Summary
Vi beskriver en fremgangsmåde til afbildning reaktion på anti-cancerbehandling
Abstract
Den tumor mikromiljø spiller en central rolle i tumor initiering, progression, metastase, og reaktionen på cancerbehandling. Tredimensionelle co-kultursystemer anvendes ofte til at præcisere, tumor-stroma interaktioner, herunder deres rolle i lægemiddel-respons. Imidlertid kan mange af de interaktioner, der forekommer in vivo i intakt mikromiljø ikke fuldstændig kopieret i disse in vitro-indstillinger. Således har direkte visualisering af disse processer i real-tid blevet et vigtigt redskab i forståelsen tumor responser til behandlinger og identificere samspillet mellem kræftceller og stroma, der kan påvirke disse reaktioner. Her vi en fremgangsmåde til anvendelse af roterende skive konfokal mikroskopi af levende, bedøvede mus til direkte se narkotikadistributionskanalerne, cancer celleresponser og ændringer i tumor-stroma interaktioner efter administration af systemisk terapi i brystkræft-modeller. Vi beskriver procedurerne for labeling forskellige tumor-komponenter, behandling af dyr til observation terapeutiske reaktioner, og det kirurgiske indgreb for at udsætte tumorvæv til billeddannelse op til 40 timer. Resultaterne fra denne protokol, er time-lapse film, hvor sådanne processer som lægemiddel infiltration, kræft celledød og stromal cellemigration kan vurderes ved hjælp af billedanalyse software.
Introduction
Solide tumorer består af to store rum: kræft celler og de stromale bestanddele (både cellulær og ikke-cellulær), der medvirker til at bevare et passende miljø for tumorvækst 1. Disse stromale bestanddele spiller afgørende roller i udvikling, progression og metastasering af mange typer af kræft, herunder i brystet 2-5. Det stromale miljø påvirker også terapeutiske responser 2,4,5. Således, at bestemme, hvor cancerceller reagerer på konventionelle og nye behandlingsformer i forbindelse med det intakte mikromiljø er vigtigt for at fremme vores forståelse af cancer biologi og forbedring af nuværende terapeutiske strategier. Desuden definerer, hvordan kræft celle-stroma interaktioner ændre sig efter administration af behandling er afgørende for at forstå biologi tumor tilbagefald.
Organotypiske co-dyrkning systemer har været anvendelige til at studere tumor-stroma interaktion
De primære midler til at studere reaktionerne på anti-cancer terapi in vivo har været igennem målinger af tumorstørrelse og histologisk vurdering af væv fra behandlede dyr eller patienter. Imidlertid har fremskridt inden for mikroskopi og fluorescerende reportere i løbet af de seneste to årtier muliggjort visualisering af inter-og intracellulære processerved høj opløsning med levende, bedøvede dyr (intravital billeddannelse) 8. Disse intravital mikroskopi teknologier har vist sig at være særligt værdifulde til rumligt og tidsligt dissekere in vivo dynamik tumor-stroma vekselvirkninger på cellulære og subcellulære opløsning 8,9.
Processer, der er blevet bragt i orden ved intravital billeddannelse indbefatter anti-tumor T-celle cytotoksicitet 10,11, interaktioner mellem T-celler og myeloide celler 12, dynamikken af ændringer i collagenpræparatet og organisation efter terapeutisk behandling 13, makrofag-afhængig cancer cell intravasation og metastase 14 og vaskulær permeabilitet 15.
Der er tre store krav til intravital billeddannelse. Disse omfatter passende forberedelse og eksponering af væv til billeddannelse, fluorescerende mærkning af væv komponenter af interesse, og en parret mikroskopi-kamera system er i stand til at erhverve billeder 16. De mest almindelige strategier, der anvendes til at tage fat på disse krav omfatter: 1) heterotopiske præparater (f.eks podning af øret eller øjet orbital), permanent imaging vinduer eller blotlagt præparater (f.eks dorsalhud klap), 2) transgene fluorescerende reportere og.. fluorescerende injectables at mærke vævskomponenter og 3) multiphoton eller konfokal mikroskopi-systemer parret med fotomultiplikatorrør eller charge-coupled device (CCD) kameraer, henholdsvis 9. Vi anvender en kirurgisk forberedt hudlap model for at blotlægge inguinal brystkirtel til billeddannelse hos bedøvede dyr, som udtrykker transgener der koder for fluorescerende reportere. Billeder opnås i løbet af en periode på 12 til 40 timer ved hjælp af en intensiveret CCD (ICCD) kamera parret med en fire-laser spinning disk konfokal mikroskop system 17. Billeddannelse på denne måde har gjort det muligt at studere sådanne processer som in vivo medikamentfordeling, fase-afhængig chemotherapeutic reaktioner, type af kemoterapi-induceret celledød, og myeloid celle adfærd 5.
