Summary
وصفنا طريقة لاستجابة التصوير لعلاج مضاد للسرطان
Abstract
والمكروية الورم يلعب دورا محوريا في بدء الورم، التقدم، ورم خبيث، وردا على العلاجات المضادة للسرطان. وكثيرا ما تستخدم ثلاثية الأبعاد شارك في ثقافة نظم فسر الورم سدى التفاعلات، بما في ذلك دورها في الاستجابة للأدوية. ومع ذلك، لا يمكن أن العديد من التفاعلات التي تحدث في الجسم الحي في المكروية سليمة تماما تكرارها في هذه الإعدادات في المختبر. وهكذا، أصبح التصور المباشر لهذه العمليات في الوقت الحقيقي أداة هامة في فهم ردود الورم إلى العلاج وتحديد التفاعلات بين الخلايا السرطانية وستروما التي يمكن أن تؤثر هذه الاستجابات. هنا نقدم طريقة لاستخدام القرص الغزل مبائر المجهر من الفئران، ويعيش تخدير لمراقبة المخدرات مباشرة توزيع الخلايا السرطانية، والاستجابات والتغيرات في الورم سدى بعد التفاعلات إدارة العلاج المنهجي في نماذج سرطان الثدي. وصفنا إجراءات labeliنانوغرام مكونات الورم مختلفة، وعلاج الحيوانات لمراقبة استجابات العلاجية، وإجراء العمليات الجراحية لتعريض أنسجة الورم للتصوير تصل إلى 40 ساعات. النتائج التي تم الحصول عليها من هذا البروتوكول هي الوقت الفاصل بين الأفلام، والتي يمكن من خلالها تقييم عمليات تسلل مثل المخدرات، وسرطان موت الخلايا اللحمية والهجرة الخلية باستخدام برامج التحليل الصورة.
Introduction
وتتألف الأورام الصلبة من اثنين من مقصورات رئيسية هي: الخلايا السرطانية والمكونة اللحمية (الخلوية وغير الخلوية) التي تساعد في الحفاظ على بيئة مناسبة لنمو الورم 1. هذه المكونات اللحمية تلعب أدوارا حاسمة في تطوير والتقدم، وورم خبيث من أنواع عديدة من السرطان، بما في ذلك 2-5 الثدي. الوسط اللحمية يؤثر أيضا الردود العلاجية 2،4،5. وهكذا، تحديد كيفية الاستجابة لخلايا السرطان العلاجات التقليدية والرواية ضمن سياق المكروية سليمة مهم لتعزيز فهمنا للبيولوجيا السرطان وتحسين الاستراتيجيات العلاجية الحالية. وعلاوة على ذلك، وتحديد كيفية سرطان الخلايا سدى التفاعلات تتغير بعد إدارة العلاج هو أمر حاسم لفهم بيولوجيا الأورام الانتكاس.
وقد شارك في زراعة عضوي النمط نظم مفيدة لدراسة الورم سدى التفاعلات
وكانت الوسيلة الرئيسية لدراسة الردود على العلاج المضاد للسرطان في الجسم الحي من خلال قياسات حجم الورم وتقييم النسيجي للأنسجة مستمدة من معاملة الحيوانات أو المرضى. ومع ذلك، فقد مكن التقدم في المجهر الفلورسنت وللصحفيين خلال العقدين الماضيين تصور العمليات المشتركة بين وداخل الخلايابدقة عالية في الحيوانات، ويعيش تخدير (intravital التصوير) 8. وقد أثبتت هذه التقنيات المجهر intravital أن تكون ذات قيمة خاصة للمكانيا وزمانيا في تشريح الجسم الحي من ديناميات ورم في سدى التفاعلات الخلوية وشبه قرار الخلوية 8،9.
العمليات التي تم كشف عن طريق التصوير intravital تشمل المضادة للورم الخلايا T السمسة 10،11، والتفاعلات بين الخلايا T والخلايا النخاعي 12، ديناميات التغيرات في تكوين الكولاجين وتنظيم العلاجية بعد العلاج 13، البلاعم التي تعتمد على الخلايا السرطانية دخول الوعاء والانبثاث 14، ونفاذية الأوعية الدموية 15.
هناك ثلاثة متطلبات رئيسية للتصوير intravital. وتشمل هذه المناسبة وإعداد تعرض الأنسجة للتصوير، ووضع العلامات الفلورية من مكونات النسيج المصالح، ويقترن هذا المجهر الكاميراقادرة على الحصول على الصور 16 ystem. الاستراتيجيات الأكثر شيوعا التي تستخدم لمعالجة هذه المتطلبات ما يلي: 1) الأعمال التحضيرية منتبذ (على سبيل المثال، التلقيح من الأذن أو العين المدارية)، نوافذ دائمة التصوير، أو مستحضرات exteriorized (على سبيل المثال، الظهرية رفرف الجلد)، 2) للصحفيين الفلورسنت المعدلة وراثيا و. الحقن الفلورسنت لتسمية مكونات النسيج، و 3) نظم المجهري متحد البؤر multiphoton أو يقترن أنابيب مضخم أو المسؤول إلى جانب جهاز-(CCD) الكاميرات على التوالي 9. نستخدم رفرف الجلد المعدة جراحيا نموذج لفضح الغدة الثديية الأربية للتصوير في الحيوانات التي تعبر عن الجينات المحورة تخدير ترميز للصحفيين الفلورسنت. ويتم الحصول على الصور على مدى فترة من 12 إلى 40 ساعة باستخدام مكثف CCD (ICCD) كاميرا يقترن أربع الليزر نظام القرص الغزل مبائر المجهر 17. وقد سمح التصوير بهذه الطريقة لنا لدراسة مثل هذه العمليات كما هو الحال في توزيع المخدرات الحية، المرحلة التي تعتمد على الفصلemotherapeutic الردود، نوع من موت الخلايا التي يسببها العلاج الكيميائي، والسلوك النخاعي الخلية 5.
نحن نقدم بروتوكول لتصوير intravital من الردود الخلايا السرطانية إلى العلاج المضاد للسرطان وورم سدى التفاعلات في نماذج الماوس من سرطان الثدي. ويمكن استخدام هذا البروتوكول لتتبع السلوكيات وموت خلايا السرطان على حد سواء ومكونات اللحمية مع مجموعة واسعة من العلامات الفلورية المعدلة وراثيا والحقن في كل من النماذج المعدلة وراثيا وزرع لفترات تصل إلى 40 ساعة في جلسة التصوير واحد.
Protocol
يجب أن يتم تنفيذ جميع الإجراءات المذكورة وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح لاستخدام الحيوانات الفقارية، بما في ذلك الحصول على موافقة مسبقة من قبل رعاية الحيوان واللجنة المؤسسية المحلية الاستخدام.
1. توليد أورام الثدي الماوس للتصوير (المعدلة وراثيا أو مثلي)
- توليد أورام الثدي للتصوير باستخدام نماذج الماوس المعدلة وراثيا (مثل الماوس فيروس الورم الثديية طويلة تكرار محطة [MMTV]-T تورام الأوسط المستضد [PyMT] أو C3 الفئران (1) مروج مدفوعة المستضد T كبيرة (علامة) من SV40 [C3 ( 1) العلامة-] نماذج) أو نماذج زرع مثلي (مسانج، خيفي، أو أعضاء غير بشرية).
