Summary
אנו מתארים שיטה לתגובת הדמיה לטיפול נגד הסרטן
Abstract
גידול microenvironment תפקיד מרכזי בייזום בגידול, התקדמות, גרורות, ותגובה לטיפולים אנטי סרטניים. מערכות תלת ממדיות שיתוף התרבות משמשת לעתים קרובות כדי להסביר אינטראקציות גידול stroma, כולל תפקידם בתגובות לסמים. עם זאת, רב של אינטראקציות המתרחשות בגוף חי בmicroenvironment השלם לא יכול להיות משוכפל לחלוטין באלה בהגדרות חוץ גופייה. לפיכך, להדמיה ישירה של תהליכים אלה בזמן האמת הפכה לכלי חשוב בהבנת תגובות גידול לטיפולים וזיהוי יחסי הגומלין בין תאים סרטניים וstroma שיכול להשפיע על תגובות אלה. כאן אנו מספקים שיטה לבאמצעות מיקרוסקופיה confocal דיסק המסתובבת של עכברים חיים, מורדמים להתבונן ישירות סמי הפצה, תגובות ושינויים באינטראקציות גידול stroma בעקבות ממשל של טיפול מערכתי במודלים של סרטן שד תאי סרטן. אנו מתארים נהלים לlabeliרכיבים שונים ng סרטני, טיפול בבעלי חיים להתבוננות תגובות טיפוליות, וההליך כירורגי לחשיפת רקמות סרטניות להדמיה 40 שעות. התוצאות שהתקבלו מפרוטוקול זה הן סרטי זמן לשגות, שבתהליכים כגון חדירת סמים, מוות של תאי סרטן ונדידת תאי סטרומה ניתן להעריך באמצעות תוכנת ניתוח תמונה.
Introduction
גידולים מוצקים מורכבים משני תאים עיקריים: תאים סרטניים ועל מרכיבי סטרומה (תאי ובלתי תאי) המסייעים בשמירה על הסביבה מתאימה לצמיחת גידול 1. מרכיבי סטרומה אלה לשחק תפקיד קריטי בהתפתחות, ההתקדמות, וגרורות של סוגים רבים של סרטן, כוללים אלה של 2-5 שד. סביבת סטרומה משפיעה גם תגובות טיפוליות 2,4,5. לפיכך, קביעה כמה תאים סרטניים מגיבים לטיפולים קונבנציונליים ורומן בהקשר של microenvironment השלם חשוב לקידום ההבנה של ביולוגיה של הסרטן שלנו ושיפור אסטרטגיות טיפול נוכחיות. יתר על כן, ההגדרה כיצד אינטראקציות סרטן התאים stroma לשנות בעקבות מתן הטיפול היא קריטית להבנת הביולוגיה להשנות גידול.
מערכות Organotypic שיתוף culturing היו שימושיות לחקר אינטראקציות גידול stroma
האמצעי העיקרי של בחן את התשובות לטיפול נגד סרטן in vivo עבר מדידות של גודל גידול והערכה היסטולוגית של רקמות מקורם בבעלי חיים או חולים שטופלו. עם זאת, התקדמות במיקרוסקופ וכתבי ניאון בשני העשורים האחרונים אפשרה להדמיה של תהליכים תאיים והבינוברזולוציה גבוהה בבעלי חיים, מורדמים (intravital הדמיה) 8. טכנולוגיות מיקרוסקופיה intravital אלה הוכיחו להיות יקרים במיוחד למרחב ובזמן לנתח בדינמיקה של אינטראקציות vivo גידולי סטרומה ברזולוציה סלולרית והמשנה הסלולר 8,9.
תהליכים שכבר נפרמו על ידי הדמית intravital כוללים cytotoxicity נגד גידול התא T 10,11, אינטראקציות בין תאי T ותאי מיאלואידית 12, את הדינמיקה של שינויים בהרכב קולגן וארגון בעקבות טיפול רפואי 13, intravasation תא הסרטני macrophage התלוי וגרורות 14, וחדירות כלי דם 15.
יש שלוש דרישות עיקריות עבור הדמית intravital. אלה כוללים היערכות מתאימה וחשיפה של רקמות להדמיה, ניאון תיוג של הרקמה של עניין, ומיקרוסקופיה מצלמה לזווג שלystem מסוגל לרכוש תמונות 16. האסטרטגיות הנפוצות ביותר המשמשות לטיפול בדרישות אלו כוללות: 1) הכנות heterotopic (למשל, חיסון של אוזן או עין ההקפה), קבעה ההדמיה חלונות, או תכשירי exteriorized (למשל, דש עור גב), 2) כתבי ניאון ומהונדס.. הזרקת ניאון לתייג מרכיבי רקמות; ו3) מערכות מיקרוסקופיה multiphoton או confocal זיווג עם צינורות מכפילים או תשלום מצמידי התקנים (CCD) מצלמות, בהתאמה 9. אנו משתמשים במודל דש עור ניתוח מוכן לחשוף את בלוטת החלב מפשעתי עבור הדמיה בחיות מורדמות המבטאות transgenes קידוד כתבי ניאון. תמונות מתקבלות על פני תקופה של 12 עד 40 שעות באמצעות התעצם CCD (ICCD) מצלמה יחד עם מערכת של ארבעה ליזר דיסק ספינינג confocal מיקרוסקופ 17. ההדמיה באופן זה אפשרה לנו ללמוד תהליכים כאלה כמו בהפצת סמי vivo, פרק שלב תלויתגובות emotherapeutic, סוג של מות כימותרפיה תא, והתנהגות תא מיאלואידית 5.
אנו מספקים פרוטוקול להדמית intravital של תגובות תא סרטני לטיפול נגד הסרטן ואינטראקציות גידולי סטרומה במודלי עכבר של סרטן השד. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לעקוב אחר ההתנהגויות והמוות של שני תאים סרטניים ורכיבי סטרומה עם מגוון רחב של תוויות ניאון מהונדסות וזריקות במודלים מהונדסים והן השתלה לתקופות של עד 40 שעות בישיבת הדמיה בודדה.
Protocol
כל ההליכים המתוארים חייבים להתבצע בהתאם להנחיות ותקנות לשימוש בבעלי חיים בעלי חוליות, לרבות אישור מראש על ידי הטיפול המקומי המוסדי בעלי החיים ושימוש בועדה.
1. יצירת גידולי עכבר חלב להדמיה (מהונדס או orthotopic)
- לייצר גידולי שד להדמיה באמצעות מודלי עכבר מהונדס גנטי (למשל חוזר עכבר חלב גידול נגיף ארוך מסוף [MMTV]-polyoma אמצע T אנטיגן [PyMT] או אנטיגן T הגדול מונע אמרגן החולדה C3 (1) (Tag) של SV40 [C3 ( 1) תג] דגמים) או מודלי השתלה orthotopic (syngeneic, אלוגנאית, או xenogeneic).