Vi leverer en protokol til intravital billeddannelse af kræft celle respons på anti-cancer terapi og tumor-stroma interaktioner i musemodeller af brystkræft. Denne protokol kan bruges til at spore den adfærd og dødsfald blandt både kræftceller og stromale komponenter med en bred vifte af transgene og injicerbare fluorescensmærker i både transgene og transplantation modeller for perioder på op til 40 timer i en enkelt imaging session.
Protocol
Alle beskrevne procedurer skal udføres i overensstemmelse med de retningslinjer og regler for brug af hvirveldyr, herunder forudgående godkendelse af den lokale Institutional Animal Care og Use Udvalg.
1. Generering Mouse brysttumorer for Imaging (Transgenic eller ortotopisk)
- Generere brysttumorer til billeddannelse ved hjælp af gensplejsede musemodeller (f.eks muse-mammatumorvirus long terminal repeat [MMTV]-polyoma midten T-antigen [PyMT] eller rotte-C3 (1) promoter drevet stort T antigen (Tag) af SV40 [C3 ( 1)-TAG] modeller) eller ortotopisk transplantation modeller (syngene, allogene eller xenogene).
- Label cancerceller ved at krydse genetisk manipulerede modeller med transgene reporter linier (f.eks ACTB-ECFP) eller anvender ex vivo manipulation af primære cancerceller eller cellelinier (f.eks transduktion) efterfulgt af transplantation. For en prøve protokol for orthotopisk transplantation, see 18.
2. Visualisere Komponenter i den tumormikromiljøet eller Sub-cellulære bestanddele
- Visualisering tumor komponenter ved hjælp af transgene etiketter. Krydse gensplejsede tumormodeller med transgene reporter mus (fx c-fms-EGFP for myeloide celler eller ACTB-H2B-EGFP for kerner) eller bruge sådanne mus som modtagere af transplanterede, mærkede væv. Dette muliggør visualisering af cancercelle-stromale celle-vekselvirkninger som reaktion på terapi eller nukleare ændringer forbundet med celledød, hhv.
- Visualisere mikromiljø med injectables. Mange forskellige midler (f.eks fluorescensmærkede antistoffer eller kemiske farvestoffer) kan anvendes til at mærke forskellige komponenter i tumoren. Afhængig af halveringstiden af farvestoffet og reaktionen man er interesseret i tracking, kan det injicerbare indgives før starten af billeddannelse eller under den billeddannende samling enten intravenøst (iv.) Eller intraperitoneally (ip. figur 1).
3. Mikroskoper og Imaging Software
- Microscope. Forskellige mikroskop systemer og software kan anvendes til billeddannelse af levende mus. De mest almindeligt anvendte systemer er konfokale eller multiphoton mikroskoper. Vi bruger en mikro-lensed spinning disk konfokal mikroskop (Solamere Technologies, Salt Lake City, UT) med et ICCD kamera (XR-Mega-10EX S-30, Stanford Photonics, Palo Alto, CA).
- Imaging software. Vi bruger open source software μManager (Vale Lab, University of California, San Francisco [UCSF]).
- Billedanalyse. Vi bruger Imaris (Bitplane), Volocity (PerkinElmer), og ImageJ (National Institute of Health [NIH]) for billedanalyse.
4. (Pre)-behandling af dyr for Imaging
- Lyskelymfeknuder mammatumorer er optimale til billeddannelse ved hjælp af vores protokol, når den længste diameter måler ca 8 mm eller derunder skydelære måleement.
- Til billeddannelse af dyr behandlet med et lille molekyle inhibitor, terapeutisk antistof eller kemoterapeutisk lægemiddel, påbegynder behandling før eller under billeddannelse som krævet til forsøget. For eksempel kræver billeddannelse af lægemiddel ekstravasation og distribution administration efter billeddannelse er indledt (film 1 og 2), mens billeddannelse af celledød induceret af det kemoterapeutiske lægemiddel doxorubicin bedst opfanges ved at starte billeddannelse 24 timer eller derover efter lægemiddelbehandling (film 3 og 4).
5. Fremstilling af Saline til opretholdelse Hydrering og Blood osmolaritet dyret under Imaging
- Trække cirka 1 ml 1x PBS til en 1 ml sprøjte. Propidiumiodid (PI, Invitrogen, 1 mg / ml, fortyndet 1:15) kan tilsættes til denne opløsning, der tages regelmæssigt indgives (ip.) Under den billeddannende samling. Dette giver mulighed for billeddannelse af kerner af døde eller døende celler, som har permeable cellemembraner. PI har en meget kort half-livet i karrene, og derfor skal readministreret hele imaging session.