- تسمية الخلايا السرطانية عن طريق عبور النماذج المعدلة وراثيا مع خطوط مراسل المعدلة وراثيا (مثل ACTB-ECFP) أو استخدام السابقين فيفو التلاعب من الخلايا السرطانية الأولية أو خطوط الخلايا (على سبيل المثال تنبيغ)، يليه الزرع. لبروتوكول عينة للزرع مثلي، قهه 18.
2. تصور مكونات المكروية ورم أو المكونات الفرعية الخلوية
- تصور مكونات الورم باستخدام تسميات المعدلة وراثيا. التهجين نماذج الورم وراثيا على الفئران المعدلة وراثيا مراسل (مثل C-FMS-EGFP لخلايا الدم النخاعي أو ACTB-H2B EGFP مقابل نوى) أو استخدام الفئران مثل المستفيدين من الأنسجة، المزروع المسمى. هذا التصور يمكن للتفاعلات سرطان الخلايا اللحمية الخلايا في الاستجابة للعلاج أو تغييرات النووية المرتبطة موت الخلايا، على التوالي.
- تصور باستخدام الحقن المكروية. ويمكن استخدام مجموعة واسعة من وكلاء (مثل الأجسام المضادة fluorescently المسمى أو الأصباغ الكيميائية) لتسمية العناصر المختلفة للورم. اعتمادا على عمر النصف للصباغة والاستجابة يهتم أحد في تتبع، قد يتم عن طريق الحقن إدارة قبل بدء التصوير أو التصوير أثناء الدورة إما عن طريق الوريد (IV) أو الباحثraperitoneally (IP.، الشكل 1).
3. المجاهر وبرامج التصوير
- المجهر. ويمكن استخدام مجموعة متنوعة من النظم والبرمجيات المجهر للتصوير من الفئران الحية. أكثر الأنظمة شيوعا هي المجاهر مبائر أو multiphoton. نستخدم الدقيقة بعدسات المجهر القرص الغزل مبائر (Solamere تكنولوجيز، سولت لايك سيتي، UT) مع كاميرا ICCD (XR-S ميجا 10EX-30، ستانفورد الضوئيات، بالو ألتو، كاليفورنيا).
- التصوير البرمجيات. نستخدم برمجيات المصدر المفتوح μManager (فالي مختبر، جامعة كاليفورنيا، سان فرانسيسكو [UCSF]).
- تحليل الصور. نستخدم Imaris (Bitplane)، Volocity (PerkinElmer)، ويماغيج (المعهد الوطني للصحة [NIH]) لتحليل الصور.
4. (قبل) معاملة الحيوانات في التصوير
- أورام الثدي هي الأمثل لالأربية التصوير باستخدام بروتوكول دينا عندما أطول قطر يقيس حوالي 8 مم أو أقل من قياس آثافة الفرجارement.
- للحيوانات التصوير تعامل مع مثبط جزيء صغير، الأجسام المضادة العلاجية أو العلاج الكيميائي المخدرات، يبدأ العلاج قبل أو أثناء التصوير كما هو مطلوب للتجربة. على سبيل المثال، والتصوير من التسرب وتوزيع المخدرات يتطلب إدارة بعد بدء التصوير (أفلام 1 و 2)، في حين يتم التقاط أفضل تصوير موت الخلايا الناجمة عن العلاج الكيميائي المخدرات دوكسوروبيسين قبل بدء التصوير 24 ساعة في وقت لاحق أو بعد العلاج من تعاطي المخدرات (3 أفلام و 4).
5. إعداد المالحة للحفاظ على الترطيب والدم الأسمولية من الحيوان أثناء التصوير
- رسم حوالي 1 مل من 1X PBS إلى حقنة 1 مل. يمكن إضافة Propidium يوديد (PI، إينفيتروجن، 1 ملغ / مل، 1:15 المخفف) لهذا الحل أن تدار بشكل دوري (IP). خلال الدورة التصوير. وهذا سوف يسمح للتصوير من نوى الخلايا الميتة أو التي تحتضر التي لها نفاذية أغشية الخلايا. PI لديه نصف قصيرة جداو لذلك يجب على الحياة في الأوعية الدموية وإعادة تدار طوال الدورة التصوير.
- إرفاق مجموعة التسريب المجنح (23 مقياس، ¾ بوصة إبرة، 12 بوصة أنابيب) لهذا حقنة ودفع الحل من خلال أنابيب حتى قطرة من محلول ملحي مخارج غيض من إبرة في نهاية الأنبوب.
- إزالة المحقنة من مجموعة التسريب، وإعادة ملء مع الحل المالحة المناسبة.
- إعادة إرفاق المحقنة إلى مجموعة التسريب، مع الحرص على عدم إدخال فقاعات في خط.
6. إعداد نظام التخدير Isoflurane
- إضافة الماء إلى البخاخات والمسمار في مكانه. وهذا رطب الغازات تسليمها للحيوان، ومنع تهيج الرئتين وإطالة بقاء الحيوانات على المدى الطويل تحت التخدير.
- ملء خزان isoflurane إلى السطر العلوي. تنبيه: Isoflurane هو مخدر قوي يمكن أن تؤثر أيضا على الباحث. أن تقوم الأنظمة المناسبة فراغ به لضمان أن تتم إزالة الغازات الزائدة من المنطقة.
- بدوره على كل من خزان الأوكسجين والنيتروجين وخزانات وضبط التدفق. يجب أن تكون على النيتروجين حوالي 1.0 L / دقيقة، في حين أن الأكسجين يجب أن تكون في حوالي 0.2 لتر / دقيقة (~ 21٪).
- بدوره على الفراغ (في المنزل). يجب أن يكون الفراغ حوالي 1.2 لتر / دقيقة.
- تأكد من أن خط التخدير إلى غرفة تحريض مفتوحة، ويتم إغلاق خطوط إلى منطقة الجراحة والمجهر.
- تأكد من أن يتم نفخ الكيس التنفس اللاتكس موصولة إلى النظام التخدير. إذا الحقيبة لا تضخيم، يحل محله.
- تحقق من الحجاب الحاجز المطاطي على كل من المخاريط الأنف تقديم التخدير إلى مرحلة المجهر ومنهاج الجراحية. إذا كان المطاط بدأت رقيقة، يحل محله.
7. إعداد أدوات الجراحية ومنهاج الجراحية
- بدوره على التعقيم حبة الساخنة والسماح لها الوصول> 200 ° C.
- غسل الأدوات الجراحية في الماء والصابون(زوج واحد من ملقط [يفضل أن يكون مع الأسنان] ومقص لقطع طريق الجلد من الحيوان، زوج واحد من ملقط [يفضل مسننة] ومقص لمزيد من التعرض للورم).
- تعقيم الأدوات الجراحية للا يقل عن 30 ثانية باستخدام حبة الساخنة معقم (بدلا من ذلك، يمكن تعقيمها الأدوات الجراحية مقدما).
- السماح للأدوات الجراحية تهدئة مع التأكد من تجنب تلويث الأدوات المعقمة.