- תווית תאים סרטניים על ידי חציית מודלים מהונדסים גנטי עם קווים הטרנסגניים כתב (למשל ACTB-ECFP) או להשתמש במניפולצית vivo לשעבר של תאי סרטן ראשוניים או קווים סלולריים (למשל תמרה) ואחרי ההשתלה. לפרוטוקול דגימה להשתלת orthotopic, שלee 18.
2. רכיבים חזותיים של גידול microenvironment או רכיבי משנה הסלולר
- Visualizing רכיבים סרטניים באמצעות תוויות מהונדסות. להכליא מודלי גידול מהונדס גנטי בעכברים הטרנסגניים כתב (למשל c-FMS-EGFP לתאי מיאלואידית או ACTB-H2B-EGFP לגרעינים) או להשתמש בעכברים כאלה כמקבל, רקמות מושתלות שכותרתו. זה מאפשר ויזואליזציה של אינטראקציות תא תא סרטני סטרומה בתגובה לטיפול או שינויים גרעיניים הקשורים למוות של תאים, בהתאמה.
- Visualizing microenvironment באמצעות הזרקה. מגוון רחב של סוכנים (למשל נוגדנים שכותרתו fluorescently או צבע כימי) יכול לשמש תווית רכיבים שונים של הגידול. בהתאם לזמן מחצית החיים של הצבע והתגובה אחד לא מתעניייינת במעקב, זריקות יכולות להינתן לפני תחילת ההדמיה או במהלך פגישת ההדמיה או דרך הווריד (IV). או intraperitoneally (IP., איור 1).
3. מיקרוסקופים ותוכנת הדמיה
- מיקרוסקופ. מגוון של מיקרוסקופ מערכות ותוכנה יכול לשמש להדמיה של עכברים חיים. המערכות הנפוצות ביותר הן מיקרוסקופי confocal או multiphoton. אנו משתמשים במיקרוסקופ מייקרו עדשה, ספינינג confocal דיסק (טכנולוגיות Solamere, סולט לייק סיטי, יוטה) עם מצלמת ICCD (-Mega-10EX XR-S-30, סטנפורד פוטוניקס, פאלו אלטו, קליפורניה).
- תוכנת הדמיה. אנו משתמשים μManager תוכנות הקוד הפתוח (Vale מעבדה, אוניברסיטת קליפורניה, סן פרנסיסקו [קליפורניה בסן פרנסיסקו]).
- ניתוח תמונה. אנו משתמשים Imaris (Bitplane), Volocity (PerkinElmer), וImageJ (המכון הלאומי לבריאות [NIH]) לניתוח תמונה.
4. (קדם)-טיפול בבעלי החיים והדמיה
- גידולי חלב מפשעתי הם אופטימליים להדמיה באמצעות הפרוטוקול שלנו, כאשר הקוטר הארוך ביותר מודד כ 8 מ"מ או פחות של קליפר measurement.
- לבעלי חיים שטופלו בהדמית מעכבי מולקולה קטנים, נוגדן רפואי או תרופה כימותרפית, להתחיל טיפול לפני או במהלך הדמיה, כנדרש לצורך הניסוי. לדוגמה, הדמיה של extravasation סמים והפצה דורשת ממשל לאחר ההדמיה כבר יזמה (סרטי 1 ו 2), תוך הדמיה של מות תאים הנגרם על ידי דוקסורוביצין התרופה כימותרפית הוא נתפס על ידי מיטב מתחיל הדמית 24 שעות או במאוחר לאחר טיפול תרופתי (סרטים 3 ו 4).
5. הכנת התמיסה לשתייה ושמירה על אוסמולריות דם של בעלי החיים במהלך ההדמיה
- צייר כ 1 מ"ל של 1x PBS לתוך מזרק 1 מ"ל. יודיד Propidium (PI, Invitrogen, 1 מ"ג / מ"ל, 1:15 המדולל) ניתן להוסיף לפתרון זה שינוהל מעת לעת (IP). במהלך פגישת ההדמיה. זה יאפשר להדמיה של הגרעינים של תאים מתים או גוססים שיש קרום תא חדיר. PI יש hal קצר מאודF-חיים במערכת כלי הדם ויש מחדש מנוהל לכן במשך כל ישיבת ההדמיה.
- צרף סט עירוי מכונף (23 מד, ¾ אינץ' מחט, צינורות אינץ 12) למזרק הזה ולדחוף את הפתרון באמצעות הצינורות עד טיפת יציאות תמיסת מלח קצה המחט בקצה הצינורית.
- הוצא את המזרק מסט העירוי, ולמלא אותו עם תמיסת המלח המתאימה.
- לצרף מחדש את המזרק לסט העירוי, נזהר שלא להציג את הבועות לתוך הקו.
6. הכנת מערכת הרדמת isoflurane
- מוסיף מים עד nebulizer ולדפוק אותו במקום. זה ללחלח את הגזים נמסרו לבעלי החיים, מניעת גירוי של הריאות ולהאריך את ההישרדות של בעלי חיים תחת הרדמה לטווח ארוך.
- מלא את מכל isoflurane לשורה העליונה. זהירות: isoflurane היא חומר הרדמה חזק שיכול להשפיע גם על החוקר. מערכות ואקום מתאימות צריכות בדואר במקום כדי לוודא שגזים עודפים מהשטח.
- הפעל שוב את מכל החמצן ומכל החנקן ולהתאים את הזרימה. החנקן צריך להיות בסביבות 1.0 ליטר / דקה, ואילו החמצן צריך להיות בסביבות 0.2 ליטר / דקה (~ 21%).
- הפעל את הוואקום (בבית). הוואקום צריך להיות כ -1.2 ליטר / דקה.
- ודא ששורת ההרדמה לתא האינדוקציה היא פתוחה, ואת הקווים לאזור הניתוח ומיקרוסקופ סגורים.
- ודא שתיק נשימת הלטקס המחובר למערכת ההרדמה הוא מנופח. אם התיק לא לנפח, להחליף אותו.
- בדקו את סרעפת הגומי על כל אחד מגביעי אף אספקת הרדמה לבמת מיקרוסקופ והפלטפורמה כירורגית. אם הגומי מתחיל דק, החליף אותו.
7. הכנה של כלים כירורגיים וכירורגי Platform
- הפעל מעקר חרוז חם ולתת לו להגיע> 200 ° C.
- שוטף את הכלים כירורגיים במים וסבון(זוג אחד של מלקחיים [רצוי עם שיניים] ומספריים לחיתוך דרך העור של החיה, זוג אחד של מלקחיים [עדיפים משוננים] ומספריים לחשיפה נוספת של גידול).
- לעקר את הכלים כירורגיים ללפחות 30 שניות באמצעות חרוז המעקר החם (או לחלופין, את הכלים כירורגיים ניתן autoclaved מראש).
