Summary
Vi beskriver en fremgangsmåte for avbildning respons på anti-kreft-behandling
Abstract
Svulsten mikromiljøet spiller en sentral rolle i startfasen, progresjon, metastasering, og responsen på cancerbehandlinger. Tre-dimensjonale co-kultur-systemer er ofte brukt til å explicate tumor-stroma interaksjoner, inkludert deres rolle i narkotika respons. Imidlertid kan mange av interaksjoner som forekommer in vivo i intakt mikromiljøet ikke være helt replikert i disse in vitro-innstillinger. Dermed har direkte visualisering av disse prosessene i sanntid blitt et viktig verktøy for å forstå tumor respons på behandling og identifisere samspillet mellom kreftceller og stroma som kan påvirke disse svarene. Her har vi gi en fremgangsmåte for å bruke roterende disk konfokalmikroskopi av levende, bedøvde mus å direkte observere narkotika distribusjon, cancerceller responser og endringer i tumor-stroma interaksjoner etter administrasjon av systemisk terapi i brystkreft modeller. Vi beskriver prosedyrer for labeling forskjellige tumor komponenter, behandling av dyr for å observere terapeutiske reaksjoner, og den kirurgiske prosedyren for å utsette tumorvev for bildebehandling opptil 40 timer. Resultatene fra denne protokollen, er time-lapse filmer, hvor slike prosesser som narkotika infiltrasjon, kreft celledød og stromal celle migrasjon kan evalueres ved bildeanalyse programvare.
Introduction
Solide svulster består av to store seksjoner: kreftceller og de stromale bestanddeler (både cellulær og ikke-cellulær) som bistår i å opprettholde et passende miljø for tumorvekst 1. Disse stromale bestanddeler spiller avgjørende roller i utvikling, progresjon og metastasering av mange typer kreft, inkludert de i brystet 2-5. Den stromal miljøet påvirker også terapeutiske tiltak 2,4,5. Således, bestemme hvordan kreftcellene reagerer til konvensjonelle og nye terapier innenfor rammen av det intakte mikromiljøet er viktig for å fremme forståelsen av kreft biologi og forbedre dagens terapeutiske strategier. Videre definerer hvordan kreft celle-stroma interaksjoner endrer etter administrasjon av behandlingen er avgjørende for å forstå biologien til tumor tilbakefall.
Organotypic co-dyrking systemer har vært nyttig for å studere tumor-stroma interaksjoner
Den primære middel for å studere reaksjoner på anti-kreft behandling in vivo har vært gjennom målinger av størrelsen på svulsten og histologiske evaluering av vev avledet fra behandlede dyr eller pasienter. Imidlertid har fremskritt i mikroskopi og fluorescerende reportere over de siste to tiårene aktivert visualisering av inter-og intracellulær prosessermed høy oppløsning i live, bedøvede dyr (intravital imaging) 8. Disse intravital mikroskopi teknologiene har vist seg å være spesielt verdifullt for romlig og tidsmessig dissekere in vivo dynamikken i tumor-stroma interaksjoner på cellenivå og sub-mobilnettet oppløsning 8,9.
Prosesser som har avslørt ved intravital bildebehandling inkluderer anti-tumor T-celle cytotoksisitet 10,11, interaksjoner mellom T-celler og myeloid celler 12, dynamikken i endringene i kollagen sammensetning og organisasjon ved terapeutisk behandling 13, makrofag-avhengig kreft celle intravasation og metastasering 14, og vaskulær permeabilitet 15.
Det er tre viktige krav for intravital bildebehandling. Disse inkluderer hensiktsmessig forberedelse og eksponering av vev for bildebehandling, fluorescerende merking av vevskomponenter av interesse, og en sammenkoblet mikroskopi-kamera system stand anskaffe bilder 16. De vanligste strategier som brukes for å løse disse kravene er: 1) heterotopiske preparater (f.eks inokulering av øret eller øyet orbital), permanent bildebehandling vinduer, eller exteriorized preparater (f.eks dorsal huden klaff), 2) transgene fluorescerende reportere og.. fluorescerende injectables å merke vevskomponenter og 3) multiphoton eller konfokalmikroskopi systemer sammen med photomultiplier rør eller charge-coupled device (CCD) kameraer, henholdsvis 9. Vi bruker en kirurgisk forberedt hud klaff modell for å utsette inguinal melkekjertlene for bildebehandling i bedøvede dyr som uttrykker transgener koder fluorescerende reportere. Bildene er oppnådd over en periode på 12 til 40 timer ved hjelp av en intensivert CCD (ICCD) kamera sammen med en fire-laser spinne disk confocal mikroskop system 17. Imaging på denne måten har tillatt oss å studere slike prosesser som in vivo narkotika distribusjon, scene-avhengige lmemotherapeutic svar, type kjemoterapi-indusert celledød, og myelogen celle atferd 5.
Vi tilbyr en protokoll for intravital avbildning av kreft celle responser til anti-kreft terapi og tumor-stroma interaksjoner i musemodeller av brystkreft. Denne protokollen kan brukes til å spore atferd og død både kreftceller og stromale komponenter med et bredt utvalg av transgene og injiserbare fluorescerende etiketter i både transgene og transplantasjon modeller for perioder på opp til 40 timer i en enkelt avbildning økt.
Protocol
Alle prosedyrene som er beskrevet må utføres i samsvar med retningslinjer og regler for bruk av virveldyr, inkludert forhåndsgodkjenning av den lokale Institutional Animal Care og bruk komité.
1. Generere Mus brysttumorer for Imaging (Transgen eller Orthotopic)
- Generer mammary svulster for bildebehandling bruker genmanipulerte mus modeller (f.eks mus mammary tumor virus lang terminal gjenta [MMTV]-polyoma midten T antigen [PyMT] eller rotte C3 (1) promoter drevet store T antigen (Tag) av SV40 [C3 ( 1)-tag] modeller) eller orthotopic transplantasjon modeller (syngeneic, allogen, eller xenogeneiske).