- جمع الغطاء لبرودة الشحن الستايروفوم. وسيكون هذا النظام الأساسي الخاص بك الجراحية.
- ضع قطعة من مختبر معتاد على الثمالة على رأس الغطاء الستايروفوم (ما يكفي لتغطية ذلك).
- يضعوا مخروط الأنف مع خط على نظام التخدير إلى معتاد على الثمالة المختبر مع الشريط مختبر (1 "الشريط يعمل بشكل أفضل هنا). إدراج 18 غرام X1 ½" الإبرة من خلال الشريط في غطاء الستايروفوم على جانبي مخروط الأنف للحفاظ على مخروط الأنف تأمين في المكان.
- betadine جانبا، شاش معقم، وهما 70٪ الأيزوبروبانول مناديل، المجهرالشريحة، الغراء Krazy، و 4 قطع من الشريط مختبر (½ "عرض).
8. إعداد مجهر
- بدوره على المجهر، وكاميرا، وجهاز كمبيوتر يستخدم المجهر.
- بدوره على بطانية التدفئة.
- إذا مجهر مقلوب لاستخدامه يجب أن يكون المقصود من إدراج المرحلة حسب الطلب مع منافذ التصوير المقابلة لموقع الغدد الثديية في الأربية. تنظيف مرحلة إدراج جيدا بالماء والصابون والجافة. استخدام الشريط مختبر (½ "يعمل بشكل أفضل) لتأمين غطاء زجاجي (# 1.5 سمك) على الموانيء التصوير وتنظيف السطح بأكمله مع 70٪ الأيزوبروبانول. تغطي المرحلة بشاش معقم للحماية من التلوث. ضع إدراج المرحلة في المرحلة والسماح لها الهواء الجاف.
- المسيل للدموع 4-6 قطعة من الشريط مختبر (1 "العرض)، ما يقرب من 6 بوصات في الطول وإرفاقها إلى جانب المجهر. وسوف تستخدم هذه قطعة من الشريط لوضع التخدير مخروط الأنف إلى تقديم حيواند ربط في مكانه.
- المسيل للدموع اثنين من أكثر قطع من الشريط (½ بوصة عرض) التي هي عن شبر واحد في الطول. وسوف تستخدم هذه للحفاظ على إبرة الفراشة تقديم PBS إلى الماوس واستخدام المجهر الشريحة لفضح الورم في المكان.
9. تعريض الغدة الثديية لالأربي التصوير
- تخدير الحيوان في غرفة التعريفي الخاص 4٪ isoflurane مع الأكسجين والنيتروجين 21٪ الرصيد (معدل التدفق في L 1،0 حوالي / دقيقة) والغاز الناقل. وهذا ينبغي أن أخذ من 2-4 دقيقة.
- نقل الماوس إلى منصة الجراحية بمجرد أن يتنفس بعمق وببطء، مع السطح البطني مواجهة. فتح خط التخدير الجراحي لالمنصة ثم قم بإغلاق الخط التخدير إلى الدائرة التعريفي، في هذا الطلب لتجنب الضغط مرتفعة جدا في النظام التخدير. الحد من تركيز isoflurane من 4٪ إلى 2.5٪ في الوقت الحالي.
- تحقق من انسحاب دواسة منعكس للتأكد من أن الحيوانات بما فيه الكفاية انيسthetized لإجراء العمليات الجراحية عن طريق أداء قليل قاطع الطريق. الحيوان للتخدير بشكل كاف اذا لم تتفاعل (أو نشل مثل حليقة ذيله) إلى قرصة قاطع الطريق. إذا كان الحيوان لا ترد على قرصة قاطع الطريق، وزيادة تركيز isoflurane.
- تأمين أطرافه من الفأرة إلى منصة الجراحية الشريط مع المختبر (½ "الشريط يعمل بشكل أفضل لهذا).
- (اختياري) عندما يتم تأمين الحيوان إلى منصة الجراحية، يمكن إزالة الشعر من السطح البطني باستخدام ماكينة حلاقة الإلكترونية. إذا ويفضل إزالة الشعر الكيميائية، ينبغي أن يتم تنفيذ هذه 24-48 ساعة قبل الجراحة. إزالة الشعر قبل الجراحة يساعد على منع التلوث من موقع التصوير، والشعر طائشة يمكن أن تحدث استجابات مناعية قوية وحادة.
- تطهير السطح البطني للحيوان مع مناديل الأيزوبروبانول 70٪ وbetadine.
- استخدام الزوج الأول من مقص ملقط معقم و(مع الأسنان)، وجعل شق تحت الجلد البطني خط الوسطالذي يمتد من مم 3 ~ فوق مجرى البول لعملية الخنجري. أن تحرص على تجنب ثقب أو قطع طريق الصفاق.
- باستخدام الزوج الثاني من مقص ملقط معقم و(مسننة)، فصل بلطف الجلد، الغدة الثديية مع الأربية المرفقة، من التجويف البريتوني.
- تأخذ شريحة المجهر والزجاج، ووضعه على الجلد ورفرف ولدت في الخطوة السابقة. وضع الشريحة في مثل هذه الطريقة أن الجزء الأكبر من الورم سيجلس شقة مرة واحدة يتم وضع الماوس على المسرح، وأنها لا تتداخل مع التنقل من الأطراف الخلفية.
- مرة واحدة وقد تم وضع المجهر الشريحة بشكل صحيح، ونعلق الشريحة إلى السطح الخارجي للجلد باستخدام superglue (على سبيل المثال، Krazy الغراء).
10. تحديد المواقع الماوس على المرحلة
- إزالة الشريط تأمين مختبر أطرافه من الحيوان إلى منصة الجراحية.
- فتح خط إلى مرحلة التخدير المجهر وإغلاق anestheSIA الخط إلى منصة الجراحية، في هذا النظام.
- نقل بسرعة الحيوان إلى مرحلة المجهر.
- مرة واحدة وقد تم نقل الحيوان، موقف وتأمين خط التخدير ومخروط الأنف بشكل صحيح (على سبيل المثال باستخدام الشريط مختبر) للتأكد من أن الماوس لا يزال تخدير وهو في وضع مريح.
- كشف الورم بحيث يتم وضع ذلك على رأس وقلب واحدة من المنافذ الزجاجية المغطاة غطاء التصوير في المرحلة المجهر.
- باستخدام العدسات، تحقق من أن يتم وضع بشكل صحيح الورم، والشريط بلطف أسفل الشريحة المجهر. وينبغي تأمين الشريحة فضفاضة بحيث لا يتم إعاقة تدفق الدم إلى الأنسجة. ربط الشرائط أسفل الشريحة المجهر يساعد على تقليل الآثار التصوير الذي عرضته التنفس الحيوان.
- إدراج الخط الساكن داخل الصفاق مع مجموعة التسريب المجنح لتعلق حقنة تحتوي على 1-مل العقيمة PBS 1X أو المالحة (التي تحتوي على صبغة اختياريا مثل PI) التي أعدت تحت رقم 5. ينجالعلاج بالصدمات الكهربائية للحيوان مع 100 ميكرولتر عندما IP. يتم إدراج الخط. من هذه النقطة الزمنية حتى نهاية الدورة والتصوير، وحقن الحيوانات مع 50 ميكرولتر من محلول ملحي على فترات ساعة 1 (أو 25 ميكرولتر من محلول ملحي مع PI كل دقيقة 30).