- Vedhæfte en vinget infusionssæt (23 gauge, ¾ inch nål, 12 inch rør) af denne sprøjte og skubbe opløsningen gennem røret indtil en dråbe saltopløsning forlader spidsen af nålen ved afslutningen af slangen.
- Fjern sprøjten fra infusionssættet, og fyld den med passende saltopløsning.
- Montér sprøjten til infusionssæt, pas på ikke at indføre bobler i slangen.
6. Fremstilling af isofluran anæstesi System
- Tilsæt vand til forstøveren, og skru det på plads. Dette vil befugte gassen leveret til dyr, forhindrer irritation af lungerne og forlænge overlevelsen af dyrene under langvarig anæstesi.
- Fyld isofluran tank til den øverste linje. ADVARSEL: Isofluran er en potent bedøvelse, der også kan påvirke forskeren. Passende vakuumsystemer skulle be på plads for at sikre, at overskydende gasser fjernes fra området.
- Tænder både ilt tank og nitrogen tanke og justere strømmen. Nitrogenet bør være på omkring 1,0 l / min, medens oxygen bør være på omkring 0,2 l / min (~ 21%).
- Tænd for (in-house) vakuum. Vakuummet bør være omkring 1,2 l / minut.
- Bekræfter, at anæstesi linje til induktion kammeret er åbent, og linierne til operationsområde og mikroskop er lukket.
- Bekræfte, at latex åndeposen fastgjort til anæstesi systemet er pustet op. Hvis posen ikke puste, skal den udskiftes.
- Kontroller gummimembran på hver af næse kegler leverer anæstesi til mikroskopbordet og det kirurgiske platform. Hvis gummiet er begyndt at tynde, udskifte den.
7. Fremstilling af kirurgiske redskaber og Kirurgisk Platform
- Slå på en varm perle sterilisator og lad det nå> 200 ° C.
- Vask kirurgiske redskaber i sæbe og vand(En tang [fortrinsvis med tænder] og saksens gennem huden af dyret, et par tænger [fortrinsvis savtakket] og saks til yderligere eksponering af tumoren).
- Sterilisere kirurgiske redskaber til mindst 30 sek ved hjælp af varm perle sterilisator (alternativt kan de kirurgiske instrumenter autoklaveres i forvejen).
- Lad de kirurgiske redskaber køle samtidig sørge for at undgå forurening af de steriliserede værktøjer.
- Saml låget til en Styrofoam levering køler. Dette vil være din kirurgisk platform.
- Placere et stykke af en lab soaker oven på Styrofoam låget (nok til at dække det).
- Anbringe en næsekegle med en linje til anæstesi systemet til laboratoriet soaker med laboratorie tape (1 "tape fungerer bedst her). Sæt en 18 G x 1 ½" nål gennem båndet i styrofoam låget på hver side af næsekeglen at holde næsekeglen fastgjort.
- Braklægning Betadine, steril gaze, to 70% isopropanol klude, et mikroskopdias, Krazy Glue, og 4 stykker lab tape (½ "bredde).
8. Fremstilling af Microscope
- Tænd for mikroskopet, kameraet, og computeren kører mikroskopet.
- Tænd for varmetæppe.
- Hvis et omvendt mikroskop skal anvendes, bør et specialfremstillet fase insert udformes med billeddannende porte svarende til placeringen af de ingvinale mælkekirtler. Rengør scenen indsætte godt med sæbe og vand og tør. Brug lab tape (½ "virker bedst) for at sikre dækglas (# 1.5 tykkelse) over de billeddannende havne og rengøre hele overfladen med 70% isopropanol. Dæk scenen med steril gaze for at beskytte mod forurening. Sæt scenen indsatsen i den fase og lad det lufttørre.
- Tear 4-6 stykker lab tape (1 "bredde), cirka 6 inches i længden og fastgøre dem til siden af mikroskopet. Disse stykker tape vil blive anvendt til at placere næsekeglen leverer anæstesi til dyret af end fastgør det på plads.
- Riv to stykker tape (½ inch bredde), der er omkring en tomme i længden. Disse vil blive anvendt til at holde sommerfuglenål leverer PBS til mus og mikroskopobjektglasset anvendt til at belyse tumoren på plads.
9. Udsættes den lyskelymfeknuder brystkirtel for Imaging
- Bedøve dyret i et induktionskammer anvendelse af 4% isofluran med 21% oxygen og nitrogen balance (strømningshastighed på omkring 1,0 l / min) som bærergas. Dette bør tage 2-4 min.
