אנטיגנים מוגנים תאי דם אדומים פונקציונליים על ידי ההשתלה של ממברנה Polyglycerols Hyperbranched הקומפקטי

Summary

שינוי קרום התא של תאי דם אדומים (RBCs) עם polyglycerol hyperbranched (HPG) מוצג. RBCs השתנה התאפיינו מחיצות מימיות 2 שלב, שבריריות האוסמוטי ותמוגה משלים מתווכת. ההסוואה של חלבונים על פני שטח ואנטיגנים הוערכה באמצעות cytometry הזרימה ומערכת מייקר הקלדה (MTS) כרטיסי phenotyping דם.

Abstract

תא דם אדום עירוי (RBC) הוא חיוני לטיפול במספר בעיות אקוטיות וכרוניות רפואיות כגון תלסמיה ואנמיה חרמשית הגדול אנמיה ^1-3. בשל הנוכחות של מספר רב של אנטיגנים על פני שטח RBC (~ 308 אנטיגנים ידועים ^4), חולים בטיפול עירוי הדם הכרוני לפתח alloantibodies בשל ההתאמה מתגעגעת של אנטיגנים קטין על RBCs עירוי ^{4, 5.} השתלה של פולימרים הידרופילי כגון פוליאתילן גליקול (PEG) וpolyglycerol hyperbranched (HPG) יוצרת שכבת הדרה על קרום RBC שמונעת את האינטראקציה של נוגדנים עם אנטיגנים על פני שטח מבלי להשפיע על המעבר של מולקולות קטנות כמו חמצן, גלוקוז, ויונים ^3. בשלב הנוכחי אין שיטה זמינה עבור הדור של תאי תורם אוניברסליים דם אדומים בחלקו בגלל האתגר המרתיע הוצג על ידי הנוכחות של מספר רב של אנטיגנים (חלבונים ופחמימות המבוססות) על פני שטח RBC ודevelopment שיטות כאלה באופן משמעותי לשפר את בטיחות עירוי, ולשפר באופן דרמטי את הזמינות והשימוש בRBCs. בדוח זה, בניסויים המשמשים לפיתוח RBCs הפונקציונלי המוגן אנטיגן ידי קרום השתלת HPG ואפיונם מוצגים. HPGs מאוד הם ביולוגיים פולימרים ^{6 קומפקטיים, 7,} והם צפויים להיות ממוקמים בתוך התא glycocalyx שמקיף את הקרום השומני ^{8, 9} ואנטיגנים מסכת RBC שטח ^{10, 11.}

Protocol

שינוי Polyglycerol Hyperbranched א (SS-HPG)

1. מקום lyophilized HPG 60 kDa (0.5 גרם, 0.0083 mmol) בבקבוקון תחתית עגול ולייבש אותו בלילה תחת ואקום ב 90 ° C.
2. מכניס למקרר הבקבוק לטמפרטורת חדר, ולפזר את HPG המיובש בפירידין הנטול מים (3 מ"ל).
3. לfunctionalize כ 8 קבוצות הידרוקסיל בHPG עם קבוצות carboxyl, להוסיף כמות קטליטי של dimethylaminopyridine (טיפה אחת של פתרון מ"ל 5 מ"ג / בפירידין) לפתרון HPG. לתערובת זו, מוסיף אנהידריד succinic, (0.0067 גרם, 0.0664 מילימול) מומס בטיפת 0.5 מ"ל פירידין חכמה מעל 10 דקות. מערבב את התערובת למשך לילה בטמפרטורת חדר תחת ארגון.
4. תזרזו את התערובת ב40 מ"ל של אצטון הקר (4 ° C) בצינור צנטריפוגה 50 מ"ל, והחובצה באמצעות צנטריפוגות קמן J2-MC ב27000 XG במשך 15 דקות. למזוג supernatant, ולהסיר אצטון השיורי על ידי שטיפה עם ארגון בטמפרטורת חדר.
5. כדי להפעיל Carboxyקבוצות הליטר עם קבוצות succinimidyl succinate (SS), לפזר HPG carboxyl-הפונקציונלי ב3 מ"ל של DMF נטול מים. הוסף N-hydroxysuccinimide (0.0077 גרם, 0.0664 mmol) ונ ', ניצבת בין diisopropylcarbodiimide (0.0084 גרם, 0.0664 mmol) לפתרון HPG ומערבב את התערובת למשך לילה בטמפרטורת חדר תחת ארגון.
6. לטהר SS-HPG ידי משקעים באצטון הקר.
7. הסר אצטון השיורי על ידי שטיפה עם ארגון.
8. לקבוע את טוהר HPG השונה ומידת functionalization carboxyl ואס על ידי פרוטון ⁽¹ H) - ניתוח NMR.