- لرصد علامات الحيوان الحيوية، إرفاق مقياس التأكسج التحقيق (مثل MouseOx النظام عن طريق شركة ستار الحياة، العلوم) 19.
- تغطية الفأر مع بطانية تدفئة لمنع انخفاض حرارة الجسم.
11. الحصول على الصور
يتم استخدام برمجيات المصدر المفتوح μManager (فالي مختبر، UCSF) للحصول على الوقت الفاصل بين الصور. يتم تصنيف البيانات الخام في البرنامج (Bitplane) Imaris، ويمكن سجل يدويا من قبل مراقبين مستقلين، أو تحليلها في أي من برامج تحليل الصور Imaris أو غيرها (مثل Volocity [PerkinElmer] أو يماغيج [NIH]).
12. القتل الرحيم
في نهاية الدورة الصورة (1-40 ساعة، اعتمادا على نوع العملية تحليلها)، والموت الرحيم للحيوان.
- يتم زيادة تركيز isofluorane إلى 4٪.
- ويلاحظ الحيوان حتى 30 ثانية بعد أن تستولي التنفس وإزالة ثم من المرحلة.
- يتم تنفيذ خلع عنق الرحم للتأكد من أنه قد تم الموت الرحيم للحيوان.
13. ممثل النتائج
التصوير Intravital باستخدام هذا الأسلوب يسمح للرؤية مباشرة من العمليات المختلفة، بما في ذلك تقديم الأدوية إلى التسرب، والأورام وتوزيع المخدرات مرة واحدة تصل إلى الورم، العلاج بعد موت الخلايا العلاجية، وورم سدى التفاعلات ردا على موت الخلايا 5. لمراقبة وصول الدواء إلى الورم والتوزيع في أعقاب التسرب إلى أنسجة الورم، ويتم حقن الحيوان بينما يجري الحصول عليها الصور. على الرغم من أن العديد من أصناف الفصلemotherapeutics هي الفلورسنت ضعيفة (مثل دوكسوروبيسين)، والعديد منهم لا. يمكن أن تستخدم Fluorescently dextrans مترافق كعلامات بديلة لتوصيل الدواء إلى أنسجة ونشرها. الشكل 2 والفيلم 1 مشاهدة وصول ثيوسيانات فلوريسئين-(FITC)-2 MD ديكستران مترافق (إينفيتروجن، 1 ملغ / مل 1xPBS) حقن الرابع. إلى ورم من MMTV-PyMT؛ الماوس ACTB-ECFP.
بعد وصول الدواء داخل الورم، يمكن تصويرها ونشرها من خلال التسرب إلى الأنسجة لتحديد كل من داخل الأوعية نصف حياة المخدرات والتوزيع 5. فيلم 2 يبين التسرب وتوزيع فلور-647-مترافق اليكسا ديكستران دينار كويتي 10 (إينفيتروجن، 1 ملغ / مل في برنامج تلفزيوني X 1) حقن الرابع. في C3-الدلالية (1)؛ الماوس FMS-C-EGFP خلال التصوير؛ ACTB-ECFP. بعد تجميع الوقت الفاصل بين الأفلام في Imaris (Bitplane)، وكميا داخل الأوعية نصف العمر والمخدرات التوزيع. داخل الأوعية لقياس نصف العمر، يتم حساب متوسط كثافة مضان في الأوعية الدموية السرطانية في كل نقطة تآمر ضد الزمن والوقت. وكميا توزيع المخدرات باعتبارها منطقة الورم في المائة المنطقة الإجمالية التي لا إيجابية للدواء.
بالإضافة إلى تتبع حركية لتقديم الأدوية للأورام، فمن المهم كثيرا لتحديد كيفية الاستجابة والأورام للعلاج. حيث من المتوقع العلاجات المضادة للسرطان للحث على موت الخلايا، يمكن استخدام يوديد propidium (PI) تلطيخ أو التغييرات الهيكلية النووية كعلامة من المخدرات التي يسببها موت الخلايا 5. ويبين الشكل 3 استجابة الورم للدوكسوروبيسين في العلاج الكيميائي للخلايا في MMTV -PyMT؛ ACTB-ECFP؛ FMS-C-EGFP الماوس. في هذا الثلاثي المعدلة وراثيا MMTV-PyMT؛ ACTB-ECFP؛ FMS-C-EGFP الحيوان، ECFP سرطان الثدي تسميات خلايا (الأزرق)، وخلايا الدم النخاعي EGFP تسميات (الخضراء). كانت تدار تصوير الحيوان خلال هذه الدورة 18 ساعة قبل دوكسوروبيسين التصوير بدأ وقام بتسليم PI الملكية الفكرية في جميع أنحاء رانه الدورة التصوير كما هو موضح أعلاه. الخلايا السرطانية (ACTB-ECFP التوسيم) تظهر زرقاء و، والخلايا الميتة أو التي تحتضر تظهر حمراء (PI تلطيخ). السلسلة الزمنية المعروضة هنا يظهر تحريض دوكسوروبيسين التي تعتمد على موت الخلايا مع مرور الوقت. لتحديد تحريض موت الخلايا في الأورام، ويستخدم نفس النوع من التحليل المستخدمة لتحديد توزيع المخدرات، حيث خرج الكمي هو مجال في المئة لكل منطقة الورم الإجمالية التي لا إيجابية للPI.
يمكن التصوير في تضخم عالية تقديم معلومات بشأن نوع موت الخلايا أن الخلايا السرطانية الخضوع 5. فيلم 3 يبين نتائج تجربة التصوير لتعقب التغييرات النووية نموذجية من موت الخلايا أفكارك في الاستجابة للعلاج النظامية مع دوكسوروبيسين. لتصور نوى، تصوير الحيوان خلال هذه الدورة المرافئ مراسل ACTB-H2B-EGFP بدلا من مراسل C-FMS-EGFP، لذلك وصفت نوى الخلايا السرطانية باللون الأخضر. كان الحيوان ACTB-H2B-EGFP ADM، وهذا MMTV-PyMT؛ ACTB-ECFPinistered دوكسوروبيسين (8 ملغ / كغ في 1 × PBS) IP 24 ساعة قبل بداية الفيلم، وتلقى الحقن للساعة PBS × 1 يحتوي PI (إينفيتروجن، 1 ملغ / مل محلول مخفف 1:15). ويمكن ملاحظة التغيرات الهيكلية في نوى الخلايا السرطانية في الخلايا إلى خلايا أفكارك القادمة التي خضعت نخر (PI-إيجابية الخلايا التي تعرض تغيرات طفيفة في التشكل النووي). نوى الخلايا أفكارك تصبح في نهاية المطاف الأحمر نظرا لامتصاص تلطيخ PI (لا يظهر). وكميا في عدد من الأحداث وأفكارك نخرية يدويا لكل نقطة زمنية مستندة على الإيجابية-PI ومورفولوجيا النووية.