- תן את הכלים כירורגיים להתקרר תוך הקפדה להימנע מלזהם את הכלים סטריליים.
- לאסוף את המכסה לצידנית קלקר משלוח. זו תהיה פלטפורמת הניתוח שלך.
- מניח חתיכה שתיינית מעבדה על גבי מכסה הקלקר (מספיק כדי לכסות אותה).
- להצמיד חרטום עם קו למערכת ההרדמה לשתיינית מעבדה עם קלטת מעבדה (1 "קלטת עובדת הכי טוב כאן). הכנס 18 G x1 ½" מחט דרך הקלטת לתוך מכסה הקלקר משני צדי החרטום כדי לשמור החרטום מאובטח במקום.
- מניחים בצד פולידין, גזה סטרילית, שני מגבוני isopropanol 70%, מיקרוסקופשקופיות, דבק Krazy, ו 4 חתיכות של קלטת מעבדה (½ רוחב ").
8. הכנת מיקרוסקופ
- הפעל מיקרוסקופ, מצלמה, ומחשב שפועל למיקרוסקופ.
- הפעל את חימום השמיכה.
- אם מיקרוסקופ הפוך הוא לשמש, להוסיף שלב מחוייט צריך להיות מתוכנן עם יציאות הדמיה מתאימות למיקום של בלוטות החלב מפשעתי. נקה את השלב להכניס היטב עם סבון ומים ויבשים. השתמש קלטת מעבדה (½ "עובד הכי טוב) כדי להבטיח כיסוי זכוכית (# 1.5 עובי) על יציאות הדמיה ולנקות את כל פני השטח עם 70% isopropanol. כיסוי הבמה עם גזת סטרילי כדי להגן מפני זיהום. הנח את תותב השלב בשלב ולאפשר לו לייבוש באוויר.
- לקרוע 4-6 חתיכות של קלטת מעבדה (1 "רוחב), כ 6 סנטימטר באורך ולצרף אותם לצד של המיקרוסקופ. חלקים אלה של סרט ישמשו כדי למקם את ההרדמה ומספקת חרטום לבעלי החייםד להדק אותו במקום.
- לקרוע עוד שתי חתיכות של קלטת (½ סנטימטר רוחב) שעל סנטימטר באורך. אלה ישמשו כדי לשמור את מחט פרפר אספקת PBS לעכבר ולשקופיות מיקרוסקופ נהגו לחשוף את הגידול במקום.
9. חשיפת בלוטת החלב מפשעתי לדימות
- הרדם את החיה בתא אינדוקציה באמצעות 4% isoflurane עם חמצן 21% חנקן ואיזון (קצב זרימה בכ 1.0 ליטר / דקה) כגז המוביל. זה אמור לקחת 2-4 דקות.
- העבר את העכבר לפלטפורמה כירורגית ברגע שהוא נושם נשימות עמוקה ואיטיות, עם משטח הגחון פונה כלפי מעלה. פתח את שורת ההרדמה לפלטפורמה כירורגית ולאחר מכן לסגור את קו ההרדמה לתא האינדוקציה, בצו זה כדי למנוע לחץ גבוה מדי במערכת ההרדמה. להפחית את ריכוז isoflurane בין 4% ל -2.5% בשלב זה.
- בדקו את נסיגת דוושת רפלקס כדי לאשר שהחיה היא מספיק anesthetized להליך הניתוחי על ידי ביצוע קמצוץ שודד. החיים הם מורדמים כראוי אם זה לא מגיב (למשל עווית או להתכרבל בזנבו) לקמצוץ שודד. אם בעל החיים מגיבים לקמצוץ שודד, להגדיל את הריכוז של isoflurane.
- אבטח את הגפיים של העכבר לפלטפורמה כירורגית עם קלטת מעבדה (½ קלטת "עובד הכי טוב לכך).
- (אופציונלי) ברגע שהחיה מאובטחת לפלטפורמה כירורגית, שיער ניתן להסירו ממשטח הגחון באמצעות מכונת גילוח חשמלית. אם הסרת שיער כימי עדיפה, זה אמור להיות מבוצע 24-48 שעות לפני הניתוח. הסרת שיער לפני הניתוח מסייעת במניעת זיהום של אתר ההדמיה, כמו שערות תועות יכולות לעורר תגובות חיסוניות חזקות וחריפות.
- לחטא את פני שטח הגחון של בעלי החיים עם מגבוני isopropanol 70% ופולידין.
- שימוש בזוג הראשון של מספריים ומלקחיים (עם שיניים) מעוקרים, לעשות חתך קו אמצע גחון תת עוריתשיוצא מ~ 3 מ"מ מעל השופכה לתהליך xiphoid. תשמרו על עצמך כדי להימנע מהניקוב או חיתוך דרך הצפק.
- שימוש בזוג השני של מספריים ומלקחיים סטריליים (משונן), בעדינות לנתק את העור, עם בלוטת החלב מפשעתי המצורפת, מחלל הצפק.
- קח שקופית מיקרוסקופ זכוכית ולמקם אותה נגד דש העור שנוצר בשלב הקודם. מקם את השקופית באופן כזה שחלק הארי של הגידול יישב שטוח פעם העכבר ממוקם על הבמה, וזה לא מפריע לניידות של הגפיים האחוריים.
- לאחר שקופית מיקרוסקופ כבר מוצבת כראוי, לצרף את השקופית אל פני השטח החיצוניים של העור בעזרת דבק מגע (למשל., Krazy דבק).
10. מיצוב מאוס על הבמה
- הסר את סרט מעבדת אבטחת הגפיים של בעלי החיים לפלטפורמה כירורגית.
- פתח את שורת ההרדמה לבמת מיקרוסקופ ולסגור את anestheקו SIA לפלטפורמה כירורגית, בסדר הזה.
- מהר להעביר את בעל חיים לבמת מיקרוסקופ.
- ברגע שבעלי החיים הועברו, עמדה ולאבטח את קו ההרדמה וחרטום כראוי (באמצעות קלטת מעבדה לדוגמה) כדי להבטיח שהעכבר נשאר מורדם ונמצא בעמדה נוחה.
- לחשוף את הגידול כך שהוא מוצב על ראש, ובמרכזו של אחד מנמלי כיסוי הזכוכית מכוסי ההדמיה בשלב מיקרוסקופ.
- השימוש בעינית, לוודא שהגידול ממוקם כראוי, ובעדינות את קלטת שקופיות מיקרוסקופ. השקופית צריכה להיות מאובטחת באופן רופף כך זרימת דם לרקמה אינה חסומה. מקליט את שקופית מיקרוסקופ מסייע למזער ממצאי הדמיה שהוכנסו על ידי הנשימה של בעל החיים.