- Etiketten kreftceller ved å krysse genmodifisert modeller med transgene reporter linjer (f.eks ACTB-ECFP) eller bruke ex vivo manipulasjon av primære kreft celler eller cellelinjer (f.eks transduksjon) etterfulgt av transplantasjon. For et utvalg protokoll for orthotopic transplantasjon, see 18.
2. Visualisere komponenter av svulsten mikromiljøet eller Sub-cellulære komponenter
- Visualisering svulst komponenter ved hjelp transgene etiketter. Crossbreed genmodifisert tumormodeller med transgene reporter mus (f.eks c-FMS-EGFP for myeloide celler eller ACTB-H2B-EGFP for kjerner) eller bruker slike mus som mottakere av transplanterte, merket vev. Dette muliggjør visualisering av kreftcelle-stromale celle interaksjoner i respons på behandlingen eller kjernefysiske forandringer assosiert med celledød, henholdsvis.
- Visualisere mikromiljøet hjelp injectables. Et bredt utvalg av stoffer (f.eks fluorescensmerkede antistoffer eller kjemiske fargestoffer) kan brukes til å merke ulike komponenter i svulsten. Avhengig halveringstiden av fargestoff og responsen en er interessert i sporing kan injiserbare gis før starten av avbildning eller under avbildning økten enten intravenøst (iv). Eller intraperitoneally (ip., en figur).
3. Mikroskoper og Imaging Software
- Mikroskop. En rekke mikroskop systemer og programvare kan anvendes for avbildning av levende mus. De mest brukte systemene er confocal eller multiphoton mikroskoper. Vi bruker en mikro-lensed spinne disk confocal mikroskop (Solamere Technologies, Salt Lake City, Utah) med en ICCD kamera (XR-Mega-10EX S-30, Stanford Photonics, Palo Alto, CA).
- Bildebehandlingsprogrammer. Vi bruker åpen kildekode μManager (Vale Lab, University of California, San Francisco [UCSF]).
- Bildeanalyse. Vi bruker Imaris (Bitplane), Volocity (PerkinElmer), og ImageJ (National Institute of Health [NIH]) for bildeanalyse.
4. (Pre)-behandling av dyr for Imaging
- Inguinal mammary svulster er optimal for bildebehandling ved hjelp av vår protokoll når den lengste diameter måler ca 8 mm eller mindre caliper måleement.
- For avbildning dyr behandlet med et lite molekyl hemmer, terapeutisk antistoff eller kjemoterapeutisk middel, begynner behandling før eller under avbildning som kreves for eksperimentet. For eksempel krever avbildning av narkotika ekstravasasjon og distribusjon administrasjon etter bildebehandling er igangsatt (filmer 1 og 2), mens avbildning av celledød indusert av kjemoterapeutiske stoffet doksorubicin er best fanget ved å starte avbildning 24 timer eller senere etter medikamentell behandling (filmer 3 og 4).
5. Utarbeidelse av Saline for å opprettholde fuktighet og Blood Osmolaritet av Animal under Imaging
- Tegne omtrent 1 ml 1x PBS i en 1 ml sprøyte. Propidium jodid (PI, Invitrogen, 1 mg / ml, fortynnet 1:15) kan legges til denne løsning som vil bli periodisk administrert (ip.) Under avbildning økt. Dette vil gi rom for avbildning av kjerner av døde eller døende celler som har permeable cellemembraner. PI har en svært kort half-livet i blodkar og må derfor gis igjen hele bildebehandling økten.
- Fest en bevinget infusjonssett (23 gauge, ¾ tommer nål, 12 tommers rør) til denne sprøyten og skyv løsningen gjennom slangen inntil en dråpe saltvannsoppløsning utganger spissen av nålen ved enden av slangen.
- Fjern sprøyten fra infusjonssettet, og fylle den med riktig saltløsning.
- Sett på sprøyten til infusjonssett, tar seg ikke å innføre bobler i linjen.
6. Forberedelse av isofluran anestesi System
- Tilsett vann til forstøveren og skru den på plass. Dette vil humidify gassene leveres til dyret, hindrer irritasjon av lungene og forlenge overlevelsen av dyr under langsiktige anestesi.
- Fyll isofluran tanken til topplinjen. FORSIKTIG: isofluran er en potent bedøvelse som også kan påvirke forskeren. Passende vakuumsystemer bør be på plass for å sikre at overskytende gasser fjernes fra området.
- Slå på både oksygen tank og nitrogen stridsvogner og juster flyt. Nitrogenet skal være på rundt 1,0 l / min, mens oksygen bør være på rundt 0,2 l / min (~ 21%).
- Slå på (in-house) vakuum. Vakuumet bør være omtrent 1,2 l / min.
- Bekreft at anestesi linje til induksjon kammeret er åpent, og linjene til kirurgi området og mikroskop er stengt.
- Bekreft at latex puste bag festet til anestesi-systemet er oppblåst. Hvis posen ikke blåses opp, må den skiftes.
- Kontroller gummimembranen på hver av nesen kjegler leverer anestesi til mikroskopet scenen og den kirurgiske plattformen. Hvis gummi begynner å tynne, bytt det.
7. Forberedelse av kirurgiske verktøy og kirurgisk plattform
- Slå på en varm perle sterilisator og la det komme> 200 ° C.
- Vask kirurgisk verktøy i såpe og vann(En pinsett [fortrinnsvis med tenner] og sakser for å skjære gjennom huden på dyret, en pinsett [fortrinnsvis taggete] og sakser for ytterligere eksponering av svulsten).
- Sterilisere kirurgiske verktøy for minst 30 sek ved hjelp av varme perle sterilizer (alternativt kan de kirurgiske verktøy autoklaveres på forhånd).
- La kirurgisk verktøy kjøle samtidig sørge for å unngå forurensing av steriliserte verktøy.