العلاج الكيميائي الناجم عن موت الخلايا السرطانية يؤدي في كثير من الأحيان في تجنيد الخلايا المناعية من رد الفعل إلى أورام 2،4،5. ويبين الشكل 4 مثالا على هذا الرد اللحمية للعلاج الحاد مع دوكسوروبيسين. تصوير الحيوانات FMS-C-EGFP هنا كانت تدار دوكسوروبيسين (8 ملغ / كغ في PBS X 1) الملكية الفكرية، وMMTV-PyMT؛ ACTB-ECFP IP الحقن PI. لمدة التجربة لتصور موت الخلية. وأشار الأوقات تمثل عدد ساعات بعد العلاج دوكسوروبيسين، ويمثل حجم شريط 100 ميكرون. في هذه التجربة، وخلايا الدم النخاعي التسلل إلى مناطق موت الخلايا، كما يدل على ذلك السهام البيضاء. لتحديد النخاعي تسلل خلية إلى أورام بعد دوكسوروبيسين الإدارة، نفس النوع من التحليل المستخدمة لتحديد توزيع المخدرات واستجابة الورم للعلاج الكيميائي المستخدم، حيث خرج الكمي هو مجال في المئة لكل منطقة الورم الإجمالية التي لا إيجابية للEGFP.
بالإضافة إلى الرؤية والاستجابة الشاملة اللحمية للعلاج الكيميائي، ويمكن أن تكون الردود المتخصصة اللحمية أيضا تصور 5. 4 يظهر الفيلم البلعمة من المواد الخلية النخري من الزنزانة المجاورة. يمكن أن ينظر إلى المواد النووية الأحمر يجري تناولها من قبل خلية تحتوي على تأه نواة سليمة الخضراء، والتي هي الحال في الضامة. كانت تدار الحيوان ACTB-H2B-EGFP تصوير خلال هذه الدورة دوكسوروبيسين (8 ملغ / كغ في PBS X 1) الملكية الفكرية، وMMTV-PyMT؛ ACTB-ECFP. 24 ساعة قبل بداية الفيلم. تلقت حقن الحيوان للساعة 1 × PI المحتوية PBS (إينفيتروجن، 1 ملغ / مل محلول مخفف 1:15). نوى (ACTB-EGFP التوسيم) تظهر خضراء، ولكن إلى اللون الأحمر والخضوع نخر الخلية.
الشكل 1. وصفت C-FMS-EGFP الحيوانات التي وصفت الخلايا السرطانية في الزرقاء من خلال التعبير عن وخلايا الدم النخاعي ECFP في؛ وضع العلامات عينة من الورم مكونات مختلفة باستخدام تسميات المعدلة وراثيا عن طريق الحقن وهذا هو الثلاثي المعدلة وراثيا MMTV-PyMT؛ ACTB-ECFP الأخضر من خلال التعبير عن EGFP من المروج النخاعي محددة. تم حقن الحيوان مع يوديد propidium (PI، الأحمر، ~ 0.07 مغ / مل في برنامج تلفزيوني 1X) خلالالدورة التصوير لتصور موت الخلية. التسميات PI DNA ولكن يعبر فقط أغشية الخلايا من الخلايا الميتة أو التي تحتضر. شريط النطاق = 100 ميكرومتر.
الشكل 2. تم حقن ACTB-ECFP الحيوان التي وصفت الخلايا السرطانية في الزرقاء من خلال التعبير عن ECFP مع FITC، مترافق ديكستران MD 2 (أخضر) خلال الدورة التصوير لتصور كيف؛ التسرب المخدرات وتوزيعها في الأورام هذه نقرا مزدوجا المعدلة وراثيا MMTV-PyMT. أدوية الأورام تصل بعد الحقن الرابع (الأزرق). يشار وقت بعد بدأ التصوير. شريط النطاق = 100 ميكرومتر.
الشكل 3. سرطان الخلايا استجابة للعلاج النظامية. إن MMTV-PyMT؛ ACTB-ECFP؛ FMS-C-EGFP الحيوانات تعامل مع العلاج الكيميائيدوكسوروبيسين المخدرات قبل التصوير، وحقنوا PI (أحمر، ~ 0.07 مغ / مل في برنامج تلفزيوني 1X) لتسمية موت الخلية. هذه الصورة تظهر سلسلة تراكم تلطيخ PI مع مرور الوقت (كما يتبين من السهام البيضاء)، ويمثل تحريض العلاج بالخلايا الموت دوكسوروبيسين التالية. وأشار الوقت هو وقت بعد العلاج دوكسوروبيسين. الصور هي التوقعات الحد الأقصى لكثافة الصور Z-3 التي تحتوي على مكدس في Z-المحور. شريط النطاق = 100 ميكرومتر.
الشكل 4. النخاعي استجابة الخلية للعلاج الكيميائي في MMTV-PyMT؛ ACTB-ECFP؛ الماوس FMS-C-EGFP الثلاثي المعدلة وراثيا إدارة الموارد البشرية دوكسوروبيسين 20 قبل التصوير وتلقت الحيوان الملكية الفكرية للساعة. حقن PI (أحمر، ~ 0.07 مغ / مل في برنامج تلفزيوني 1X) لتسمية الخلايا الميتة. هذه الصورة تظهر سلسلة تراكم خلايا الدم النخاعي EGFP إيجابية (كما يتبين من السهام البيضاء) مع مرور الوقت بعد doxorubi[سن] العلاج. وقد تبين رد الفعل المناعي هذا الرد إعاقة الاستجابة العلاجية لعدة أصناف من 4،5 الكيميائي. وأشار الوقت هو وقت بعد العلاج دوكسوروبيسين. الصور هي التوقعات الحد الأقصى لكثافة الصور Z-3 التي تحتوي على مكدس في Z-المحور. شريط النطاق = 100 ميكرومتر.
الفيلم 1. . توصيل الدواء إلى الورم وهذا هو مزدوج المعدلة وراثيا MMTV-PyMT؛ ACTB-ECFP الحيوانات التي وصفت الخلايا السرطانية في الزرقاء من خلال التعبير عن ECFP. تم حقن الحيوان مع ديكستران 2 FITC، مترافق MD (أخضر) خلال الدورة التصوير لتصور كيف تصل المخدرات الأورام بعد الحقن الرابع. شريط النطاق = 100 ميكرومتر. انقر هنا لمشاهدة الفيلم .
فيلم 2. تسلل المخدرات في أنسجة الورم A الثلاثي المعدلة وراثيا C3 (1)، العلامة؛ ACTB-ECFP؛ FMS-C-EGFP الحيوانية التي هي الخلايا السرطانية لاbeled في الزرقاء من خلال التعبير عن وخلايا الدم النخاعي ECFP المسمى باللون الأخضر من خلال التعبير عن EGFP تم حقن الرابع مع فلور اليكسا 647، مترافق 10 دنانير ديكستران (الحمراء). يظهر مجال الرؤية مباشرة بعد الحقن مع ديكستران. وتصف ديكستران في البداية الأوعية الدموية، extravasates بسرعة في أنسجة الورم، والذي يتخذ في النهاية من قبل الضامة. شريط النطاق = 100 ميكرومتر. انقر هنا لمشاهدة الفيلم .