- Overfør musen til den kirurgiske platform, når det trækker vejret dybt og langsomt, med Bugsiden opad. Åbne anæstesi linie til den kirurgiske platform og derefter lukke anæstesi linje til induktionskammer, i dette for at undgå for højt tryk i anæstesi systemet. Reducere koncentrationen af isofluran fra 4% til 2,5% på dette tidspunkt.
- Kontroller pedal tilbagetrækning refleks at bekræfte, at dyret er tilstrækkeligt Anesthetized for den kirurgiske procedure ved at udføre en trædepude pinch. Dyret er tilstrækkeligt bedøvet, hvis det ikke reagerer (f.eks twitch eller krølle sin hale) til trædepude knivspids. Hvis dyret reagerer på trædepude klemme, forøge koncentrationen af isofluran.
- Fastgør benene med musen til den kirurgiske platform med laboratorie tape (½ "tape virker bedst for dette).
- (Valgfrit) Når dyret er fastgjort til den kirurgiske platformen, kan håret fjernes fra den ventrale overflade ved anvendelse af en elektronisk barbermaskine. Hvis kemisk hårfjerning foretrækkes, skal det foretages 24-48 timer forud for kirurgi. Fjernelse af hår forud for operationen med til at forhindre forurening af imaging site, som omstrejfende hår kan fremkalde stærke og akut immunrespons.
- Desinficere den ventrale overflade af dyret med 70% isopropanol servietter og Betadine.
- Brug det første par steril saks og pincet (med tænder), foretage en subkutan ventral midtlinjeincisionder løber fra ~ 3 mm over urinrøret til formet som et sværd proces. Vær omhyggelig med at undgå at punktere eller skære gennem bughinden.
- Ved hjælp af det andet par af steril saks og pincet (serrated), forsigtigt frigøre huden med den inguinal mamma fastgjort kirtel, fra det peritoneale hulrum.
- Tag et objektglas og anbring den mod huden klap genereres i det foregående trin. Positionere slæden på en sådan måde, at hovedparten af tumoren vil sidde fast, når musen anbringes på scenen, og det ikke påvirker mobiliteten af bagbenene.
- Når objektglasset er korrekt positioneret, fastgøre glideren til den ydre overflade af huden ved hjælp af superlim (f.eks., Krazy Lim).
10. Placering af musen på scenen
- Fjern laboratoriet tape, benene på dyret til det kirurgiske platform.
- Åbne anæstesi linje til mikroskopbordet og lukke anesthesia linie til den kirurgiske platform, i denne rækkefølge.
- Hurtigt overføre dyret til objektbordet.
- Når dyret er blevet overført, position og fastgør anæstesi linje og næse kegle korrekt (ved hjælp af f.eks lab tape) for at sikre, at musen er bedøvet, og er i en behagelig stilling.
- Udsætte tumoren, så den er placeret oven på og i centrum af et af dæksleme glasoverdækkede imaging porte i mikroskopbordet.
- Ved hjælp af okularerne, at svulsten er korrekt placeret, og forsigtigt tape ned mikroskopobjektglasset kontrollere. Slæden skal fastgøres løst, således blodstrømmen til vævet ikke hindres. Taping ned mikroskopobjektglasset med til at minimere billeddannende artefakter indført ved dyrets vejrtrækning.
- Sæt den iboende intraperitoneal linje med vingede infusionssæt fastgjort til en 1 ml sprøjte indeholdende steril 1 x PBS eller saltvand (eventuelt indeholdende et farvestof, såsom PI) fremstillet under nr. 5. Inject dyret med 100 ul når IP. linie indsættes. Fra dette tidspunkt indtil afslutningen af den billeddannende samling, injicere dyret med 50 pi saltvand ved 1 time interval (eller 25 pi af saltvand med PI hver 30 min).
- At overvåge dyrets vitale tegn, vedlægges et oximeterprobe (f.eks MouseOx system ved Starr Life Sciences, Inc.) 19.
- Dæk mus med et varmetæppe til at forhindre hypotermi.
11. Køb af billeder
Den open source software μManager (Vale Lab, UCSF) anvendes til at erhverve time-lapse billeder. Den rå data er samlet i Imaris (Bitplane) software, og kan scores manuelt af uafhængige observatører, eller analyseres i enten Imaris eller andet billede analyse software (f.eks Volocity [PerkinElmer] eller ImageJ [NIH]).
12. Eutanasi
Ved afslutningen af billedet session (1-40 timer, afhængigt af den type proces analyseres), er dyret aflivet.
- Koncentrationen af isofluoran øges til 4%.
- Dyret iagttages indtil 30 sek efter at den griber vejrtrækning og derefter fjernet fra scenen.
- Cervikal dislokation udføres for at sikre, at dyret er aflivet.