- הכנס את קו intraperitoneal שכינה עם העירוי מכונף סט מחובר למזרק 1-מ"ל מכיל 1x PBS סטרילי או תמיסת מלח (אופציונלי המכיל צבע כגון PI) הוכן תחת # 5. InjECT חיה עם 100 μl כאשר ה-IP. קו מוכנס. מנקודת זמן זו ועד לסיומה של פגישת ההדמיה, להזריק את החיה עם 50 μl של מי מלח במרווחי 1 שעה (או 25 μl של מי מלח עם צרכן בכל 30 דקות).
- כדי לעקוב אחר סימנים החיוניים של בעלי החיים, לצרף חללית oximeter (למשל MouseOx מערכת על ידי סטאר מדעי חיים, Inc) 19.
- לכסות את העכבר עם חימום שמיכה כדי למנוע היפותרמיה.
11. רכישת תמונות
תוכנת הקוד הפתוח μManager (Vale מעבדה, קליפורניה בסן פרנסיסקו) משמש לרכישת תמונות זמן לשגות. הנתונים הגולמיים נערכו בתוכנת Imaris (Bitplane), ויכולים להיות בקיע באופן ידני על ידי משקיפים עצמאיים, או שנותחו בשתי תוכנות ניתוח תמונת Imaris או אחרות (למשל Volocity [PerkinElmer] או ImageJ [NIH]).
12. המתת חסד
בסיומה של פגישת התמונה (1-40 שעות, תלוי בסוג של תהליך נתח), החיה מורדמת.
- הריכוז של isofluorane גדל ל 4%.
- בעלי החיים שנצפו עד 30 שניות לאחר שתופס את הנשימה ולאחר מכן הוסרתי מהבמה.
- נקע צוואר רחם מבוצע על מנת להבטיח כי בעל החיים מורדמים.
13. נציג תוצאות
הדמית Intravital שימוש בשיטה זו מאפשרת להדמיה הישירה של תהליכים שונים, כולל אספקת תרופות לגידולים, extravasation והפצה של התרופה ברגע שהוא מגיע אל גידול, מוות של תאים בעקבות טיפול רפואי, ואינטראקציות גידולי סטרומה בתגובה למותו של התא 5. כדי לצפות בהגעתו של תרופה לגידול וההפצה שלה בעקבות extravasation לרקמות סרטניות, החיה מוזרקת ואילו תמונות נרכשות. למרות שמספר סוגים של chemotherapeutics הוא חולשת ניאון (כגון דוקסורוביצין), רבים אינם. Fluorescently dextrans מצומדות יכול לשמש כסמנים פונדקאיים עבור משלוח סמים ודיפוזיה אל תוך רקמות. איור 2 ו1 סרט מראה את ההגעה של fluorescein-isothiocyanate (FITC)-מצומדות 2 MD dextran (Invitrogen, 1 1xPBS מ"ג / מ"ל) הזרקה לוריד. לגידול של MMTV-PyMT; עכבר ACTB-ECFP.
בעקבות הגעתו של הסמים לתוך הגידול, extravasation ודיפוזיה דרך הרקמות ניתן הדמיה כדי לקבוע גם את זמן מחצית החיים של תרופת intravascular והפצת סמים 5. סרט 2 מציג את extravasation וההפצה של אלקסה 10 KD dextran פלואוריד-647-מצומדת (Invitrogen, 1 מ"ג / מ"ל בx PBS 1) הזרקה לוריד. ל( 1) C3-Tag; עכבר c-FMS-EGFP במהלך ההדמיה; ACTB-ECFP. אחרי האוסף של סרטי זמן לשגות בImaris (Bitplane), הפצה חצי מחיים והסמים intravascular היא לכמת. כדי למדוד זמן מחצית חי intravascular, עוצמת הקרינה הממוצעת בכלי דם בגידול בכל נקודת זמן מחושבת וזממה נגד זמן. הפצת סמים היא לכמת כאזור אחוזים לאזור גידול כולל שהנו חיובי לתרופה.
בנוסף למעקב אחר קינטיקה של העברת תרופות לגידולים, הוא לעתים קרובות חשוב כדי לקבוע כיצד גידולים מגיבים לטיפול. כמו טיפולים נגד הסרטן צפויים לגרום למוות של תאים, יודיד מכתים propidium (PI), או שינויים מבניים גרעיניים יכול לשמש כסמן לתא סמי מוות 5. איור 3 מציג את תגובת הגידול לדוקסורוביצין כימותרפיות ציטוטוקסיות בMMTV -PyMT; עכבר c-FMS-EGFP; ACTB-ECFP. בזה מהונדס משולש MMTV-PyMT; ACTB-ECFP; c-FMS-EGFP בעלי חיים, תאי ECFP תוויות סרטן שד (כחול), ותוויות תאי מיאלואידית EGFP (ירוק). החיה צלמה במהלך הפעלה זו הייתה מנוהלת דוקסורוביצין 18 שעות לפני ההדמיה החלה וPI נמסר IP לאורך tהוא חיבור ההדמיה כפי שתואר לעיל. תאים סרטניים (ACTB-ECFP תיוג) מופיעים ככחולים, ותאים מתים או גוססים יופיעו כאדום (מכתים PI). סדרת הזמן מוצגת כאן מראה אינדוקציה של מות דוקסורוביצין התלוי תא לאורך זמן. כדי לכמת את האינדוקציה של מוות של תאים בגידולים, אותו הסוג של ניתוח המשמש לקביעת חלוקת התרופה משמש, שבו התפוקה הכמותית היא אזור אחוזים לאזור גידול כולל שהנו חיובי לצרכן.
הדמיה בהגדלה גדולה יכולה לספק מידע לגבי הסוג של מות תאים שעוברים תאים סרטניים 5. סרט 3 מציג את התוצאות של ניסוי הדמיה למעקב אחר שינויים אופייניים למוות של תאי אפופטוטיים גרעיניים בתגובה לטיפול מערכתי עם דוקסורוביצין. כדי להמחיש גרעינים, החיה צלמה במהלך הפעלה זו אוצר כתב ACTB-H2B-EGFP במקום לכתבת c-FMS-EGFP, כך הגרעינים של תאים סרטניים מסומנים בירוק. זה MMTV-PyMT; ACTB-ECFP; חית ACTB-H2B-EGFP הייתה admדוקסורוביצין inistered (8 מ"ג / ק"ג ב1 x PBS) 24 שעתי IP לפני תחילתו של הסרט, וקבל זריקות שעה של x PBS המכילות 1 PI (Invitrogen, 1 מ"ג / מיליליטר פתרון דילול 1:15). שינויים מבניים בגרעינים של תאים סרטניים ניתן להבחין בתאים אפופטוטיים בסמוך לתאים שעברו נימק (תאי PI חיוביים המציגים שינויים מינימאליים במורפולוגיה גרעינית). גרעינים של תאים אפופטוטיים סופו של דבר הופכים לאדומים עקב הספיגה של כתמי PI (לא מוצג). מספר אירועי נימקים ואפופטוטיים הוא לכמת באופן ידני עבור כל נקודת זמן המבוסס על PI-חיוביות ומורפולוגיה גרעינית.