- Samle lokket til en Styrofoam skipsfart kjøligere. Dette vil være din kirurgisk plattform.
- Legg et stykke av en lab soaker på toppen av Styrofoam lokk (nok til å dekke det).
- Påføre et nese kjegle med en linje til anestesi systemet til laboratoriet soaker med laboratorie tape (1 "tape fungerer best her). Sett en 18 G x1 ½" nål gjennom kassett i Styrofoam lokket på hver side av nesen membran for å holde nesen membran festet.
- Sett til side Betadine, steril kompress, to 70% isopropanol kluter, et mikroskoplysbilde, Krazy Glue, og 4 stykker av lab tape (½ "bredde).
8. Utarbeidelse av mikroskop
- Slå på mikroskopet, kameraet og datamaskinen kjører mikroskop.
- Slå på varmeteppet.
- Hvis en invertert mikroskop skal brukes, bør en skreddersydd stadium innsatsen utformes til antatte porter tilsvarende plasseringen av inguinal melkekjertlene. Rengjør scenen setter godt med såpe og vann og tørk. Bruk lab tape (½ "fungerer best) for å sikre dekning glass (# 1.5 tykkelse) over imaging porter og rengjøre hele overflaten med 70% isopropanol. Dekk scenen med sterilt gasbind for å beskytte mot forurensning. Sett scenen innsatsen på scenen og la det lufttørke.
- Riv 4-6 stykker av lab tape (1 "bredde), ca 6 inches i lengde og feste dem til siden av mikroskopet. Disse biter av tape vil bli brukt til å posisjonere nesen membran levere anestesi til dyret av end feste den på plass.
- Riv to stykker av tape (½ tommers bredde) som er omtrent en tomme i lengde. Disse vil bli brukt til å holde den sommerfugl nålen levere PBS til musen og objektglass brukes for å eksponere svulsten på plass.
9. Utsette Inguinal melkekjertlene for Imaging
- Anesthetize dyret i induksjonsovn kammer ved anvendelse av 4% isofluran med 21% oksygen og balanse nitrogen (strømningshastighet på omtrent 1,0 l / min) som bærergassen. Dette bør ta 2-4 min.
- Overfør musen til kirurgisk plattform når det puster dypt og sakte, med ventral vendt opp. Åpne anestesi linje til den kirurgiske plattformen og deretter lukke anestesi linje til induksjon kammeret, i denne for å unngå for høyt trykk i anestesi systemet. Redusere konsentrasjonen av isofluran fra 4% til 2,5% på dette tidspunktet.
- Sjekk pedalen tilbaketrekning refleks for å bekrefte at dyret er tilstrekkelig anesthetized for den kirurgiske prosedyren ved å utføre en fotpute klemme. Dyret er tilstrekkelig bedøvet hvis den ikke reagerer (f.eks rykk eller krøller halen) til fotpute klemme. Hvis dyret reagerer til fotpute knipe, øker konsentrasjonen av isofluran.
- Fest lemmer av musen til den kirurgiske plattform med laboratoriet tape (½ "tape fungerer best for dette).
- (Valgfritt) Når dyret er festet til det kirurgiske plattformen, kan håret fjernes fra baksiden ved hjelp av en elektronisk barbermaskin. Hvis kjemisk hårfjerning er å foretrekke, bør dette gjøres 24-48 timer før operasjonen. Fjerne hår før inngrepet forhindrer kontaminering av det bildedannende nettstedet, som spredt hår kan indusere sterke og akutt immunresponser.
- Desinfisér ventrale overflaten av dyret med 70% isopropanol og kluter Betadine.
- Bruke det første paret med steril saks og tang (med tenner), lage en subkutan ventral midtlinjesnittsom går fra ~ 3 mm over urinrøret til xiphoid prosessen. Pass på å unngå punktering eller skjære gjennom peritoneum.
- Bruke andre par steril saks og pinsetter (taggete), forsiktig løsne huden med inguinal melkekjertlene festet, fra bukhulen.
- Ta et glass objektglass og plassere det mot huden klaff generert i forrige trinn. Plasser lysbildet på en slik måte at mesteparten av svulsten vil sitte flat når musen plassert på scenen, og det påvirker ikke mobiliteten av baklemmene.
- Når objektglass er riktig plassert, feste lysbildet til den ytre overflaten av huden ved hjelp av superlim (f.eks., Krazy Glue).
10. Plassering av mus på scenen
- Fjern laboratoriet tape sikre lemmene av dyret til det kirurgiske plattformen.
- Åpne anestesi linje til mikroskopet scenen og lukke anesthesia linje til den kirurgiske plattformen, i denne rekkefølgen.
- Raskt overføre dyret til mikroskopet scenen.
- Når dyret har blitt overført, posisjon og sikre anestesi linje og nesen kjegle riktig (med f.eks lab tape) for å sikre at musen forblir bedøvet og er i en komfortabel stilling.
- Eksponer svulsten slik at den er plassert på toppen og i sentrum av en av dekslet glassdekket bildebehandling porter i mikroskopet scenen.
- Ved hjelp av okularene, må du kontrollere at svulsten er riktig plassert, og forsiktig tape ned objektglass. Lysbildet skal være sikret løst slik at blodet strømmer til vevet ikke er blokkert. Taping ned objektglass bidrar til å minimere bildebehandling gjenstander introdusert av dyrets puste.
- Sett den iboende intraperitoneal linje med vinger infusjonssettet festet til en 1 ml sprøyte inneholdende sterilt 1x PBS eller saltvann (som eventuelt inneholder et fargestoff som PI) fremstilt under # 5. Inject dyret med 100 ul når IP. linje er satt inn. Fra dette tidspunkt til slutten av det bildedannende sesjon, injiserer dyret med 50 pl saltvann ved 1 hr intervaller (eller 25 ul av saltløsning med PI hvert 30 min).
- Å overvåke dyrets vitale tegn, feste en oksymeter probe (f.eks MouseOx systemet ved Starr Life Sciences, Inc.) 19.