13. Repræsentative resultater
Intravital billeddannelse ved hjælp af denne fremgangsmåde giver mulighed for direkte visualisering af forskellige processer, herunder lægemiddelafgivelse til tumorer, ekstravasation og fordeling af lægemidlet, når det når tumoren, celledød efter terapeutisk behandling, og tumor-stroma interaktioner som reaktion på celledød 5. At observere ankomsten af et lægemiddel til tumoren og dens fordeling efter ekstravasation i tumorvæv, er dyret injiceres, mens billeder, der overtages. Selv om flere klasser af chemotherapeutics er svagt fluorescerende (såsom doxorubicin), er mange ikke. Fluorescens-konjugerede dextraner kan anvendes som surrogatmarkører for lægemiddelafgivelse og diffusion ind i væv. Figur 2 og Movie 1 viser ankomsten af en fluorescein-isothiocyanat (FITC)-konjugeret 2 MD dextran (Invitrogen, 1 mg / ml 1X PBS) injiceret iv. ind i en tumor af en MMTV-PyMT, ACTB-ECFP mus.
Efter ankomsten af lægemidlet i tumoren, kan ekstravasation og diffusion gennem vævene afbildes at bestemme både intravaskulær halveringstid af et lægemiddel og medikamentfordeling 5. Filmen 2 viser ekstravasation og distribution af Alexa Fluor-647-konjugeret 10 kD dextran (Invitrogen, 1 mg / ml i 1 x PBS) injiceret iv. til en C3 (1)-Tag, ACTB-ECFP, c-fms-EGFP mus under billedbehandling. Efter udarbejdelse af time-lapse film i Imaris (Bitplane) er intravaskulær halveringstid og narkotika fordeling kvantificeres. For at måle intravaskulær halveringstidEr den gennemsnitlige fluorescensintensitet i tumorblodkar på hvert tidspunkt beregnes og afbildet mod tiden. Lægemiddelfordeling kvantificeres som procent areal pr total tumor område, der er positiv for lægemidlet.
Ud over at spore kinetikken for lægemiddelafgivelse til tumorer, er det ofte vigtigt at bestemme, hvordan tumorer reagerer på behandlingen. Som anticancerterapier forventes at inducere celledød, kan propidiumiodid (PI) farvning eller strukturelle kerneforandringer anvendes som en markør af lægemiddel-induceret celledød 5. Figur 3 viser tumorresponset til det cytotoksiske kemoterapeutiske doxorubicin i en MMTV -PyMT, ACTB-ECFP, c-fms-EGFP mus. I denne triple transgent MMTV-PyMT, ACTB-ECFP c-fms-EGFP dyr, ECFP etiketter brystkræftceller (blå), og EGFP etiketter myeloide celler (grøn). Dyret afbildet i løbet af denne session blev administreret doxorubicin 18 timer før billeddannelse begyndte og PI blev leveret ip hele tHan imaging session som beskrevet ovenfor. Kræftceller (ACTB-ECFP mærkning) vises som blå og døde eller døende celler vises som rød (PI farvning). Den tid, der angives her viser induktion af doxorubicin-afhængig celledød over tid. At kvantificere induktion af celledød i tumorer, er den samme type analyse anvendes til bestemmelse af lægemiddelfordeling anvendes, hvor den kvantitative produktion er procent areal pr total tumor område, der er positive for PI.
Billeddannelse ved stor forstørrelse kan tilvejebringe oplysninger om hvilken type af celledød, som cancerceller gennemgår 5. Film 3 viser resultaterne af et billeddannende eksperimentet kan spore nukleare ændringer er typiske for apoptotisk celledød som reaktion på systemisk behandling med doxorubicin. At visualisere kerner, dyret afbildes under denne session huser ACTB-H2B-EGFP reporter stedet for c-fms-EGFP reporter, så kernerne i cancerceller er vist med grøn. Dette MMTV-PyMT, ACTB-ECFP, ACTB-H2B-EGFP dyr var administered doxorubicin (8 mg / kg i 1 x PBS) ip 24 timer før starten af filmen, og modtog time injektioner med 1 x PBS indeholdende PI (Invitrogen, 1 mg / ml opløsning fortyndet 1:15). Strukturelle ændringer i kernerne i cancerceller kan observeres i en apoptotisk celle ved siden af celler, der har undergået nekrose (PI-positive celler, der udviser minimale ændringer i nuklear morfologi). Kerner af apoptotiske celler bliver til sidst rødt på grund af optagelse af PI-farvning (ikke vist). Antallet af nekrotiske og apoptotiske events kvantificeres manuelt for hvert tidspunkt baseret på PI-positivitet og nuklear morfologi.