מוות של תאי סרטן כימותרפיה לעתים קרובות גורם לגיוס של תאי מערכת חיסון מגיב לגידולים 2,4,5. איור 4 מראה דוגמה של תגובת סטרומה זה לטיפול חריף עם דוקסורוביצין. MMTV-PyMT; ACTB-ECFP; c-FMS-EGFP החיה צלמה כאן היה מנוהלת דוקסורוביצין (8 מ"ג / ק"ג בx PBS 1) ה-IP IP PI מדי שעה. לתקופת הניסוי לדמיין מוות של תאים. הפעמים הצביעו מייצגים את מספר השעות לאחר טיפול דוקסורוביצין, וסרגל קנה המידה מייצג 100 מיקרומטר. בניסוי זה, תאי מיאלואידית להסתנן לתחומי מוות של תאים, כפי שעולה מהחצים הלבנים. כדי לכמת את חדירת התאים מיאלואידית לתוך הגידולים הבאים דוקסורוביצין ממשל, אותו הסוג של ניתוח המשמש לקביעת הפצת סמים ותגובת גידול לטיפול כימותרפי משמש, שבו התפוקה הכמותית היא אזור אחוזים לאזור גידול כולל שהנו חיובי לEGFP.
בנוסף להמחשת תגובת סטרומה כוללת לכימותרפיה, תגובות סטרומה מיוחדות יכולות גם להיות דמיינו 5. סרט 4 מראה phagocytosis של חומר תא נימקים בתאים שכנים. החומר הגרעיני האדום ניתן לראות שנצרך על ידי תא עם largדואר גרעין שלם ירוק, שהוא אופייני למקרופאגים. MMTV-PyMT; ACTB-ECFP; חית ACTB-H2B-EGFP צלמה במהלך הפעלה זו הייתה מנוהלת דוקסורוביצין (8 מ"ג / ק"ג בx PBS 1) ה-IP. 24 שעות לפני תחילתו של הסרט. החיה קבלה זריקות שעה של x PBS המכיל PI 1 (Invitrogen, 1 מ"ג / מיליליטר פתרון דילול 1:15). גרעינים (ACTB-EGFP תיוג) מופיעים כירוקים, אבל הופכים אדום כתא עובר נימק.
איור 1. תיוג מדגם של מרכיבי גידול שונים באמצעות תוויות מהונדסות וזריקות זה משולש מהונדס MMTV-PyMT;. ACTB-ECFP; חית c-FMS-EGFP בו תאים סרטניים מסומנים בכחול דרך ביטוי של ECFP ותאי מיאלואידית מסומן ב ירוק דרך ביטוי של EGFP מאמרגן מיאלואידית ספציפית. בעלי החיים הוזרקו לי יודיד propidium (PI, אדום, ~ 0.07 מ"ג / מ"ל ב1x PBS) במהלךפגישת ההדמיה לדמיין מוות של תאים. PI תוויות DNA אלא חוצה את קרום התא של תאים מתים או גוססים בלבד. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר.
איור 2. extravasation סמים והפצה בגידולים מהונדס זה כפול MMTV-PyMT;. חית ACTB-ECFP בו תאים סרטניים מסומנים בכחול דרך ביטוי של ECFP הוזרקו עם 2 MD dextran FITC מצומדות (ירוק) במהלך פגישת ההדמיה לדמיין איך תרופות להגיע גידולים לאחר הזרקת iv (כחול). פעם אחר הדמית יזמה מצוינת. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר.
איור 3. תגובת סרטן תאים לטיפול מערכתי. MMTV-PyMT; ACTB-ECFP; חית c-FMS-EGFP טופלה בכימותרפיותדוקסורוביצין תרופה לפני ההדמיה, והוזרק לי PI (אדום, ~ 0.07 מ"ג / מ"ל ב1x PBS) כדי לתייג את המוות של תאים. סדרת תמונה זו מראה הצטברות של כתמי PI לאורך הזמן (כפי שמצוין על ידי חצים לבנים), המייצגים את האינדוקציה של טיפול דוקסורוביצין הבא מוות של תאים. שעה מצוינת הוא זמן לאחר טיפול דוקסורוביצין. תמונות הן תחזיות עוצמתו מרבית של שלוש תמונות שמכילה Z-מחסנית בציר ה-z. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר.
איור 4. תגובת התא מיאלואידית לכימותרפיה בMMTV-PyMT; ACTB-ECFP;. עכבר c-FMS-EGFP המשולש מהונדס מנוהל 20 שעות לפני דוקסורוביצין הדמית החיה קבלה ip לשעה. זריקות של PI (אדום, ~ 0.07 מ"ג / מ"ל ב1x PBS) כדי לתייג את התאים מתים. סדרת תמונה זו מראה הצטברות של תאי מיאלואידית EGFP חיוביים (כפי שמצוין על ידי חצים לבנים) לאורך הזמן בעקבות doxorubiטיפול cin. תגובה חיסונית מגיבה זה הוכח כדי לעכב תגובה טיפולית למספר סוגים של טיפולי הכימותרפיה 4,5. שעה מצוינת הוא זמן לאחר טיפול דוקסורוביצין. תמונות הן תחזיות עוצמתו מרבית של שלוש תמונות שמכילה Z-מחסנית בציר ה-z. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר.
סרט 1. . אספקת סמים לגידול זה היא כפול מהונדסת MMTV-PyMT; חית ACTB-ECFP בו תאים סרטניים מסומנים בכחול דרך ביטוי של ECFP. בעלי החיים הוזרקו עם 2 MD dextran FITC מצומדות (ירוק) במהלך פגישת ההדמיה כדי להמחיש כיצד תרופות להגיע גידולים לאחר הזרקת iv. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. לחץ כאן לצפייה בסרט.
סרט 2. חדירת התרופה לתוך רקמת גידול משולש מהונדס C3 (1)-Tag;. ACTB-ECFP; חית c-FMS-EGFP שבו תאים סרטניים הם labeled בכחול דרך ביטוי של ECFP ותאי מיאלואידית כותרת בירוק דרך ביטוי של EGFP הוזרק IV עם אלקסה פלואוריד 647 מצומדות 10 KD dextran (אדום). שדה הראייה מוצג מייד לאחר הזרקה עם dextran. Dextran תחילה מתייג vasculature, מהירות extravasates לרקמת גידול, ולבסוף הוא נלקח על ידי מקרופאגים. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. לחץ כאן לצפייה בסרט.