الفيلم 3. تم حقن الحيوانات H2B-EGFP مع دوكسوروبيسين قبل التصوير والتصوير من التغييرات النووية بعد موت الخلية التي يسببها العلاج الكيميائي هذا الثلاثي المعدلة وراثيا MMTV-PyMT؛ ACTB-ECFP. مورفولوجيا النووية (الأخضر)، كما تعقب تعبير عن انصهار بروتين H2B-EGFP، ويسمح لرؤية مباشرة للتغيرات الهيكلية التي يسببها العلاج الكيميائي النووي نموذجية من موت الخلايا المبرمج من وجهة نظر للخلية في الزاوية اليمنى العليا. الحيوان RECEIVED نصف ساعة الملكية الفكرية. حقن PI (أحمر) لمدة الدورة التصوير لتسمية الخلايا الميتة والموت. وأشار الساعة وقت بعد العلاج دوكسوروبيسين +24 ساعة. صور تم الحصول عليها باستخدام عدسة الهدف تضخم عالية (40X، NA 1.1، عدسة الماء). شريط النطاق = 15 ميكرومتر. انقر هنا لمشاهدة الفيلم .
الفيلم 4. تم حقن الحيوانات H2B-EGFP مع دوكسوروبيسين قبل التصوير والتصوير من التغييرات النووية وامتصاص الخلايا للمواد ميتة بعد موت الخلية التي يسببها العلاج الكيميائي هذا الثلاثي المعدلة وراثيا MMTV-PyMT؛ ACTB-ECFP. مورفولوجيا النووية (الأخضر)، كما تعقب تعبير عن انصهار بروتين H2B-EGFP، ويسمح لرؤية مباشرة للتغيرات الهيكلية التي يسببها العلاج الكيميائي النووي. تلقى هذا الحيوان نصف ساعة الملكية الفكرية. حقن PI (أحمر) لمدة الدورة التصوير لتسمية الخلايا الميتة والموت. صور تم الحصول عليهاالهدف باستخدام عدسة التكبير عالية (40 X، NA 1.1، عدسة الماء). عدم وجود تغييرات هيكلية كبيرة قبل وضع العلامات مع PI وتغيير في مورفولوجيا النووية وفقدان إشارة GFP يدل على موت الخلايا مثل نخر. وينظر في المواد الميتة التي ستناقشها مع خلية نواة كبيرة، والتي هي الحال في الضامة. وأشار الساعة وقت بعد العلاج دوكسوروبيسين +24 ساعة. شريط النطاق = 10 ميكرومتر. انقر هنا لمشاهدة الفيلم .
Discussion
يمكن للأورام أن ردود العلاجات الجهازية في الجسم الحي تكون مختلفة بشكل كبير لتلك الخلايا السرطانية في المختبر، كما يؤثر المكروية كل من الاستجابة الحادة والانتكاس 5. واحدة من أكبر العقبات التي تحول دون تفسيرها في مسارات مقاومة كيميائية الجسم الحي هو تعقيد التفاعلات بين الخلايا السرطانية والمكروية بهم. على وجه الخصوص، وذلك لأن الأورام الصلبة وضعت على التوازن بين السرطان والخلايا اللحمية، اضطرابات من عنصر واحد، مثل موت الخلايا التي تحدث أثناء العلاج المضاد للسرطان، يمكن أن يؤدي إلى آثار وخيمة على المنظمة الأنسجة.
تقنية التصوير intravital المقدمة هنا يسمح للرؤية مباشرة للتفاعلات الخلايا السرطانية سدى في أورام الفئران، ويعيش تخدير أثناء العلاج مع العقاقير المضادة للسرطان. نستخدم المجهر القرص الغزل مبائر، التي لديها عمق الاختراق النسبي محدودة (انظر 17 (على سبيل المثال بسبب تسلل عدد سكانها المسمى أو تحريض موت الخلايا)، الحركة الخلية، وتوزيع الحقن (مثل تسرب الأوعية الدموية لتعقب)، والمشترك توطين إشارات الفلورسنت 5،12،17،20.
نحن الفئران الصورة بشكل روتيني لأكثر من 6 ساعات والتصوير أيضا تنفيذ لأكثر من 18 ساعة. هذا يتطلب الحفاظ على الفئران باستمرار تحت التخدير لهذه فترات زمنية طويلة. مع التخدير المناسبة، أكثر من 90٪ من الحيوانات البقاء على قيد الحياة لدينا 6 ساعات، وحوالي 80٪ البقاء على قيد الحياة أكثر من 18 ساعة. وقد نشرت تفاصيل عن كيفية تنفيذ على المدى الطويل التخدير سابقا 19. في تجربتنا، خمسة عوامل حاسمة: تجنب انخفاض حرارة الجسم، وتجنب الجفاف، والحفاظ على مستويات التشبع الفسيولوجية الدم الأكسجين، شالغناء مرطب الغاز الناقل للisoflurane، والحفاظ على الحيوانات عند أدنى مستوى في التخدير التي لا تظهر علامات الألم. للحفاظ على درجة حرارة الجسم، ونحافظ على الفئران تحت بطانية ساخنة (C ° في 38). لتجنب الجفاف، ونحن حقن كميات صغيرة من الملكية الفكرية في جميع أنحاء المالحة إجراء التصوير كامل. الفسيولوجية للحفاظ على مستويات التشبع الدم الأكسجين، ونحن نبدأ مع الأكسجين 21٪ في الغاز الحامل (بدلا من 100٪ تستخدم عادة). هذا يمكننا من زيادة مستويات الأوكسجين المستنشق إذا ماوس - في تجربة ساعات - يظهر انخفاضا في تشبع الأكسجين في الدم. في تجربتنا، وزيادة مستويات الاوكسجين في وقت استنشاق مثل هذه (على سبيل المثال إلى٪ 30-40) ودائما تقريبا استقرار الحيوان السماح لساعات إضافية من التصوير. المستوى الأمثل من التخدير هو بالنسبة لمعظم الفئران التي تحققت مع 1-1.5٪ isoflurane والنتائج في معدلات التنفس من 60-65/min ومعدلات النبض من 400-450/min. في تجارب التصوير لدينا، ونحن نستخدم نموذج الفأر في المقام الأول المعدلة وراثياق (MMTV-C3 وPyMT [1]-الدلالية) التي هي أورام متعددة البؤر، مما يسمح للتصوير من الآفات متعددة في مراحل مختلفة من تطور الورم في نفس الوقت في العاشر متعددة، مواقف ذ خلال جلسة التصوير واحد. هذا يقلل المخاوف بشأن الماوس إلى ماوس الاختلاف فيما يتعلق التجارب الرامية إلى تحديد المرحلة التي تعتمد على ردود العلاجية، ويقلل من عدد الحيوانات اللازمة للتصوير.