- Dekk musen med en oppvarming teppe for å hindre nedkjøling.
11. Oppkjøpet av bilder
Åpen kildekode μManager (Vale Lab, UCSF) brukes til å skaffe time-lapse bilder. Den rå data er samlet i Imaris (Bitplane) programvare, og kan scoret manuelt av uavhengige observatører, eller analysert i enten Imaris eller annen bildeanalyse programvare (f.eks Volocity [PerkinElmer] eller ImageJ [NIH]).
12. Avliving
På slutten av bildet sesjonen (1-40 hr, avhengig av hvilken type av prosess analysert), blir dyret avlives.
- Konsentrasjonen av isofluorane økes til 4%.
- Dyret observeres inntil 30 sekunder etter den griper puste og deretter fjernet fra scenen.
- Cervikal forvridning er utført for å sikre at dyret er avlivet.
13. Representant Resultater
Intravital avbildning ved hjelp av denne metoden tillater direkte visualisering av forskjellige prosesser, herunder levering av legemidler til tumorer, ekstravasasjon og distribusjon av medikamentet når den når svulsten, celledød ved terapeutisk behandling, og tumor-stroma interaksjoner i respons til celledød 5. Å observere ankomsten av et medikament til svulsten og dens fordeling etter ekstravasasjon inn tumorvev, er dyret injisert mens bildet blir kjøpt. Selv om flere klasser av lmer emotherapeutics svakt fluorescerende (som doksorubicin), mange er ikke. Fluorescensmerket konjugerte dextraner kan brukes som surrogatmarkører for levering av legemidler og diffusjon inn i vev. Figur 2 og film en viser ankomsten av et fluorescein-isothiocyanat (FITC)-konjugert 2 MD dekstran (Invitrogen, 1 mg / ml 1xPBS) injisert iv. inn i en svulst av en MMTV-PyMT; ACTB-ECFP mus.
Etter ankomsten av stoffet inn i svulsten, kan ekstravasasjon og diffusjon gjennom vev avbildes for å bestemme både den intravaskulære halveringstid av et medikament og medikament-distribusjon 5. Film 2 viser ekstravasasjon og distribusjon av Alexa Fluor-647-konjugert 10 kD dekstran (Invitrogen, 1 mg / ml i 1 x PBS) injisert iv. inn i en C3 (1)-Tag; ACTB-ECFP c-fms-EGFP mus under avbildning. Etter sammenstilling av time-lapse filmer i Imaris (Bitplane), er intravaskulær halveringstid og narkotika distribusjon kvantifisert. Å måle intravaskulær halveringstid, Er den midlere fluorescensintensitet i tumor blodkar ved hvert tidspunkt beregnes og plottes mot tiden. Narkotika distribusjon kvantifiseres som en prosent området per totalt svulsten området som er positivt for stoffet.
I tillegg til å spore kinetikkene levering av legemidler til tumorer, er det ofte viktig å bestemme hvordan svulster reagerer på behandling. Som anti-kreft terapier forventes å indusere celledød, kan propidium jodid (PI) flekker eller strukturelle kjernefysiske endringer brukes som en markør for narkotikaindusert celledød 5. Figur 3 viser tumor respons på det cytotoksiske kjemoterapeutiske doksorubicin i en MMTV -PyMT; ACTB-ECFP c-FMS-EGFP mus. I denne trippel transgene MMTV-PyMT; ACTB-ECFP c-FMS-EGFP dyr, ECFP etiketter brystkreft celler (blå), og EGFP etiketter myeloide celler (grønn). Dyret avbildet under denne økten ble gitt doksorubicin 18 timer før bildebehandling begynte og PI ble levert ip hele than bildebehandling sesjon som beskrevet ovenfor. Kreftceller (ACTB-ECFP merking) vises som blå, og døde eller døende celler vises som rødt (PI farging). Tidsseriene presenteres her viser induksjon av doksorubicin-avhengige celledød over tid. Å kvantifisere induksjon av celledød i svulster, er samme type analyse brukes for å bestemme stoffet distribusjon laget, hvor den kvantitative utgang er prosent område per totalt svulsten området som er positiv for PI.
Imaging ved høy forstørrelse kan gi informasjon om hvilken type celledød at kreftceller gjennomgå fem. Film 3 viser resultatene av en avbildning eksperimentet kan spore kjernefysiske endringer som er typiske for apoptotisk celledød i respons til systemisk terapi med doksorubicin. For å visualisere kjerner, havner dyret avbildet under denne økten ACTB-H2B-EGFP reporter i stedet for c-FMS-EGFP reporter, så kjernen av kreftceller er merket i grønt. Dette MMTV-PyMT; ACTB-ECFP; ACTB-H2B-EGFP dyr var administered doksorubicin (8 mg / kg i 1 x PBS) ip 24 timer før starten av filmen, og fikk time injeksjoner av 1 x PBS som inneholder PI (Invitrogen, 1 mg / ml oppløsning fortynnet 1:15). Strukturelle endringer i kjernen av kreft celler kan observeres i en apoptotisk celle ved siden celler som har gjennomgått nekrose (PI-positive celler som viser minimale endringer i kjernefysisk morfologi). Kjerner av apoptotiske celler blir til slutt på grunn av røde opptaket av PI farging (ikke vist). Antallet nekrotiske og apoptotiske hendelser er kvantifisert manuelt for hvert tidspunkt basert på PI-positivitet og kjernekraft morfologi.