סרט 3. הדמיה של שינויים גרעיניים לאחר מות תא כימותרפיה זה מהונדס משולש MMTV-PyMT;. ACTB-ECFP; חית H2B-EGFP הוזרקה עם דוקסורוביצין לפני ההדמיה. מורפולוגיה גרעינית (ירוק), כפי שמסומנת על ידי ביטוי של חלבון היתוך H2B-EGFP, מאפשרת להדמיה ישירה של שינויי כימותרפיה גרעיניים מבניים אופייניים לאפופטוזיס כמו לראות לתא שבפינה הימנית העליונה. Rece בעלי החייםived IP כל חצי השעה. זריקות של PI (אדום), במשך תקופת הפעלת ההדמיה לתייג תאים מתים וגוססים. שעה מצוינת הוא זמן לאחר טיפול דוקסורוביצין 24 שעות. תמונות נרכשו באמצעות עדשה אובייקטיבי הגדלה גדולה (40X, NA 1.1, עדשת מים). סרגל קנה מידה = 15 מיקרומטר. לחץ כאן לצפייה בסרט.
סרט 4. הדמיה של שינויים וספיגה של חומר תא מת לאחר מוות של תאי כימותרפיה גרעיניים זה מהונדס משולש MMTV-PyMT;. ACTB-ECFP; H2B-EGFP חיה הוזרקה עם דוקסורוביצין לפני ההדמיה. מורפולוגיה גרעינית (ירוק), כפי שמסומנת על ידי ביטוי של חלבון היתוך H2B-EGFP, מאפשרת להדמיה ישירה של שינויים מבניים גרעיניים כימותרפיה. החיה קבלה IP כל חצי השעה. זריקות של PI (אדום), במשך תקופת הפעלת ההדמיה לתייג תאים מתים וגוססים. תמונות נרכשובאמצעות עדשה אובייקטיבי הגדלה גבוהה (40 x, 1.1 NA, עדשת מים). חוסר שינויים מבניים גדולים לפני הסימון בPI והשינוי במורפולוגיה והאובדן הגרעיני של אות ה-GFP מעיד על נימק, כמו מוות של תאים. החומר המת נראה שנלקח על ידי תאים עם גרעין גדול, שהוא אופייני למקרופאגים. שעה מצוינת הוא זמן לאחר טיפול דוקסורוביצין 24 שעות. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. לחץ כאן לצפייה בסרט.
Discussion
את התגובות של גידולים לטיפולים מערכתיים in vivo יכולות להיות שונות באופן דרמטי לאלה של תאים סרטניים במבחנה, כmicroenvironment משפיע גם התגובה והישנות 5 החריפות. אחד המכשולים הגדולים ביותר להבהרה במסלולי chemoresistance vivo הוא המורכבות של יחסי הגומלין בין תאים סרטניים וMicroenvironment. בפרט, משום שגידולים מוצקים פתחו איזון בין הסרטן ותאי סטרומה ביומו של מרכיב אחד, כגון מוות של תאים המתרחש במהלך טיפול נגד הסרטן, עלול לגרום להשפעות דרמטיות על ארגון רקמות.
טכניקת הדמית intravital ספקה כאן מאפשרת להדמיה הישירה של אינטראקציות סרטן התאים stroma בתוך הגידולים של עכברים חיים, מורדמים במהלך טיפול עם תרופות נוגדות סרטן. אנו משתמשים במיקרוסקופ ספינינג confocal דיסק, שבו יש עומק חדירה מוגבלת יחסית (ראה 17 (למשל עקב חדירה של אוכלוסייה או אינדוקצית כותרת של מוות של תאים), תנועתיות תא, חלוקת ההזרקה (למשל כדי לעקוב אחר דליפה של כלי דם), ושיתוף לוקליזציה של אותות ניאון 5,12,17,20.
באופן שוטף אנחנו עכברי תמונה עבור מעל 6 שעות והדמיה גם בצעה במשך 18 שעות. זה מחייב שמירה על העכברים ברציפות תחת הרדמה לפרקי הזמן הארוכים הללו. בהרדמה ראויה, מעל 90% מבעלי החיים שלנו לשרוד 6 שעות, וכ 80% לשרוד במשך 18 שעות. פרטים על אופן ביצוע הרדמה לטווח ארוך כבר פורסם בעבר 19. מניסיוננו, חמישה גורמים הם קריטיים: הימנעות היפותרמיה, הימנעות התייבשות, שמירה על רמות רוויון חמצן בדם פיסיולוגי, uלשיר גז מוביל humidified לisoflurane, ושמירה על בעלי החיים ברמה הנמוכה ביותר של הרדמה שבה הם לא מראים סימנים של כאב. כדי לשמור על טמפרטורת גוף, אנחנו שומרים עכברים מתחת לשמיכה מחוממת (ב38 ° C). כדי למנוע התייבשות, אנחנו מזריקים כמויות קטנות של ה-IP המלוחה לאורך ההליך כל ההדמיה. כדי לשמור על רמות רוויון חמצן בדם פיסיולוגי, אנחנו מתחילים עם חמצן 21% בגז המוביל (ולא 100% בשימוש נפוץ). זה מאפשר לנו להגדיל את רמות חמצן בשאיפה אם עכבר - שעות לניסוי - מראה ירידה בריווי חמצן בדם. מהניסיון שלנו, להגדיל את רמות החמצן בשאיפה בשלב כזה (למשל כדי 30-40%) כמעט תמיד יתייצב החיה המאפשרת שעות של הדמיה נוספת. הרמה האופטימלית של הרדמה היא עבור רוב העכברים שהושגו עם 1-1.5% isoflurane ותוצאות בשיעורי נשימה של דופק של 400-450/min 60-65/min ו. בניסויי ההדמיה שלנו, אנו משתמשים בעיקר במודל עכבר מהונדסs (MMTV-PyMT וC3 [1]-Tag) שבגידולים הן המולטי, המאפשר הדמיה של נגעים מרובים בשלבים שונים של התקדמות גידול במקביל בx המרובה, עמדות y במהלך הדמיה בודדה. זה מקטין חששות לגבי וריאצית עכבר לעכבר ביחס לניסויים שמטרתם איתור תגובות טיפוליות במה תלויה, ומפחית את מספר בעלי החיים הדרושים להדמיה.
מודל MMTV-PyMT (ודגמים אחרים של סרטן ספונטני) לעבור שלבי histopathological מתקדמים שניתן להכיר במהלך הדמית intravital, למרות ההיערכות פתולוגית של נגעים סרטניים שניתן לעשות במהלך הדמית intravital שונה מ, ופחות מפורטת, יותר מזה של סעיפים היסטולוגית 5,17. בניגוד לכך, מודלי השתלה נוטים לשקף גידולים בשלב המאוחר ביותר, כמו התאים הסרטניים בדרך כלל מבודדים מגידולים מתקדמים. מודלים כאלה הם כך נוחים יותר ללימוד גידולי סטרומהאינטראקציות של גידולים בשלב מאוחר מאשר הבדלים באינטראקציות הללו בין שלבים שונים.