نموذج MMTV-PyMT (وغيرها من نماذج سرطان عفوية) تمر بمراحل تدريجية التشريحية المرضية التي يمكن التعرف خلال التصوير intravital، على الرغم من أن انطلاق الآفات المرضية الورم الذي يمكن القيام به خلال التصوير intravital يختلف، وأقل تفصيلا، من أن من النسيجي أقسام 5،17. في المقابل، تميل إلى زرع نماذج تعكس الأورام مرحلة متأخرة أفضل، والخلايا السرطانية وعادة ما يتم عزلها من الأورام المتقدمة. مثل هذه النماذج هي بالتالي أكثر استعدادا لدراسة الورم سدىتفاعلات المرحلة المتأخرة من الأورام الاختلافات في هذه التفاعلات بين مراحل مختلفة.
نعرض أمثلة على كيفية تغيير الصورة الهيكلية النووية التي تحدث بعد موت الخلايا الناجم عن العلاج. في غياب العلاج المضاد للسرطان، قد وضع العلامات هذه الاستراتيجية بدلا أن تستخدم لانقسام الخلايا في الموقع الصورة، توضيح، على سبيل المثال، كيف يتأثر تكاثر الخلايا والسكون من قبل المكروية. في المستقبل، قد وضع العلامات الفلورية مكونات الميتوكوندريا تجعل من الممكن للتغيرات الميتوكوندريا الصورة التي تحدث أثناء موت الخلية أفكارك.
في هذا البروتوكول، وقد أظهرنا أيضا أمثلة على كيفية التفاعل سرطان الخلية خلية الصورة المناعة بعد العلاج، ولكن المكونات الأخرى microenvironmental يمكن أيضا أن تكون تصور والمصورة. القائمة خطوط مراسل المعدلة وراثيا لمكونات انسجة الخلايا الليفية لتشمل تلك (على سبيل المثال، FSP1-EGFP 17، αSMA-RFP 21، COL1A1-EGFP 21) أو خلايا الأوعية الدموية (مثل Tie2-GFP 22؛ VEGF-GFP 23).
Intravital التصوير يسمح التصور في الوقت الحقيقي من التفاعلات والعمليات التي تحدث في الجسم الحي إدارة العلاج الكيميائي التالية. مع التكنولوجيا المتاحة حاليا، أحرزنا تقدما كبيرا في فهم كيفية تأثير خلايا الدم النخاعي الاستجابة العلاجية، ولكن لأن الورم المكروية على درجة من التعقيد، لا تزال هناك حاجة كبيرة لبدء التقدم لتغوص ميكانيكي في بيئة العمليات الأساسية التي تتوسط مقاومة العقاقير. واحدة من أهم التطورات التي لا تزال مطلوبة هو تحديد أفضل علامات للسكان خلية معينة. ويتضح كذلك أهمية تحسين علامات مع اثنين من عناصر الخلية اللحمية أبرز من الثدي المكروية الورم، والخلايا الليفية الخلايا المناعية. كثيرا ما يستخدم α الناعم أكتين العضلات (αSMA) لتحديدالخلايا الليفية، ولكن أعرب أيضا عن البروتين بواسطة خلايا العضلات الملساء الوعائية وخلايا ظهاري عضلي 24. وهكذا، على الرغم من أن الفئران مراسل αSMA-GFP موجودة، وتحديد نوع خلية معينة يجري التالية أثناء تجربة التصوير intravital هو التحدي. وبالمثل، فإن علامة واحدة الفلورسنت مثل EGFP أعرب تحت المروج C-FMS تحديد المجموعات السكانية الفرعية متعددة في كثير من الأحيان من الخلايا المناعية 12،17. وهكذا، رغم أن أحد يود مثالي لاستخدام علامة واحدة لتحديد نوع خلية معينة تعقيد البيولوجيا الأساسية يشكل تحديا كبيرا في استخدام هذا النهج.
واحد حل جزئي لهذه المشكلة هو استخدام تسميات أخرى عن طريق الحقن للتمييز مجموعات سكانية فرعية من الخلايا معربا عن مراسل نفس الفلورسنت. على سبيل المثال، يتم أخذ dextrans الفلورسنت من قبل الضامة، ويمكن استخدامها لتسمية المجموعات السكانية الفرعية البلاعم التي وصفت من قبل C-FMS-EGFP وFsp1-EGFP الفئران المعدلة وراثيا مراسل
على عكس منحنيات استجابة الورم الناتجة عن القياس الفرجار، والتي توفر المعلومات الآلية القليل عن كيف أو لماذا الأورام الرد على علاجية تدار، أو سلسلة النسيجية المستمدة من الأنسجة تحصد في نقاط زمنية مختلفة التي تتطلب الأفواج الكبيرة من الحيوانات، وتقدم تقنية مباشرة، قابلة للقياس الكمي من المعلومات على ديناميات موت الخلايا وعلى التفاعلات بين الخلايا اللحمية مع الخلايا السرطانية في الأفواج الصغيرة. وهكذا، فإن الاستفادة من استخدام الإجراء ذكرت هنا هو أنه يوفر المعلومات الحيوية على الاستجابة للأدوية في سياق المكروية الورم سليمة في الوقت الحقيقي. هذه المعلومات يمكن أن تؤدي إلى معلومات هامة عن العمليات الكامنة التي تدفع الردود العلاجية 5 </ سوب>.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم تضارب المصالح الكشف. أجريت جميع التجارب على الحيوانات وفقا للبروتوكولات المعتمدة IACUC.