Kjemoterapi-indusert kreft celledød resulterer ofte i en reaktiv rekruttering av immunceller i svulstene 2,4,5. Figur 4 viser et eksempel på denne stromal svaret på akutt behandling med doxorubicin. Den MMTV-PyMT; ACTB-ECFP c-FMS-EGFP dyr avbildet her ble administrert doksorubicin (8 mg / kg i 1 x PBS) ip ip. for varigheten av eksperimentet å visualisere celledød. Tidene indikerte representerer antall timer etter doksorubicin behandling, og skalaen strek representerer 100 um. I dette eksperimentet, myeloide celler infiltrere inn i områder av celledød, som indikert av de hvite piler. Å kvantifisere myeloid celle infiltrasjon svulster etter doksorubicin administrasjon, samme type analyse brukes for å bestemme narkotika distribusjon og tumor respons på kjemoterapi brukes, hvor den kvantitative utgang er prosent område per totalt svulsten området som er positiv for EGFP.
I tillegg til å visualisere den samlede stromal respons på kjemoterapi, kan spesialiserte stromale responser også visualiseres 5. Film 4 viser fagocytose av nekrotisk cellemateriale ved en nærliggende celle. Den røde kjernefysisk materiale kan sees blir inntatt av en celle med en large intakt grønn kjerne, som er typisk av makrofager. Den MMTV-PyMT; ACTB-ECFP; ACTB-H2B-EGFP dyr avbildet i denne sesjonen ble administrert doksorubicin (8 mg / kg i 1 x PBS) ip. 24 timer før starten av filmen. Dyret mottok timebaserte injeksjoner av 1 x PBS inneholdende PI (Invitrogen, 1 mg / ml oppløsning fortynnet 1:15). Kjerner (ACTB-EGFP merking) vises som grønn, men blir røde som cellen gjennomgå nekrose.
Figur 1. Eksempel merking av forskjellige tumor komponenter ved hjelp transgene og injiserbare etiketter Dette er en trippel-transgen MMTV-PyMT;. ACTB-ECFP c-FMS-EGFP dyr som kreft celler er merket i blått gjennom uttrykk for ECFP og myeloide celler er merket i grønt gjennom uttrykk for EGFP fra en myeloid-promoter. Dyret ble injisert med propidium jodid (PI, rød, ~ 0,07 mg / ml i 1x PBS) underimaging økt for å visualisere celledød. PI etiketter DNA, men bare krysser cellemembranene av døde eller døende celler. Skala bar = 100 mikrometer.
Figur 2. Drug ekstravasasjon og distribusjon i svulster Denne dobbel-transgen MMTV-PyMT;. ACTB-ECFP dyr som kreft celler er merket i blått gjennom uttrykk for ECFP ble injisert med FITC-konjugert 2 MD dekstran (grønn) under bildebehandling økt for å visualisere hvordan narkotika nå svulster etter iv injeksjon (blå). Tid etter bildebehandling ble initiert er indikert. Skala bar = 100 mikrometer.
Figur 3. Kreftcelle respons på systemisk behandling. En MMTV-PyMT; ACTB-ECFP c-FMS-EGFP dyr behandlet med kjemoterapeutiskenarkotika doksorubicin før avbildning, og injisert med PI (rød, ~ 0,07 mg / ml i 1x PBS) å merke celledød. Dette bildet Serien viser akkumulering av PI farging over tid (som indikert ved hvite piler), som representerer den induksjon av celledød etter doksorubicin behandling. Tid indikert er tid etter doksorubicin behandling. Bilder er maksimal intensitet projeksjoner av en z-stack inneholdende tre bilder i z-aksen. Skala bar = 100 mikrometer.
Figur 4. Myeloid celle respons på kjemoterapi i en MMTV-PyMT; ACTB-ECFP;. C-FMS-EGFP trippel transgene mus administreres doksorubicin 20 hr før bildebehandling Dyret fikk time ip. injeksjoner av PI (rød, ~ 0,07 mg / ml i 1x PBS) til å merke døde celler. Dette bildeserie viser opphopning av EGFP-positive myeloide celler (som indikert av hvite piler) over tid etter doxorubicin behandling. Denne reaktive immunrespons har vist seg å hindre terapeutisk respons på flere klasser av chemotherapies 4,5. Tid indikert er tid etter doksorubicin behandling. Bilder er maksimal intensitet projeksjoner av en z-stack inneholdende tre bilder i z-aksen. Skala bar = 100 mikrometer.
Movie 1. . Levering av legemidler inn i en svulst Dette er en dobbel-transgen MMTV-PyMT; ACTB-ECFP dyr som kreft celler er merket i blått gjennom uttrykk for ECFP. Dyret ble injisert med en 2 MD FITC-konjugert dekstran (grønn) under avbildning sesjon å visualisere hvordan medikamenter nå svulster etter iv injeksjon. Målestokk = 100 mikrometer. Klikk her for å se filmen .
Movie 2. Drug infiltrasjon i tumorvevet En trippel transgene C3 (1)-Tag;. ACTB-ECFP c-fms-EGFP dyret hvor kreftceller er laBeled i blått gjennom uttrykk for ECFP og myeloide celler merket i grønt gjennom uttrykk for EGFP ble injisert iv med en Alexa Fluor 647-konjugert 10 kD dekstran (rød). Synsfeltet er vist umiddelbart etter injeksjon med dekstran. Den dekstran merker utgangspunktet vaskularisasjon raskt extravasates inn tumorvevet, og blir til slutt tatt opp av makrofager. Målestokk = 100 mikrometer. Klikk her for å se filmen .
Movie 3. Avbildning av kjernefysiske endringer etter kjemoterapi-indusert celledød Dette trippel transgene MMTV-PyMT;. ACTB-ECFP; H2B-EGFP dyr ble injisert med doksorubicin før bildebehandling. Nuclear morfologi (grønn), som sporet av uttrykk for en H2B-EGFP fusion protein, gir mulighet for direkte visualisering av kjemoterapi-indusert kjernefysiske strukturelle endringer som er typisk for apoptose som sett for cellen øverst i høyre hjørne. Dyret received halv time ip. injeksjoner av PI (rød) for varigheten av det bildedannende sesjon å merke døde og døende celler. Tid indikert er tid etter doksorubicin behandling 24 hr. Bilder ble kjøpt ved hjelp av en høy forstørrelse objektiv (40x, NA 1,1, vann linse). Målestokk = 15 mikrometer. Klikk her for å se filmen .