Kemoterapi-induceret celledød ofte resulterer i en reaktiv immunceller i tumorer 2,4,5. Figur 4 viser et eksempel på denne stromal respons på akut behandling med doxorubicin. Den MMTV-PyMT, ACTB-ECFP c-fms-EGFP dyr afbildet her blev administreret doxorubicin (8 mg / kg i 1 x PBS) ip ip. for varigheden af eksperimentet for at visualisere celledød. De angivne tidspunkter repræsenterer antallet af timer efter behandling med doxorubicin, og omfanget søjle repræsenterer 100 um. I dette eksperiment, infiltrere myeloide celler i områder af celledød, som indikeret ved de hvide pile. For at kvantificere myeloid celleinfiltration i tumorer efter doxorubicin administration, den samme type analyse anvendes til bestemmelse af lægemiddelfordeling og tumor respons på kemoterapi anvendes, hvor den kvantitative produktion er procent areal pr total tumor område, der er positive for EGFP.
Ud over at visualisere den samlede stromal respons på kemoterapi, kan specialiserede stromale reaktioner også visualiseres 5. Film 4 viser fagocytose af nekrotisk cellemateriale fra en nabocelle. Den røde nukleart materiale kan ses ved at blive indtaget af en celle med en large intakt grøn kerne, som er typisk for makrofager. Den MMTV-PyMT, ACTB-ECFP, ACTB-H2B-EGFP dyr afbildet i løbet af denne session blev administreret doxorubicin (8 mg / kg i 1 x PBS) ip. 24 timer før starten af filmen. Dyret modtog time injektioner med 1 x PBS indeholdende PI (Invitrogen, 1 mg / ml opløsning fortyndet 1:15). Kerner (ACTB-EGFP mærkning) vises som grøn, men bliver røde som cellen undergår nekrose.
Figur 1. Prøve mærkning af forskellige tumor komponenter ved hjælp af transgene og injicerbare etiketter Dette er et triple-transgen MMTV-PyMT. ACTB-ECFP, c-fms-EGFP dyr, hvor cancerceller er vist med blå ved ekspression af ECFP og myeloide celler er mærket i grøn til ekspression af EGFP fra en myeloid-promotor. Dyret blev injiceret med propidiumiodid (PI, rød, ~ 0,07 mg / ml i 1 x PBS) underden billeddannende session at visualisere celledød. PI etiketter DNA, men kun krydser cellemembraner af døde eller døende celler. Scale bar = 100 | jm.
Figur 2. Drug ekstravasation og fordeling i tumorer Denne dobbelt-transgene MMTV-PyMT. ACTB-ECFP dyr, hvor cancerceller er vist med blå ved ekspression af ECFP blev injiceret med FITC-konjugeret 2 MD dextran (grøn) under den billeddannende samling at visualisere, hvor narkotikasmugling til tumorer efter iv injektion (blå). Tid efter billeddannelse blev indledt, er angivet. Scale bar = 100 | jm.
Figur 3. Cancercelle respons på systemisk behandling. An MMTV-PyMT, ACTB-ECFP, c-fms-EGFP dyr behandlet med det kemoterapeutiskelægemiddel doxorubicin forud for billeddannelse, og injiceret med PI (rød, ~ 0,07 mg / ml i 1 x PBS) at mærke celledød. Dette billede serie viser akkumuleringen af PI-farvning over tid (som angivet med hvide pile), der repræsenterer induktion af celledød efter behandling med doxorubicin. Angivne tid er tiden efter behandling med doxorubicin. Billeder er maksimumslysstyrke projektioner af en z-stak, der indeholder tre billeder i z-aksen. Scale bar = 100 | jm.
Figur 4. Myeloid celle respons på kemoterapi i en MMTV-PyMT, ACTB-ECFP. C-fms-EGFP tredobbelt transgene mus administreret doxorubicin 20 timer forud for billeddannelse Dyret modtog hver time ip. injektioner af PI (rød, ~ 0,07 mg / ml i 1 x PBS) til at mærke døde celler. Dette billede serie viser akkumuleringen af EGFP-positive myeloide celler (som angivet med hvide pile) over tid efter doxorubicin behandling. Denne immunrespons har vist sig at hæmme terapeutisk respons på adskillige klasser af kemoterapier 4,5. Angivne tid er tiden efter behandling med doxorubicin. Billeder er maksimumslysstyrke projektioner af en z-stak, der indeholder tre billeder i z-aksen. Scale bar = 100 | jm.
Movie 1. . Lægemiddelafgivelse i en tumor Dette er en dobbelt-transgen MMTV-PyMT, ACTB-ECFP dyr, hvor cancerceller er vist med blå ved ekspression af ECFP. Dyret blev injiceret med en 2 MD FITC-konjugeret dextran (grøn) under den billeddannende session at visualisere, hvordan narkotika nå tumorer efter iv injektion. Scale bar = 100 um. Klik her for at se film .