Acknowledgments
نشكر J. J. تشيو Cappellani والدعم التقني. وأيد هذا العمل من جانب صناديق من المعهد الوطني للسرطان (U01 CA141451)، وسرطان ستار اتحاد، سوزان جي كومن من أجل العلاج، لونغ ايلاند ممشى يوم 2 لمكافحة سرطان الثدي، وائتلاف مانهاست المرأة ضد سرطان الثدي بالنسبة لي، وعلى قبل الدكتوراه الزمالة من برنامج الثدي إخراج الكونغرس أبحاث السرطان والولايات المتحدة ESNESN هو أيضا حائز على C. سريعة ليزلي ويليام راندولف هيرست مؤسسة المنح الدراسية من كلية العلوم البيولوجية واتسون. وأيد HAA من الأموال من مجلس البحوث في النرويج (160698/V40 و151882)، وجنوب شرق السلطات الصحية الإقليمية (2007060).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| MMTV-PyMT mice | Jackson Laboratory | 2374 | |
| C3(1)-Tag mice | Jackson Laboratory | 13591 | |
| ACTB-ECFP mice | Jackson Laboratory | 3773 | |
| ACTB-H2B-EGFP mice | Jackson Laboratory | 5418 | |
| 1 x PBS | Made in-house | ||
| 2 MD Dextran, Fluorescein-conjugated | Invitrogen | D-7137 | Reconstitute in dH2O (4 mg/mL, store at -20 °C); dilute to 1 mg/ml in 1 x PBS |
| 10 kD Dextran, Alexa Fluor 647-conjugated | Invitrogen | D-22914 | Reconstitute in dH2O (4 mg/mL, store at -20 °C); dilute to 1 mg/ml in 1 x PBS |
| Doxorubicin hydrochloride | Sigma-Aldrich | 44583 | Reconstitute in dH2O and store at 4 °C; dilute in 1 x PBS |
| Isothesia (Isoflurane) | Butler Animal Health Supply | 029450 | 250 ml |
| Propidium iodide | Invitrogen | P3566 | 1 mg/ml; dilute 1:15 in 1 x PBS |
| Nitrogen | |||
| Oxygen | |||
| Equipment | |||
| 18G x 1½" regular bevel needle | BD | 305196 | |
| μManager | Vale Lab, UCSF | www.micro-manager.org | Open-source software |
| Alcohol swab | BD | 326895 | 70% isopropyl alcohol swabs |
| Anesthesia system | Molecular Imaging Products, Co. | ||
| Cover glass | Corning | 2940-245 | No. 1½, 24x50 mm; disinfect with 70% isopropanol wipes |
| Curity gauze sponges (sterile) | Kendall | 6939 | |
| Glass microscope slides | Corning | 2948-75x25 | Pre-cleaned; if not pre-cleaned, disinfect with 70% isopropanol wipes |
| Hardened fine scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | 2 pairs; stainless steel, sharp-sharp tips, straight tip, 26 mm cutting edge, 11 cm length |
| Heated blanket | Gaymar Industries | ||
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | Turn on approximately 30 min before use; sterilize tools at >200 °C for 30 sec |
| Imaris | Bitplane | www.bitplane.com | |
| Krazy Glue | Elmer’s Products | KG484 | |
| Laboratory tape ( ½") | |||
| Laboratory tape (1") | |||
| Lid to a Styrofoam shipping cooler | This will be used as the surgical platform | ||
| Micro dissecting forceps | Roboz | RS-5153 | 1x2 teeth, slight curve, 0.8 mm tip width, 4" length |
| Micro dissecting forceps | Roboz | RS-5135 | Serrated, slight curve, 0.8 mm tip width; 4" length |
| Microscope | Spinning-disk confocal, XYZ Piezo stage, epifluourescence capablility17,25 | ||
| Microscope stage insert | Applied Scientific Instrumentation | Custom fabricated, with two circular imaging ports | |
| MouseOx oximeter, software, and sensors | STARR Life Sciences | www.starrlifesciences.com | |
| Nalgene Super Versi-Dry lab soakers | Thermo Scientific | 74218-00 | Cut into fourths for lining surgical platform |
| Nebulizer | Salter Labs | 8901 | Used to humidify gases; prevents irritation of lung tissues |
| Slip-tip disposable tuberculin syringe (1 ml) | BD | 309659 | |
| Surflo winged infusion set | Terumo | SV-23BLK | 23G x ¾" ultra thin needle, 12" tubing |
| Betadine Spray | Purdue Pharma | BASP3H | |
References
- Egeblad, M., Nakasone, E. S., Werb, Z. Tumors as organs: complex tissues that interface with the entire organism. Dev. Cell. 18, 884-901 (2010).
- Ahn, G. -O., Tseng, D., Liao, C. -H., Dorie, M. J., Czechowicz, A., Brown, J. M. Inhibition of Mac-1 (CD11b/CD18) enhances tumor response to radiation by reducing myeloid cell recruitment. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 8363-8368 (2010).
- Tlsty, T. D., Coussens, L. M. Tumor stroma and regulation of cancer development. Annu. Rev. Pathol. 1, 119-150 (2006).
- DeNardo, D. G., Brennan, D. J., et al. Leukocyte complexity predicts breast cancer survival and functionally regulates response to chemotherapy. Cancer Discov. 1, 54-67 (2011).
- Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., et al. Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance. Cancer Cell. 21, 488-503 (2012).
- Kim, J. B., Stein, R., O'Hare, M. J. Three-dimensional in vitro tissue culture models of breast cancer-- a review. Breast Cancer Res. Treat. 85, 281-291 (2004).
- Gilbert, L. A., Hemann, M. T. DNA damage-mediated induction of a chemoresistant niche. Cell. 143, 355-366 (2010).
- Pittet, M. J., Weissleder, R. Intravital imaging. Cell. 147, 983-991 (2011).
- Lohela, M., Werb, Z. Intravital imaging of stromal cell dynamics in tumors. Curr. Opin. Genet. Dev. 20, 72-78 (2010).
- Boissonnas, A., Fetler, L., Zeelenberg, I. S., Hugues, S., Amigorena, S. In vivo imaging of cytotoxic T cell infiltration and elimination of a solid tumor. J. Exp. Med. 204, 345-356 (2007).
- Breart, B., Lemaître, F., Celli, S., Bousso, P. Two-photon imaging of intratumoral CD8+ T cell cytotoxic activity during adoptive T cell therapy in mice. J. Clin. Invest. 118, 1390-1397 (2008).
- Engelhardt, J. J., Boldajipour, B. Marginating dendritic cells of the tumor microenvironment cross-present tumor antigens and stably engage tumor-specific T cells. Cancer Cell. 21, 402-417 (2012).
- Brown, E., McKee, T., et al. Dynamic imaging of collagen and its modulation in tumors in vivo using second-harmonic generation. Nat. Med. 9, 796-800 (2003).
- Wyckoff, J. B., Wang, Y., et al. Direct visualization of macrophage-assisted tumor cell intravasation in mammary tumors. Cancer Res. 67, 2649-2656 (2007).
- Yuan, F., Salehi, H. A., Boucher, Y., Vasthare, U. S., Tuma, R. F., Jain, R. K. Vascular permeability and microcirculation of gliomas and mammary carcinomas transplanted in rat and mouse cranial windows. Cancer Res. 54, 4564-4568 (1994).
- Jain, R. K., Munn, L. L., Fukumura, D. Dissecting tumour pathophysiology using intravital microscopy. Nat. Rev. Cancer. 2, 266-276 (2002).
- Egeblad, M., Ewald, A. J., et al. Visualizing stromal cell dynamics in different tumor microenvironments by spinning disk confocal microscopy. Dis Model Mech. 1, 155-167 (2008).
- Cheng, N., Lambert, D. L. Mammary Transplantation of Stromal Cells and Carcinoma Cells in C57BL/6J. Mice. J. Vis. Exp. (54), ee2716 (2011).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harb. Protoc. 2011, pdb.prot5563 (2011).
- Sounni, N. E., Dehne, K., et al. Stromal regulation of vessel stability by MMP14 and TGFbeta. Dis. Model Mech. 3, 317-332 (2010).
- Magness, S. T., Bataller, R., Yang, L., Brenner, D. A. A dual reporter gene transgenic mouse demonstrates heterogeneity in hepatic fibrogenic cell populations. Hepatology. 40, 1151-1159 (2004).
- Motoike, T., Loughna, S., et al. Universal GFP reporter for the study of vascular development. Genesis. 28, 75-81 (2000).
- Fukumura, D., Xavier, R., et al. Tumor induction of VEGF promoter activity in stromal cells. Cell. 94, 715-725 (1998).
- Sugimoto, H., Mundel, T. M., Kieran, M. W., Kalluri, R. Identification of fibroblast heterogeneity in the tumor microenvironment. Cancer Biol. Ther. 5, 1640-1646 (2006).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Dynamic, long-term in vivo imaging of tumor-stroma interactions in mouse models of breast cancer using spinning-disk confocal microscopy. Cold Spring Harb. Protoc. 2011, pdb.top97 (2011).