Movie 4. Avbildning av kjernefysiske endringer og opptak av død celle materiale etter kjemoterapi-indusert celledød Dette trippel transgene MMTV-PyMT;. ACTB-ECFP; H2B-EGFP dyr ble injisert med doksorubicin før bildebehandling. Nuclear morfologi (grønn), som sporet av uttrykk for en H2B-EGFP fusion protein, gir mulighet for direkte visualisering av kjemoterapi-indusert kjernefysiske strukturelle endringer. Dyret fikk halv time ip. injeksjoner av PI (rød) for varigheten av det bildedannende sesjon å merke døde og døende celler. Bildene ble kjøptved hjelp av en høy forstørrelse objektiv (40 x, 1,1 NA, vann linsen). Mangelen på store strukturelle endringer før merking med PI og endringen i den kjernefysiske morfologi og tap av GFP signalet er indikativ av nekrose-lignende celledød. Den døde materiale er sett blir tatt opp av en celle med en stor kjerne, som er typisk av makrofager. Tid indikert er tid etter doksorubicin behandling 24 hr. Målestokk = 10 mikrometer. Klikk her for å se filmen .
Discussion
Svarene svulster til systemisk behandling in vivo kan være dramatisk forskjellig fra de av kreftceller in vitro, som mikromiljøet påvirker både akutt respons og tilbakefall 5. En av de største hindringene for å explicating in vivo chemoresistance trasé er kompleksiteten i samspillet mellom kreftceller og deres mikromiljø. Særlig fordi solide svulster har utviklet en balanse mellom kreft og stromaceller, perturbasjoner av en komponent, for eksempel celledød som oppstår under anti-kreftbehandling, kan resultere i dramatiske effekter på vev organisasjon.
Den intravital avbildningsteknikk gitt her tillater direkte visualisering av kreft celle-stroma interaksjoner innenfor svulster av levende, bedøvede mus under behandling med anti-kreft narkotika. Vi bruker spinne disk konfokalmikroskopi, som har en relativ begrenset inntrengningsdybde (se 17 (f.eks grunnet infiltrasjon av en merket bestand eller induksjon av celledød), celle motilitet, distribusjon av injiserbare (f.eks for å spore vaskulær lekkasje), og co- lokalisering av fluorescerende signaler 5,12,17,20.
Vi rutinemessig bilde mus for over 6 timer og også utført bildebehandling i over 18 timer. Dette krever opprettholde musene kontinuerlig under anestesi for disse lange tidsperioder. Med riktig anestesi, over 90% av våre dyr overleve 6 timer, og ca 80% overlever over 18 timer. Detaljer om hvordan å utføre langsiktig anestesi har blitt publisert tidligere 19. I vår erfaring, fem faktorer er avgjørende: unngå hypotermi, unngå dehydrering, opprettholde fysiologiske blod oksygenmetning nivåer, usynge fuktet bæregass for isofluran, og holde dyrene på det laveste nivået av anestesi der de ikke viser tegn til smerte. For å opprettholde kroppstemperaturen, holder vi mus under et oppvarmet teppe (ved 38 ° C). Å unngå dehydrering, injiserer vi små mengder saltvann ip gjennom hele imaging prosedyre. For å opprettholde fysiologiske blod oksygenmetning nivåer, starter vi med 21% oksygen i bæregass (snarere enn vanlig 100%). Dette gjør oss i stand til å øke inhalasjon oksygennivå om en mus - timer i et eksperiment - viser en nedgang i blod oksygenmetning. I vår erfaring, øker inhalerte oksygennivået på dette tidspunkt (f.eks 30-40%) nesten alltid vil stabilisere dyret slik at for timer ekstra bildebehandling. Optimalt nivå av anestesi er for de fleste mus oppnådd med 1-1,5% isofluran og resultater i pusten priser av 60-65/min og pulsen av 400-450/min. I våre bildebehandling eksperimenter, bruker vi hovedsakelig transgene mus modells (MMTV-PyMT og C3 [1]-tag) hvor svulster er multifokal, noe som åpner for avbildning av flere lesjoner på ulike stadier av tumor progresjon i parallell på flere x, y posisjoner i løpet av en enkelt avbildning økt. Dette reduserer bekymringer angående musen til mus variasjon med hensyn til forsøk for å identifisere stadium-avhengige terapeutiske responser, og reduserer antallet dyr kreves for avbildning.
Den MMTV-PyMT modell (og andre spontane kreft modeller) går gjennom progressive histopatologiske stadier som kan gjenkjennes under intravital bildebehandling, selv om patologiske oppsetning av tumor lesjoner som kan gjøres i løpet av intravital bildebehandling er forskjellig fra, og mindre detaljert, enn histologiske snitt 5,17. I kontrast, transplantasjon modeller tendens til å reflektere sent stadium svulster best, som kreftcellene vanligvis er isolert fra avanserte svulster. Slike modeller er dermed mer mottagelig for å studere tumor-stromainteraksjoner av sent stadium svulster enn forskjeller i disse interaksjonene mellom ulike stadier.
Vi viser eksempler på hvordan du bilde kjernefysiske strukturelle endringene som skjer etter celledød indusert av terapi. I fravær av anti-kreft-behandling, kan denne merking strategi i stedet brukes til bilde celledeling i situ, belyser for eksempel hvordan celleproliferasjon og dvalen påvirkes av mikromiljøet. I fremtiden kan fluorescerende merking av mitokondrie komponenter gjør det mulig å image mitokondrie endringer som oppstår under apoptotisk celledød.
I denne protokollen, har vi også vist eksempler på hvordan du bilde kreft celle-immune celle interaksjoner etter behandlingen, men andre microenvironmental komponenter kan også visualiseres og avbildes. Eksisterende transgene reporter linjer for stromale komponentene inkluderer de for fibroblaster (f.eks., FSP1-EGFP 17, αSMA-RFP 21, COL1A1-EGFP 21) eller celler av vaskulaturen (f.eks Tie2-GFP 22; VEGF-GFP 23).