Movie 2. Drug infiltration ind i tumorvævet En tredobbelt transgen C3 (1)-Tag. ACTB-ECFP, c-fms-EGFP dyr, hvor cancerceller er laBeled i blå ved ekspression af ECFP og myeloide celler mærket med grønt ved ekspression af EGFP blev injiceret IV med et Alexa Fluor 647-konjugeret 10 kD dextran (rød). Synsfeltet er vist umiddelbart efter injektion med dextran. Dextranen først mærker vaskulaturen, hurtigt extravasates ind i tumorvævet, og til sidst taget op af makrofager. Scale bar = 100 um. Klik her for at se film .
Movie 3. Imaging af nukleare ændringer efter kemoterapi-induceret celledød Denne tredobbelte transgene MMTV-PyMT. ACTB-ECFP, H2B-EGFP dyr blev injiceret med doxorubicin før billeddannelse. Nuklear morfologi (grøn), som spores af ekspression af et H2B-EGFP fusionsprotein, giver mulighed for direkte visualisering af kemoterapi-induceret nukleare strukturelle ændringer er typiske for apoptose set til cellen i øverste højre hjørne. Dyret receIVED halvtimes ip. injektioner af PI (rød), så længe den billeddannende samling at mærke døde og døende celler. Angivne tid er tiden efter behandling med doxorubicin 24 timer. Billeder blev erhvervet ved hjælp af en høj forstørrelse objektiv (40x, NA 1,1, vand linse). Scale bar = 15 um. Klik her for at se film .
Movie 4. Billeddannelse af nukleare ændringer og optagelse af dødt cellemateriale efter kemoterapi-induceret celledød Denne tredobbelte transgene MMTV-PyMT. ACTB-ECFP, H2B-EGFP dyr blev injiceret med doxorubicin forud for billeddannelse. Nuclear morfologi (grøn), som spores af ekspression af et H2B-EGFP-fusionsproteinet, mulighed for direkte visualisering af kemoterapi-inducerede nuklear strukturelle ændringer. Dyret fik hver halve time ip. injektioner af PI (rød), så længe den billeddannende samling at mærke døde og døende celler. Billeder blev erhvervetanvendelse af en høj forstørrelse objektiv (40 x, NA 1,1, vand linse). Manglen på større strukturændringer før mærkning med PI og ændringen i den nukleare morfologi og tab af GFP signal viser nekrose-lignende celledød. De døde materiale ses optages af en celle med en stor kerne, som er typisk for makrofager. Angivne tid er tiden efter behandling med doxorubicin 24 timer. Scale bar = 10 um. Klik her for at se film .
Discussion
Svarene fra tumorer systemiske behandlinger in vivo kan være dramatisk anderledes end kræftceller in vitro, da mikromiljøet påvirker både den akutte respons og tilbagefald 5. En af de største hindringer for explicating in vivo kemoresistens veje er kompleksiteten af samspillet mellem kræftceller og deres mikromiljø. Navnlig, eftersom faste tumorer har udviklet en balance mellem cancer og stromaceller, perturbationer af en komponent, såsom celledød, der opstår under anticancerbehandling kan resultere i dramatiske virkninger på væv organisation.
Den intravital billeddannelse teknik gives her giver mulighed for direkte visualisering af kræft celle-stroma interaktioner inden for tumorer i levende, bedøvede mus under behandling med anti-cancer medicin. Vi bruger spinning disk konfokal mikroskopi, som har en relativ begrænset indtrængningsdybde (se 17 (fx på grund af infiltrering af et mærket population eller induktion af celledød), cellemotilitet, fordeling af injicerbare (fx at spore vaskulær lækage), og co- lokalisering af fluorescerende signaler 5,12,17,20.