אוסף B. כל דם והפרדה של תאי דם אדומים (RBCs)

1. לאסוף את כל דם (המטוקריט 40%, 3 מ"ל) מהסכים תורמי אדם בריאים לתוך צינור vacutainer ציטראט.
2. צנטריפוגה שפופרת ציטראט ב1000 XG במשך 4 דקות.
3. הסר את supernatant המכיל פלזמה וטסיות דם, ומעייל ביניים אפים המכיל תאי דם לבנים וplatelets באמצעות פסטר פיפטה.
4. העברת RBCs הארוז (80% המטוקריט, 1.2 מ"ל) לתוך צינור צנטריפוגה 12 מ"ל פלקון, ולהוסיף PBS חיץ (8 מ"ל, pH = 8.0) לשטוף RBCs.
5. מערבב על ידי היפוך RBCs להשיג חלוקת תא אחידה.
6. צנטריפוגה צינור פלקון ב1000 XG במשך 4 דקות, ולהסיר את supernatant.
7. לשטוף עם PBS RBCs עוד פעמים על ידי חזרה על שלבים 5 ו 6.
8. מקום גדוש RBCs (100 μl) בצינור 1.6 מ"ל אפנדורף, ולהוסיף PBS חיץ (300 μl, pH = 8.0) כדי להשיג RBCs המטוקריט 20%.

ג HPG השתלה לRBCs

1. מייד לאחר משקעים של HPG השונים באצטון בA6 צעד, מקום SS-HPG (150 מ"ג) בבקבוקון זכוכית (DRAM 1), ולפזר אותו בPBS חיץ (300 μl, pH = 8.0).
2. הוסף פולימר פתרון SS-HPG להמטוקריט 20% שטף RBCs להשיג נפח סופי של 400 μl וריכוז SS-HPG שנע בין 0.5 מ"מ עד 3 מ"מ. לדוגמה להכין RBCs טופל 0.5 מ"מ ס"סHPG, להסיר 36 μl של PBS מRBC השטוף ומניח 36 μl של פולימר פתרון SS-HPG.
3. מערבולת ההשעיה בעדינות ומניח את צינורות Eppendorf בהקפה ייקרה בטמפרטורת חדר למשך השעה 1.
4. צנטריפוגה אפנדורף הצינורות ב1000 XG במשך 4 דקות, ופיפטה את supernatant.
5. הוסף 1 מ"ל של PBS לשטוף RBCs, צנטריפוגה ולהסיר את supernatant.
6. הוסף מלח 1 מ"ל ולשטוף RBCs כפליים בשלב 5.
7. הוסף 300 μl של מי מלח עד 100 μl של RBCs הארוז (80% המטוקריט) לריכוז סופי של המטוקריט של 20%.

אפיון ד HPG השינוי RBCs

תמוגה תיווך משלים I.

1. לאסוף סביב 8 מ"ל של דם מלא מתורמים אנושיים בריאים לתוך צינור זכוכית BD vacutainer סרום, ולאפשר לקרישת הדם בטמפרטורת חדר למשך 30 דקות.
2. צנטריפוגה הצינור ב2000 XG למשך 10 דקות ולאסוף סביב 3 מ"ל של נסיוב.
3. מ"ל אחד seruמ 'הוצב באמבט מים ב 60 ° C למשך 30 דקות להכין סרום מומת חום.
4. הוסף 60 μl של סרום טרי או סרום מומת חום לתוך צינור אפנדורף שמכיל 60 μl של RBCs 20% המטוקריט HPG שונה או RBCs ללא שינוי.
5. דגירת RBCs לשעה 1 ב 37 ° C.
6. כדי לכמת את כמות ההמוגלובין בהשעית התא, המקום של 5.9 μl המטוקריט 20% מHPG RBCs שונה או תאים ללא שינוי בשלושה עותקים בצלחת גם 96. הוסף 294 μl של ריאגנט של דרבקין (ריאגנט המשמש כדי לכמת את הכמות של המוגלובין spectrophotomerically). מערבב תאים עם המגיב של דרבקין על ידי pipetting פנימה והחוצה. מדוד את ספיגת cyanoderivative ההמוגלובין ב540 ננומטר באמצעות קורא צלחת SPECTRA MAX 190.
7. כדי לכמת את כמות ההמוגלובין בsupernatant, צנטריפוגה תאים ב XG 13000 דקות ל1. מקום 50 μl של supernatant בשלושה עותקים בצלחת גם 96. הוסף 250 μl של ריאגנט של דרבקין. תאים לערבב עם ריאגנט של דרבקיןעל ידי pipetting פנימה והחוצה. מדוד את ספיגת cyanoderivative ההמוגלובין ב540 ננומטר באמצעות קורא צלחת SPECTRA MAX 190.
8. לכמת את כמות תאי lysed מהיחס של המוגלובין בsupernatant (שלב 7) והמוגלובין הכולל במדגם (שלב 6) ^{8, 11, 12.}