אנחנו מראים דוגמאות כיצד שינויים מבניים גרעיניים תמונה המתרחשים לאחר מוות של תאים הנגרם על ידי טיפול. בהעדר הטיפול אנטי סרטני, אסטרטגית תיוג זה עשויה במקום לשמש לחלוקת תא תמונה באתר, הבהרה, לדוגמה, כיצד התפשטות תאים ותרדמת מושפעת microenvironment. בעתיד, ניאון תיוג של רכיבי המיטוכונדריה יכול לעשות את זה אפשרי לשינויי תמונת המיטוכונדריה המתרחשים במהלך מוות של תאים אפופטוטיים.
בפרוטוקול זה, יש לנו גם הראה דוגמאות כיצד אינטראקציות תמונת סרטן תאי תא חיסון לאחר טיפול, אבל רכיבים microenvironmental אחרים יכולים להיות גם נראים והדמיה. קווי כתב מהונדסים קיימים לרכיבי סטרומה כוללים אלה של fibroblasts (למשל., FSP1-EGFP 17, 21 αSMA-RFP, COL1A1-EG21 FP) או תאים של כלי הדם (למשל Tie2-GFP 22; VEGF-GFP 23).
Intravital ההדמיה מאפשרת הדמיה בזמן האמת של יחסי הגומלין ותהליכים המתרחשים בממשל כימותרפיה הבא vivo. בעזרת הטכנולוגיה זמינה כרגע, יש לנו התקדמות משמעותית בהבנה כיצד תאי מיאלואידית להשפיע תגובה טיפולית, עם זאת, כי גידול microenvironment הוא כל כך מורכב, התקדמות גדולה עדיין תהיה צורך להתחיל להתעמק מכאני לתוך התהליכים העומדים בבסיס התנגדות לתרופת סביבה בתיווך. אחד הפיתוחים החשובים ביותר עדיין נדרשים הוא זיהוי של סמנים טובים יותר לאוכלוסיות תאים ספציפיות. החשיבות של סמנים טובים יותר מודגמת היטב בשניים ממרכיבי התא סטרומה הבולטים של microenvironment גידולי סרטן השד, fibroblasts ותאי מערכת חיסון. השריר יקטין α-Smooth (αSMA) משמש לעתים קרובות כדי לזהותfibroblasts, אבל החלבון בא לידי ביטוי גם על ידי תאי שריר חלק של כלי דם ותאי myoepithelial 24. כך, למרות שעכברי הכתב αSMA-GFP קיימים, קביעת סוג התא המסוים להיות בא במהלך ניסוי הדמית intravital היא מאתגרת. בדומה לכך, סמן ניאון בודד כגון EGFP הביע תחת אמרגן c-FMS יהיה לעתים קרובות לזהות אוכלוסיות רבות של תאים חיסוניים 12,17. לכן, למרות שאחד באופן אידיאלי הייתי רוצה להשתמש בסמן יחיד לזיהוי סוג תא מסוים את המורכבות של הביולוגיה הבסיסית מהוות אתגר מרכזי בשימוש בגישה זו.
פתרון חלקי אחד לבעיה זו הוא שימוש בתוויות בזריקות כדי לבדל אוכלוסיות של תאים המבטאים את אותו כתב ניאון נוסף. לדוגמה, dextrans ניאון הם נלקחו על ידי מקרופאגים וניתן להשתמש בו כדי לתייג את אוכלוסיות macrophage שמתויגים על ידי c-FMS-EGFP והעכברים הטרנסגניים כתב Fsp1-EGFP
בניגוד לעקומות תגובת גידול שנוצרו על ידי קליפר מדידה, המספק מידע מכניסטית קצת על איך או למה להגיב לגידולים הטיפוליים מנוהל, או הסדרה היסטולוגית נגזרים מרקמות שנקטפו בנקודתי זמן שונים הדורשות קבוצות גדולות של בעלי חיים, הטכניקה שלנו מספקת מידע ישיר, כימות על הדינמיקה של מוות של תאים ועל יחסי הגומלין של תאי סטרומה עם תאים סרטניים בקבוצות קטנות. לפיכך, היתרון של שימוש בהליך דיווח כאן הוא שהיא מספקת מידע דינמי על תגובות סמים בהקשר של גידול microenvironment השלם בזמן האמת. מידע כזה יכול להוביל לתובנה חשובות בתהליכים הפנימיים המניעים את תגובה טיפולית 5 </ Sup>.
Disclosures
המחברים אין ניגודי עניינים לחשוף. כל הניסויים בבעלי החיים בוצעו בהתאם לפרוטוקולים שאושרו IACUC.
Acknowledgments
אנו מודים לג' וג' Cappellani צ'יו לתמיכה טכנית. עבודה זו נתמכה על ידי קרנות מהמכון הלאומי לסרטן (U01 CA141451), סטאר סרטן Consortium, סוזן ג'קומן לריפוי, לונג איילנד יצא יום 2 למאבק בסרטן השד, קואליציית נשי Manhasset נגד סרטן השד לי, ו מלגת קדם דוקטורט מהתכנית לחקר סרטן שד בימוי congressionally, ארה"ב ESNESN היא גם מקבלת מלגות לסלי ג ויליאם רנדולף הרסט קרן המהירה ומבית הספר ווטסון של מדעי ביולוגיה. Haa נתמך על ידי כספים ממועצת המחקר של נורבגיה (160698/V40 ו151882), ורשויות בריאות אזורית דרום מזרח (2007060).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| MMTV-PyMT mice | Jackson Laboratory | 2374 | |
| C3(1)-Tag mice | Jackson Laboratory | 13591 | |
| ACTB-ECFP mice | Jackson Laboratory | 3773 | |
| ACTB-H2B-EGFP mice | Jackson Laboratory | 5418 | |
| 1 x PBS | Made in-house | ||
| 2 MD Dextran, Fluorescein-conjugated | Invitrogen | D-7137 | Reconstitute in dH2O (4 mg/mL, store at -20 °C); dilute to 1 mg/ml in 1 x PBS |
| 10 kD Dextran, Alexa Fluor 647-conjugated | Invitrogen | D-22914 | Reconstitute in dH2O (4 mg/mL, store at -20 °C); dilute to 1 mg/ml in 1 x PBS |
| Doxorubicin hydrochloride | Sigma-Aldrich | 44583 | Reconstitute in dH2O and store at 4 °C; dilute in 1 x PBS |
| Isothesia (Isoflurane) | Butler Animal Health Supply | 029450 | 250 ml |
| Propidium iodide | Invitrogen | P3566 | 1 mg/ml; dilute 1:15 in 1 x PBS |
| Nitrogen | |||
| Oxygen | |||
| Equipment | |||
| 18G x 1½" regular bevel needle | BD | 305196 | |
| μManager | Vale Lab, UCSF | www.micro-manager.org | Open-source software |
| Alcohol swab | BD | 326895 | 70% isopropyl alcohol swabs |
| Anesthesia system | Molecular Imaging Products, Co. | ||
| Cover glass | Corning | 2940-245 | No. 1½, 24x50 mm; disinfect with 70% isopropanol wipes |
| Curity gauze sponges (sterile) | Kendall | 6939 | |
| Glass microscope slides | Corning | 2948-75x25 | Pre-cleaned; if not pre-cleaned, disinfect with 70% isopropanol wipes |
| Hardened fine scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | 2 pairs; stainless steel, sharp-sharp tips, straight tip, 26 mm cutting edge, 11 cm length |
| Heated blanket | Gaymar Industries | ||
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | Turn on approximately 30 min before use; sterilize tools at >200 °C for 30 sec |
| Imaris | Bitplane | www.bitplane.com | |
| Krazy Glue | Elmer’s Products | KG484 | |
