Fügen Sie 25 ul FITC monoklonalen Anti-Rhesus D (RhD) aus Quotient Biodiagnostics (PA, USA) erworben.
3. Inkubieren des Gemisches für 30 min bei 37 ° C im Wasserbad.
4. Das Gemisch wird mit 1,5 ml PBS-Puffer zweimal. Zentrifugieren bei 1000 × g für 1 Minute, um den Überstand zu entfernen.
5. Suspend RBCs in 1 ml Kochsalzlösung, und übertragen Sie die Suspension in 4 ml Flow BD Durchflusszytometrie Röhre.
6. Analysieren mit FACSCanto II flow Zytometer Erwerb 5.000 Veranstaltungen auf der RBC Steuergate, und verwenden Sie ganze Veranstaltungen für die Analyse.

VI. Durchflusszytometrie Messungen - Expression von CD47

1. Hinzufügen 1,54 ul Steuerung oder HPG modifizierten RBCs (20% Hämatokrit) fach an PBS-Puffer mit 0,5% BSA auf ein Gesamtvolumen von 44 ul ergänzt.
2. Fügen Sie 6 ul Phycoerythrin (PE) markierten Maus anti-human CD47 von BD Biosciences (NJ, USA) erworben.
3. Inkubieren des Gemisches für 30 min bei 37 ° C im Wasserbad.
4. Das Gemisch wird mit 1,5 ml PBS-Puffer zweimal. Zentrifugieren bei 1000 × g für 1 Minute, um den Überstand zu entfernen.
5. Suspend RBCs in 1 ml Kochsalzlösung, und durch 26 G 5/8 Nadel Zelle Verklumpung zu minimieren.
6. Übertragen Sie die Suspension in 4 ml Flow BD Durchflusszytometrie Röhre.
7. Analysieren mit FACSCanto II Durchflusszytometer, Erwerb 10.000 Ereignisse auf der RBC Steuergate.

Representative Results

Camouflage von Rhesus D-Antigen und CD47 RBC Oberflächenprotein wurden mittels Durchflusszytometrie mit fluoreszenzmarkierten monoklonalen Antikörpern quantifiziert und ein repräsentatives Ergebnis ist in Abbildung 1 dargestellt. Im Falle der HPG-gepfropften RBCs (grau), verringerte sich die Intensität des Signals (Peak verschoben nach links) im Vergleich zur Kontrollgruppe RBCs (rot und grün), die eine Reduktion der Bindung an Antikörper gegen Zelloberflächen, die die Maskierung der Oberflächenproteine ​​anzugeben .

Abbildung 1. Auswertung der Tarnung von Oberflächen-Antigene und Proteine ​​mittels Durchflusszytometrie. A) Rhesus D (RhD) Schutz: Black schattigen Peak repräsentiert die negative Kontrolle (nicht-modifizierten RBCs mit PE-markierten IgG1 behandelt), stellen die grüne Spitze die positive Zusammenarbeitntrol (nicht modifizierten RBCs mit Anti-RhD Fluoreszenz-Antikörper behandelt wurden), und das graue Peak repräsentiert HPG modifizierten RBCs mit der gleichen Menge an Anti-RhD Fluoreszenz-Antikörper behandelt. B) CD47: Schwarz schattierten Peak repräsentiert die Negativ-Kontrolle (nicht-modifizierten RBCs mit PE-markiertem IgG1 behandelt), repräsentieren die rote Spitzenwert der positiven Kontrolle (nicht-modifizierten RBCs mit Anti-CD47-Antikörper behandelt fluoreszierenden), und der graue Peak repräsentiert HPG veränderten Erythrozyten mit der gleichen Menge von Anti-CD47 Fluoreszenz-Antikörper behandelt. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .

Discussion

Universal-Spender RBCs haben ein großes Potenzial bei der Verbesserung der Blut-Verfügbarkeit und Sicherheit für Bluttransfusion Therapie. Erythrozyten sind auch vielversprechende Drug-Delivery-Fahrzeuge aufgrund ihrer langen Kreislauf und inhärente Biokompatibilität ^{14, 15} berücksichtigt. Experimente in diesem Papier vorgestellten Auswertung der in vitro Eigenschaften der HPG veränderten Erythrozyten. Die in vitro-Eigenschaften und in vivo Auflage von HPG veränderten Erythrozyten haben in unserer Gruppe wurde kürzlich ^{8, 11} untersucht. Die Partition von RBCs in Dextran500K/PEG8K wässrigen Zweiphasensystem, mit NaCl und Natriumphosphat ergänzt, hängt von der Erythrozyten Oberflächenladung und auf Oberflächenglykoprotein Zusammensetzung ^16. Je nach Ausmaß der RBC Glykocalix Modifizierung mit HPGs neigen modifizierten RBCs zu partitionieren von der unteren zur oberen Dextran PEG-Phase. Das zweiphasige System bietet eine einfache Bewertung des Ausmaßes von RBC Oberflächenmodifikation. Lysis of RBCs in autologes Serum ist bezeichnend Test zu untersuchen, ob HPG veränderten Erythrozyten löst Komplementaktivierung, da die Einführung neuer Materialien, um Zellen und biologischen Oberflächen macht sie ausländische und vorbehaltlich Immunsystem vermittelte Lyse und die Clearance ^17. Die osmotischen Fragilität Experiment auf der anderen Seite, zeigt an, ob die mechanischen Eigenschaften und Verformbarkeit der RBC-Membran aufgrund der Pfropfung HPG beeinträchtigt wurde. Die Verformbarkeit von Erythrozyten ist für die physiologische Funktion von O ₂ Lieferung an verschiedenen Teilen des Körpers wichtig. In diesem Experiment modifiziert RBCs werden Verformungsspannung durch Behandlung mit verschiedenen Konzentrationen von NaCl, und Quantifizieren Prozent der lysierten Zellen ausgesetzt.

Durchflusszytometrie wird verwendet, um das Ausmaß der Oberflächenantigen und Oberflächenprotein Schutz (Abbildung 1) durch Umsetzen einer bestimmten Antigen auf der Oberfläche von Erythrozyten mit seinem entsprechenden fluoreszierenden-la evaluierenbelled Antikörper. Das Ausmaß der Rhesus-D-Antigen-Schutz ausgewertet mittels Durchflusszytometrie. Die Maskierung von Antigenen ergibt sich aus der Abnahme der Bindung der Antikörper an den RBCs. Rhesus D-Antigen Maskierung wird auch durch MTS-Karten ausgewertet. MTS-Karten sind weit verbreitet in der Hämatologie Labors in Krankenhäusern für Phänotypisierung von Erythrozyten verwendet. Wenn zum Beispiel A-Gruppe in A RBC-Typ MTS-Karte befindet, agglutinieren Zellen als Ergebnis der Reaktion mit dem entsprechenden monoklonalen Antikörpers. Allerdings ist der B-Gruppe Blut nicht Agglutinat und fährt auf dem Boden des Mini-Gel. Das Konzept der Agglutination wurde verwendet, um das Niveau des Schutzes daß HPG Pfropfung bereitstellt RBCs auszuwerten. HPG-gepfropften RBCs durchdringt die Mini-Gel-Säule, je nach Grad der Oberflächen-Antigen tragen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glycidol	Sigma Aldrich		(ON, Canada)
Trimethylolpropane	Fluka		(ON, Canada)
Potassium methylate	Sigma Aldrich		(ON, Canada)
Anhydrous pyridine	Sigma Aldrich		(ON, Canada)
4-Dimethylaminopyridine	Sigma Aldrich		(ON, Canada)
Succinic anhydride	Sigma Aldrich		(ON, Canada)
Acetone	Fisher Scientific		(ON, Canada)
Anhydrous dimethyl formamide	Sigma Aldrich		(ON, Canada)
N-Hydroxysuccinimide	Sigma Aldrich		(ON, Canada)
N,N'-Diisopropylcarbodiimide	Sigma Aldrich		(ON, Canada)
MTS cards			Micro Typing System (MTS) cards (FL, USA)
Dextran 500 kDa	Pharmacia Fine Chemicals		(Sweden)
PEG 8 kDa	Sigma Aldrich		(ON, Canada)
FITC monoclonal anti-Rhesus D (RhD)	Quotient Biodiagnostics		(PA, USA)
PE monoclonal anti-CD47	BD Biosciences		(NJ, USA)
Drabkin's reagent	Sigma Aldrich		(ON, Canada)
Table. Chemicals and reagents used for the grafting of HPG polymers to RBC membrane and their analysis.