השני. ההסוואה של אנטיגנים ראשיים ומשניות באמצעות MTS כרטיסים

1. 50 μl מקום HPG modified RBC (10% המטוקריט) בצינור אפנדורף, צנטריפוגה XG ב 1000 למשך דקת 1, ולהסיר את supernatant.
2. הוסף 110 μl של MTS diluent לתא הכדורי והומוגני השעית התא על ידי pipetting פנימה והחוצה.
3. הוסף 11 μl של השעית תא לכל עמודת ג'ל מיני. הימנע מלגעת בג'ל במהלך בנוסף.
4. אתר כרטיסי MTS לבעל כרטיס צנטריפוגה, וחובצה ב156 XG ל6 דקות.
5. הגנה של אנטיגנים משטח נקבעה מהמיקום של RBC בעמודת ג'ל המינית, המבוססת על הייצורr תיאור.

ג. שתי מדידות מחיצת שלב מימיות

1. הכן 500 kDa dextran 8 2 מערכת / PEG kDa שלב הפרדה מורכבת (5% dextran 500k, 4% PEG 8K, 150 המ"מ NaCl, 10 mM פוספט) פי ^13.
2. צנטריפוגה ב XG 433 עבור 10 דקות בטמפרטורת חדר כדי להשיג מערכת שלב 2 (dextran בתחתית).
3. הפרד את שני שלבים בזהירות.
4. 1.0 מיליליטר aliquot של השלב העליון PEG לתוך צינור כותרתו (עם תחתית קעורה), להוסיף 20 μl של 20% המטוקריט HPG modified RBC, ומערבב בעדינות על ידי תאים מצליפים.
5. הוסף 0.5 מ"ל של השלב העליון המכילים תאים ל 0.5 מ"ל של שלב נמוך יותר, ולערבב בעדינות על ידי המערכת מצליף.
6. הנח את הצינור על הספסל ~ 2 דקות למערכת כדי להפריד, ולקבוע את המיקום של תאים במערכת. לוקליזציה של RBCs (בשלב PEG העליון, בשלב dextran התחתון או בשניהם) היא פונקציה למידת שינוי ומולקולרימשקל של HPG.

IV. מדידות שבירות אוסמוטי

1. הכן את פתרוני NaCl עם ריכוזים שלנוע בין 0 ל 0.9 (w / v)%.
2. מקום 0.4 מ"ל של פתרוני NaCl לתוך צינורות 1.5 מ"ל Eppendorf.
3. הוסף 20 μl של RBCs (20% המטוקריט) לתוך פתרוני NaCl.
4. תאי Mix בקפידה על ידי היפוך ולמקם אותם באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
5. להשעות תאים בקפידה על ידי היפוך. קח 50 μl RBC של השעיה ולהוסיף אותו למגיב 1 המ"ל של דרבקין, הוצב בקובט. מערבב תאים עם המגיב של דרבקין על ידי pipetting פנימה והחוצה. מדוד את ספיגת cyanoderivative ההמוגלובין ב540 ננומטר באמצעות Beckman Coulter DU 730 UV / VIS קורא.
6. כדי לכמת את כמות ההמוגלובין בsupernatant, צנטריפוגה התאים XG ב 1000 עבור 1 דקות. הוסף 200 μl של supernatant ל1 מ"ל של ריאגנט של דרבקין בקובט. מערבב תאים עם המגיב של דרבקין על ידי pipetting פנימה והחוצה. מדוד את ספיגת hemoglobin cyanoderivative ב540 ננומטר באמצעות Beckman Coulter DU 730 UV / VIS קורא.
7. לחשב את כמות התאים lysed בתמיסת NaCl שונה מהיחס של המוגלובין בכמות supernatant (שלב 6) לסכום הכולל של המוגלובין בהשעית התא (שלב 5).