| Laboratory tape ( ½") | |||
| Laboratory tape (1") | |||
| Lid to a Styrofoam shipping cooler | This will be used as the surgical platform | ||
| Micro dissecting forceps | Roboz | RS-5153 | 1x2 teeth, slight curve, 0.8 mm tip width, 4" length |
| Micro dissecting forceps | Roboz | RS-5135 | Serrated, slight curve, 0.8 mm tip width; 4" length |
| Microscope | Spinning-disk confocal, XYZ Piezo stage, epifluourescence capablility17,25 | ||
| Microscope stage insert | Applied Scientific Instrumentation | Custom fabricated, with two circular imaging ports | |
| MouseOx oximeter, software, and sensors | STARR Life Sciences | www.starrlifesciences.com | |
| Nalgene Super Versi-Dry lab soakers | Thermo Scientific | 74218-00 | Cut into fourths for lining surgical platform |
| Nebulizer | Salter Labs | 8901 | Used to humidify gases; prevents irritation of lung tissues |
| Slip-tip disposable tuberculin syringe (1 ml) | BD | 309659 | |
| Surflo winged infusion set | Terumo | SV-23BLK | 23G x ¾" ultra thin needle, 12" tubing |
| Betadine Spray | Purdue Pharma | BASP3H | |
References
- Egeblad, M., Nakasone, E. S., Werb, Z. Tumors as organs: complex tissues that interface with the entire organism. Dev. Cell. 18, 884-901 (2010).
- Ahn, G. -O., Tseng, D., Liao, C. -H., Dorie, M. J., Czechowicz, A., Brown, J. M. Inhibition of Mac-1 (CD11b/CD18) enhances tumor response to radiation by reducing myeloid cell recruitment. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 8363-8368 (2010).
- Tlsty, T. D., Coussens, L. M. Tumor stroma and regulation of cancer development. Annu. Rev. Pathol. 1, 119-150 (2006).
- DeNardo, D. G., Brennan, D. J., et al. Leukocyte complexity predicts breast cancer survival and functionally regulates response to chemotherapy. Cancer Discov. 1, 54-67 (2011).
- Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., et al. Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance. Cancer Cell. 21, 488-503 (2012).
- Kim, J. B., Stein, R., O'Hare, M. J. Three-dimensional in vitro tissue culture models of breast cancer-- a review. Breast Cancer Res. Treat. 85, 281-291 (2004).
- Gilbert, L. A., Hemann, M. T. DNA damage-mediated induction of a chemoresistant niche. Cell. 143, 355-366 (2010).
- Pittet, M. J., Weissleder, R. Intravital imaging. Cell. 147, 983-991 (2011).
- Lohela, M., Werb, Z. Intravital imaging of stromal cell dynamics in tumors. Curr. Opin. Genet. Dev. 20, 72-78 (2010).
- Boissonnas, A., Fetler, L., Zeelenberg, I. S., Hugues, S., Amigorena, S. In vivo imaging of cytotoxic T cell infiltration and elimination of a solid tumor. J. Exp. Med. 204, 345-356 (2007).
- Breart, B., Lemaître, F., Celli, S., Bousso, P. Two-photon imaging of intratumoral CD8+ T cell cytotoxic activity during adoptive T cell therapy in mice. J. Clin. Invest. 118, 1390-1397 (2008).
- Engelhardt, J. J., Boldajipour, B. Marginating dendritic cells of the tumor microenvironment cross-present tumor antigens and stably engage tumor-specific T cells. Cancer Cell. 21, 402-417 (2012).
- Brown, E., McKee, T., et al. Dynamic imaging of collagen and its modulation in tumors in vivo using second-harmonic generation. Nat. Med. 9, 796-800 (2003).
- Wyckoff, J. B., Wang, Y., et al. Direct visualization of macrophage-assisted tumor cell intravasation in mammary tumors. Cancer Res. 67, 2649-2656 (2007).
- Yuan, F., Salehi, H. A., Boucher, Y., Vasthare, U. S., Tuma, R. F., Jain, R. K. Vascular permeability and microcirculation of gliomas and mammary carcinomas transplanted in rat and mouse cranial windows. Cancer Res. 54, 4564-4568 (1994).
- Jain, R. K., Munn, L. L., Fukumura, D. Dissecting tumour pathophysiology using intravital microscopy. Nat. Rev. Cancer. 2, 266-276 (2002).
- Egeblad, M., Ewald, A. J., et al. Visualizing stromal cell dynamics in different tumor microenvironments by spinning disk confocal microscopy. Dis Model Mech. 1, 155-167 (2008).
- Cheng, N., Lambert, D. L. Mammary Transplantation of Stromal Cells and Carcinoma Cells in C57BL/6J. Mice. J. Vis. Exp. (54), ee2716 (2011).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harb. Protoc. 2011, pdb.prot5563 (2011).
- Sounni, N. E., Dehne, K., et al. Stromal regulation of vessel stability by MMP14 and TGFbeta. Dis. Model Mech. 3, 317-332 (2010).
- Magness, S. T., Bataller, R., Yang, L., Brenner, D. A. A dual reporter gene transgenic mouse demonstrates heterogeneity in hepatic fibrogenic cell populations. Hepatology. 40, 1151-1159 (2004).
- Motoike, T., Loughna, S., et al. Universal GFP reporter for the study of vascular development. Genesis. 28, 75-81 (2000).
- Fukumura, D., Xavier, R., et al. Tumor induction of VEGF promoter activity in stromal cells. Cell. 94, 715-725 (1998).
- Sugimoto, H., Mundel, T. M., Kieran, M. W., Kalluri, R. Identification of fibroblast heterogeneity in the tumor microenvironment. Cancer Biol. Ther. 5, 1640-1646 (2006).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Dynamic, long-term in vivo imaging of tumor-stroma interactions in mouse models of breast cancer using spinning-disk confocal microscopy. Cold Spring Harb. Protoc. 2011, pdb.top97 (2011).