Intravital bildebehandling tillater sanntids visualisering av interaksjoner og prosesser som oppstår in vivo etter kjemoterapi. Med dagens teknologi er tilgjengelig, har vi gjort store fremskritt i å forstå hvordan myeloid celler påvirker terapeutisk respons, men fordi svulsten mikromiljøet er så kompleks, er store fremskritt fortsatt behov for å begynne å dykke mekanistisk i prosessene som ligger til grunn miljø-mediert resistens. En av de viktigste fremskritt fremdeles kreves er identifisering av bedre markører for bestemte cellepopulasjoner. Betydningen av bedre markører er godt illustrert med to av de mest fremtredende stromale cellekomponenter av brystsvulst mikromiljøet, fibroblaster og immunceller. α-Glatt muskel aktin (αSMA) er ofte brukt for å identifiserefibroblaster, men proteinet er også uttrykt ved vaskulære glatte muskelceller og korgcellene 24. Derfor, selv om αSMA-GFP reporter mus finnes, bestemme den spesifikke celletype være følgende under en intravital avbildning eksperimentet er utfordrende. Tilsvarende vil en enkelt fluorescerende markør eksempel EGFP uttrykt under c-FMS promotor ofte identifisere flere subpopulasjoner av immunceller 12,17. Dermed, selv om en ville ideelt liker å bruke en enkelt markør for å identifisere en spesifikk celletype kompleksiteten i den underliggende biologi er en stor utfordring i å bruke denne tilnærmingen.
Ett delvis løsning på dette problemet er å bruke injiserbare etiketter til ytterligere differensiere subpopulasjoner av celler som uttrykker det samme fluorescerende reporter. For eksempel, blir fluorescerende dextraner tatt opp av makrofager og kan brukes til å merke macrophage subpopulasjoner som er merket av c-fms-EGFP og Fsp1-EGFP transgene reporter mus
I motsetning til tumor respons kurver generert av caliper måling, som gir lite mekanistisk informasjon om hvordan eller hvorfor svulster reagerer administrert terapeutiske eller histologisk serie avledet fra vev høstet ved ulike tidspunkt som krever store årskull av dyr, gir vår teknikk direkte, kvantifiserbare informasjon på dynamikken i celledød og på interaksjoner stromale celler med kreftceller i små kohorter. Således er fordelen med å bruke fremgangsmåten rapportert her at det gir dynamisk informasjon på narkotika responser i sammenheng med en intakt tumor mikromiljøet i sanntid. Slik informasjon kan føre til viktig innsikt i de underliggende prosessene som driver terapeutiske tiltak 5 </ Sup>.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å avsløre. Alle dyreforsøk ble gjennomført i samsvar med IACUC godkjente protokoller.
Acknowledgments
Vi takker J. Cappellani og J. Qiu for teknisk støtte. Dette arbeidet ble støttet av midler fra National Cancer Institute (U01 CA141451), den Starr Cancer Consortium, Susan G. Komen for Cure, Long Island 2 dagers tur for å bekjempe brystkreft, Manhasset kvinner Coalition Against Breast Cancer til ME, og en pre-doc fra Congressionally Regissert Breast Cancer Research Program, er USA til ESNESN også mottaker av Leslie C. Rask og William Randolph Hearst Foundation Fellowships fra Watson School of Biological Sciences. HAA ble støttet av midler fra Forskningsrådet Norge (160698/V40 og 151882), og Sørøst regionale helseforetakene (2.007.060).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| MMTV-PyMT mice | Jackson Laboratory | 2374 | |
| C3(1)-Tag mice | Jackson Laboratory | 13591 | |
| ACTB-ECFP mice | Jackson Laboratory | 3773 | |
| ACTB-H2B-EGFP mice | Jackson Laboratory | 5418 | |
| 1 x PBS | Made in-house | ||
| 2 MD Dextran, Fluorescein-conjugated | Invitrogen | D-7137 | Reconstitute in dH2O (4 mg/mL, store at -20 °C); dilute to 1 mg/ml in 1 x PBS |
| 10 kD Dextran, Alexa Fluor 647-conjugated | Invitrogen | D-22914 | Reconstitute in dH2O (4 mg/mL, store at -20 °C); dilute to 1 mg/ml in 1 x PBS |
| Doxorubicin hydrochloride | Sigma-Aldrich | 44583 | Reconstitute in dH2O and store at 4 °C; dilute in 1 x PBS |
| Isothesia (Isoflurane) | Butler Animal Health Supply | 029450 | 250 ml |
| Propidium iodide | Invitrogen | P3566 | 1 mg/ml; dilute 1:15 in 1 x PBS |
| Nitrogen | |||
| Oxygen | |||
| Equipment | |||
| 18G x 1½" regular bevel needle | BD | 305196 | |
| μManager | Vale Lab, UCSF | www.micro-manager.org | Open-source software |
| Alcohol swab | BD | 326895 | 70% isopropyl alcohol swabs |
| Anesthesia system | Molecular Imaging Products, Co. | ||
| Cover glass | Corning | 2940-245 | No. 1½, 24x50 mm; disinfect with 70% isopropanol wipes |
| Curity gauze sponges (sterile) | Kendall | 6939 | |
| Glass microscope slides | Corning | 2948-75x25 | Pre-cleaned; if not pre-cleaned, disinfect with 70% isopropanol wipes |
| Hardened fine scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | 2 pairs; stainless steel, sharp-sharp tips, straight tip, 26 mm cutting edge, 11 cm length |
| Heated blanket | Gaymar Industries | ||
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | Turn on approximately 30 min before use; sterilize tools at >200 °C for 30 sec |
| Imaris | Bitplane | www.bitplane.com | |
| Krazy Glue | Elmer’s Products | KG484 | |
| Laboratory tape ( ½") | |||
| Laboratory tape (1") | |||
| Lid to a Styrofoam shipping cooler | This will be used as the surgical platform | ||
| Micro dissecting forceps | Roboz | RS-5153 | 1x2 teeth, slight curve, 0.8 mm tip width, 4" length |
| Micro dissecting forceps | Roboz | RS-5135 | Serrated, slight curve, 0.8 mm tip width; 4" length |
| Microscope | Spinning-disk confocal, XYZ Piezo stage, epifluourescence capablility17,25 | ||
| Microscope stage insert | Applied Scientific Instrumentation | Custom fabricated, with two circular imaging ports | |
| MouseOx oximeter, software, and sensors | STARR Life Sciences | www.starrlifesciences.com | |
| Nalgene Super Versi-Dry lab soakers | Thermo Scientific | 74218-00 | Cut into fourths for lining surgical platform |
| Nebulizer | Salter Labs | 8901 | Used to humidify gases; prevents irritation of lung tissues |
| Slip-tip disposable tuberculin syringe (1 ml) | BD | 309659 | |
| Surflo winged infusion set | Terumo | SV-23BLK | 23G x ¾" ultra thin needle, 12" tubing |
| Betadine Spray | Purdue Pharma | BASP3H | |
References
- Egeblad, M., Nakasone, E. S., Werb, Z. Tumors as organs: complex tissues that interface with the entire organism. Dev. Cell. 18, 884-901 (2010).