מדידות זרימת cytometry V. - הגנת רזוס-D (RHD) אנטיגן

1. הוסף 5 μl שליטה או RBCs HPG השונה (20% המטוקריט) בשלושה עותקים לחיץ PBS בתוספת BSA 0.5% להיקף כולל של 25 μl.
2. הוסף 25 μl של אנטי D רזוס FITC חד השבטי (RHD) שנרכש מBiodiagnostics המנה (פנסילבניה, ארה"ב).
3. דגירה את התערובת במשך 30 דקות על 37 מעלות צלזיוס באמבט מים.
4. שטוף את התערובת עם חיץ 1.5 מ"ל PBS פעמים. צנטריפוגה XG ב 1000 למשך דקת 1 כדי להסיר את supernatant.
5. להשעות RBCs למלוח 1 מ"ל, ולהעביר את ההשעיה ל 4 מיליליטר צינור זרימת BD זרימת cytometry.
6. לנתח באמצעות FACSCanto השני פלהw cytometer, רכישת 5,000 אירועים על שער RBC השליטה, ולהשתמש באירועים שלמים לניתוח.

VI. מדידות זרימת cytometry - ביטוי של CD47

1. הוסף 1.54 μl שליטה או RBCs HPG השונה (20% המטוקריט) בשלושה עותקים לחיץ PBS בתוספת BSA 0.5% להיקף כולל של 44 μl.
2. הוסף 6 μl של phycoerythrin (PE) שהכותרת CD47 העכבר אנטי אנושי שנרכש מBD Biosciences (ניו ג'רזי, ארה"ב).
3. דגירה את התערובת במשך 30 דקות על 37 מעלות צלזיוס באמבט מים.
4. שטוף את התערובת עם חיץ 1.5 מ"ל PBS עבור שתי פעמים. צנטריפוגה XG ב 1000 למשך דקת 1 כדי להסיר את supernatant.
5. להשעות RBCs למלוח 1 מ"ל, ותעבור דרך 26 G 5/8 מחט כדי למזער clumping תא.
6. להעביר את ההשעיה ל 4 מיליליטר צינור זרימת BD זרימת cytometry.
7. לנתח באמצעות cytometer הזרימה השנייה FACSCanto, רכישת 10,000 אירועים בשער שליטת RBC.

Representative Results

הסוואה של אנטיגן רזוס D וחלבוני CD47 RBC משטח הייתה לכמת ידי cytometry זרימה באמצעות ניאון נוגדנים חד השבטיים שהכותרת, ותוצאת נציג ניתן באיור 1. במקרה של RBCs HPG מושתל-(אפור), עוצמת אות ירד (שיא עבר לשמאל) בהשוואה לשליטת RBCs (אדום וירוק) המצביע על ירידה בקשירת נוגדנים לתא שטח שמצביע על המיסוך של חלבוני שטח .

איור 1. הערכת ההסוואה של אנטיגנים על פני שטח וחלבונים באמצעות cytometry זרימה. ) רזוס D הגנה (RHD): שיא מוצל שחור מייצג את השליטה השלילית (RBCs הלא שונה מטופלים עם PE-IgG1 מסומן), השיא הירוק מייצג שיתוף החיוביntrol (RBCs לא שונה טופל בנוגדן אנטי ניאון RHD), והאפור השיא מייצג RBCs HPG השונה שטופל באותה הכמות של נוגדני ניאון אנטי RHD. B) CD47: שיא מוצל שחור מייצג את השליטה השלילית (RBCs הלא שונה טופל בIgG1 PE מתויג-), השיא האדום מייצג את השליטה החיובית (RBCs הלא שונה טופל בנוגדני ניאון אנטי CD47), והשיא האפור מייצג RBCs HPG השונה שטופל באותה הכמות של נוגדני ניאון אנטי CD47. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

Discussion

RBCs תורם האוניברסלי יש פוטנציאל גדול בשיפור הזמין דם ובטיחות לטיפול בעירוי דם. RBCs נחשב גם רכב משלוח סמים מבטיח בשל תפוצתם הארוכה וbiocompatibility הגלום ^{14, 15.} ניסויים שהוצגו במאמר זה להעריך את המאפיינים במבחנה של HPG RBCs שונה. במבחנה ונכסים שבמחזור vivo של RBCs שונה HPG נחקר בקבוצה שלנו לאחרונה ^{8, 11.} חלוקת RBCs במערכת Dextran500K/PEG8K מימית 2 שלב, השלימה עם NaCl ופוספט נתרן, תלויה במטען המשטח הכדורי האדום ועל רכב פני שטח גליקופרוטאין ^16. בהתאם למידה של RBC glycocalyx שינוי עם HPGs, RBCs שונה נוטה מחיצה מdextran הנמוך לשלב PEG העליון. המערכת מספקת 2 שלב הערכה קלילה של מידת שינוי פני שטח RBC. תמוגה oRBCs f בסרום עצמי הוא מבחן משמעותי לחקירה, בין אם HPG RBCs השונה מפעיל הפעלה משלימה, מאז החדרת חומרים חדשים לתאים ומשטחים ביולוגיים הופך אותם לזרים ובכפוף תמוגה מערכת חיסונית בתיווך והפינוי ^17. ניסוי שבירות אוסמוטי, לעומת זאת, מציין אם מאפיינים וdeformability של קרום RBC מכאניים נפרצו כתוצאה מHPG השתלה. Deformability של RBCs חשוב לתפקוד הפיזיולוגי של ₂ O משלוח לחלקים שונים של הגוף. בניסוי זה RBCs השונה נחשפים ללחץ עיוות על ידי טיפול בריכוזים שונים של NaCl, וכימות אחוזים מתאי lysed.

cytometry הזרימה משמש להערכת המידה של אנטיגן פני שטח והגנת חלבון פני שטח (איור 1) על ידי מגיב אנטיגן מסוים על פני השטח של RBC עם-la הניאון המתאים לוהתנפח נוגדן. היקף הגנת אנטיגן D רזוס מוערך באמצעות cytometry זרימה. המיסוך של אנטיגנים ניכר מהירידה בנוגדנים מחייב את RBCs. מיסוך אנטיגן רזוס D גם הוערך על ידי כרטיסי MTS. כרטיסי MTS נמצאים בשימוש נרחב במעבדות המטולוגיה בבתי חולים לphenotyping של RBCs. לדוגמה, כאשר הקבוצה RBC ממוקם בסוג כרטיס MTS, תאי הצטמד כתוצאה מתגובה עם הנוגדנים המתאימים. עם זאת, דם מקבוצת B אינו הצטמד ונוסע לתחתית ג'ל המיני. הרעיון של התלכדות שמש כדי להעריך את רמת הגנה שמספקת להשתלת HPG RBCs. RBCs HPG מושתל-חודר את עמודת ג'ל מיני, בהתאם לרמת הגנת אנטיגן פני שטח.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glycidol	Sigma Aldrich		(ON, Canada)
Trimethylolpropane	Fluka		(ON, Canada)
Potassium methylate	Sigma Aldrich		(ON, Canada)
Anhydrous pyridine	Sigma Aldrich		(ON, Canada)
4-Dimethylaminopyridine	Sigma Aldrich		(ON, Canada)
Succinic anhydride	Sigma Aldrich		(ON, Canada)
Acetone	Fisher Scientific		(ON, Canada)
Anhydrous dimethyl formamide	Sigma Aldrich		(ON, Canada)
N-Hydroxysuccinimide	Sigma Aldrich		(ON, Canada)
N,N'-Diisopropylcarbodiimide	Sigma Aldrich		(ON, Canada)
MTS cards			Micro Typing System (MTS) cards (FL, USA)
Dextran 500 kDa	Pharmacia Fine Chemicals		(Sweden)
PEG 8 kDa	Sigma Aldrich		(ON, Canada)
FITC monoclonal anti-Rhesus D (RhD)	Quotient Biodiagnostics		(PA, USA)
PE monoclonal anti-CD47	BD Biosciences		(NJ, USA)
Drabkin's reagent	Sigma Aldrich		(ON, Canada)
Table. Chemicals and reagents used for the grafting of HPG polymers to RBC membrane and their analysis.