- Ahn, G. -O., Tseng, D., Liao, C. -H., Dorie, M. J., Czechowicz, A., Brown, J. M. Inhibition of Mac-1 (CD11b/CD18) enhances tumor response to radiation by reducing myeloid cell recruitment. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 8363-8368 (2010).
- Tlsty, T. D., Coussens, L. M. Tumor stroma and regulation of cancer development. Annu. Rev. Pathol. 1, 119-150 (2006).
- DeNardo, D. G., Brennan, D. J., et al. Leukocyte complexity predicts breast cancer survival and functionally regulates response to chemotherapy. Cancer Discov. 1, 54-67 (2011).
- Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., et al. Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance. Cancer Cell. 21, 488-503 (2012).
- Kim, J. B., Stein, R., O'Hare, M. J. Three-dimensional in vitro tissue culture models of breast cancer-- a review. Breast Cancer Res. Treat. 85, 281-291 (2004).
- Gilbert, L. A., Hemann, M. T. DNA damage-mediated induction of a chemoresistant niche. Cell. 143, 355-366 (2010).
- Pittet, M. J., Weissleder, R. Intravital imaging. Cell. 147, 983-991 (2011).
- Lohela, M., Werb, Z. Intravital imaging of stromal cell dynamics in tumors. Curr. Opin. Genet. Dev. 20, 72-78 (2010).
- Boissonnas, A., Fetler, L., Zeelenberg, I. S., Hugues, S., Amigorena, S. In vivo imaging of cytotoxic T cell infiltration and elimination of a solid tumor. J. Exp. Med. 204, 345-356 (2007).
- Breart, B., Lemaître, F., Celli, S., Bousso, P. Two-photon imaging of intratumoral CD8+ T cell cytotoxic activity during adoptive T cell therapy in mice. J. Clin. Invest. 118, 1390-1397 (2008).
- Engelhardt, J. J., Boldajipour, B. Marginating dendritic cells of the tumor microenvironment cross-present tumor antigens and stably engage tumor-specific T cells. Cancer Cell. 21, 402-417 (2012).
- Brown, E., McKee, T., et al. Dynamic imaging of collagen and its modulation in tumors in vivo using second-harmonic generation. Nat. Med. 9, 796-800 (2003).
- Wyckoff, J. B., Wang, Y., et al. Direct visualization of macrophage-assisted tumor cell intravasation in mammary tumors. Cancer Res. 67, 2649-2656 (2007).
- Yuan, F., Salehi, H. A., Boucher, Y., Vasthare, U. S., Tuma, R. F., Jain, R. K. Vascular permeability and microcirculation of gliomas and mammary carcinomas transplanted in rat and mouse cranial windows. Cancer Res. 54, 4564-4568 (1994).
- Jain, R. K., Munn, L. L., Fukumura, D. Dissecting tumour pathophysiology using intravital microscopy. Nat. Rev. Cancer. 2, 266-276 (2002).
- Egeblad, M., Ewald, A. J., et al. Visualizing stromal cell dynamics in different tumor microenvironments by spinning disk confocal microscopy. Dis Model Mech. 1, 155-167 (2008).
- Cheng, N., Lambert, D. L. Mammary Transplantation of Stromal Cells and Carcinoma Cells in C57BL/6J. Mice. J. Vis. Exp. (54), ee2716 (2011).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harb. Protoc. 2011, pdb.prot5563 (2011).
- Sounni, N. E., Dehne, K., et al. Stromal regulation of vessel stability by MMP14 and TGFbeta. Dis. Model Mech. 3, 317-332 (2010).
- Magness, S. T., Bataller, R., Yang, L., Brenner, D. A. A dual reporter gene transgenic mouse demonstrates heterogeneity in hepatic fibrogenic cell populations. Hepatology. 40, 1151-1159 (2004).
- Motoike, T., Loughna, S., et al. Universal GFP reporter for the study of vascular development. Genesis. 28, 75-81 (2000).
- Fukumura, D., Xavier, R., et al. Tumor induction of VEGF promoter activity in stromal cells. Cell. 94, 715-725 (1998).
- Sugimoto, H., Mundel, T. M., Kieran, M. W., Kalluri, R. Identification of fibroblast heterogeneity in the tumor microenvironment. Cancer Biol. Ther. 5, 1640-1646 (2006).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Dynamic, long-term in vivo imaging of tumor-stroma interactions in mouse models of breast cancer using spinning-disk confocal microscopy. Cold Spring Harb. Protoc. 2011, pdb.top97 (2011).