Vi rutinemæssigt billeder mus til over 6 timer og også udført billeddannelse i over 18 timer. Dette kræver opretholdelse af musene kontinuerligt under anæstesi for disse lange tidsperioder. Med korrekt anæstesi, overlever mere end 90% af dyrene 6 timer, og omkring 80% overleve i 18 timer. Nærmere oplysninger om, hvordan du udfører en langsigtet anæstesi er blevet offentliggjort tidligere 19. Det er vores erfaring, er fem faktorer kritiske: undgå hypotermi, undgå dehydrering, opretholde fysiologiske blod iltmætning niveauer, usynge befugtet bæregas til isofluran, og holde dyrene på det laveste niveau af anæstesi, hvor de ikke viser tegn på smerte. For at opretholde kroppens temperatur, vi holder mus under en opvarmet tæppe (ved 38 ° C). For at undgå dehydrering, vi indsprøjte små mængder af saltvand ip hele imaging procedure. For at opretholde fysiologiske blodoxygenmætning niveauer, starter vi med 21% oxygen i bæregassen (snarere end den almindeligt anvendte 100%). Det giver os mulighed for at øge inhalerede ilt niveauer, hvis en mus - timer i et eksperiment - viser et fald i blodets iltmætning. Det er vores erfaring, næsten altid øge inhalerede ilt niveauer på det pågældende tidspunkt (fx til 30-40%) vil stabilisere dyret giver mulighed for timers ekstra billeddannelse. Det optimale niveau af anæstesi er for de fleste mus, der er opnået med 1-1,5% isofluran og resulterer i ånde satser 60-65/min og puls satser 400-450/min. I vores billeddannelse eksperimenter, anvender vi primært transgene mus models (MMTV-PyMT og C3 [1]-Tag), hvor tumorer er multifokal, der giver mulighed for billeddannelse af flere læsioner på forskellige stadier af tumorprogression parallelt på flere x, y-positioner under en enkelt scanning session. Dette reducerer bekymringer med hensyn til muse-til-mus variation for forsøg med henblik på at finde fase-afhængige terapeutiske responser, og reducerer antallet af dyr, der kræves til billeddannelse.
Den MMTV-PyMT model (og andre spontane kræftmodeller) går gennem progressive histopatologiske faser, der kan genkendes i løbet af intravital billeddannelse, selv om den patologiske iscenesættelse af tumorlæsioner, der kan gøres i løbet af intravital billeddannelse er forskellig fra, og mindre detaljeret, end det histologiske snit 5,17. I modsætning hertil har tendens transplantation modeller for at afspejle sent stadium tumorer bedst, som cancercellerne sædvanligvis isoleres fra avancerede tumorer. Sådanne modeller er således mere medgørlige at studere tumor-stromainteraktioner mellem sent stadium tumorer end forskelle i disse interaktioner mellem forskellige stadier.
Vi viser eksempler på, hvordan billedet nukleare strukturelle ændringer, der opstår efter celledød induceret af behandling. I fravær af anti-cancerbehandling, kan denne mærkning strategi i stedet anvendes til at afbilde celledeling in situ, belyse, for eksempel hvor celleproliferation og vækstdvale påvirkes af mikromiljøet. I fremtiden kan fluorescerende mærkning af mitokondrielle komponenter gør det muligt at afbilde mitokondrielle forandringer, der sker i apoptotisk celledød.
I denne protokol, har vi også vist eksempler på, hvordan billedet kræft celle-immune celleinteraktioner efter behandling, men andre microenvironmental komponenter kan også visualiseres og afbildet. Eksisterende transgene reporter linjer til stromale komponenter indbefatter de til fibroblaster (f.eks., FSP1-EGFP 17, αSMA-RFP 21, COL1A1-EGFP 21), eller celler fra vaskulaturen (f.eks Tie2-GFP 22, VEGF-GFP 23).
Intravital billedbehandling giver mulighed for real-time visualisering af de interaktioner og processer, der opstår in vivo efter indgift af kemoterapi. Med den teknologi øjeblikket er til rådighed, har vi gjort store fremskridt med at forstå, hvordan myeloide celler påvirker terapeutisk respons, men fordi det tumormikromiljøet er så kompleks, er store fremskridt stadig behov for at begynde at dykke mekanisk ind i processerne bag miljø-medieret resistens. En af de vigtigste fremskridt stadig kræves er identifikationen af bedre markører for specifikke cellepopulationer. Betydningen af bedre markører er godt illustreret med to af de mest fremtrædende stromacellelinier komponenter af brysttumor mikromiljøet, fibroblaster og immunceller. α-glat muskel-actin (αSMA) anvendes ofte til at identificerefibroblaster, men proteinet er også udtrykt af vaskulære glatte muskelceller og myoepitelcellerne 24. Selv αSMA-GFP reporter mus findes, bestemmelse af specifik celletype er således under en intravital imaging eksperiment er udfordrende. Ligeledes vil en enkelt fluorescerende markør, såsom EGFP udtrykt under c-fms-promotoren identificerer ofte flere subpopulationer af immunceller 12,17. Således, selv om man ideelt set gerne vil bruge en enkelt markør for at identificere en specifik celletype kompleksiteten af den underliggende biologi er en stor udfordring i at bruge denne fremgangsmåde.
En delvis løsning på dette problem er at anvende injicerbare etiketter til yderligere at skelne subpopulationer af celler, der udtrykker det samme fluorescerende reporter. For eksempel er fluorescerende dextraner optages af makrofager og kan anvendes til at mærke de makrofag-subpopulationer, der er mærket af c-fms-EGFP og Fsp1-EGFP transgene reporter mus
I modsætning tumor responskurver genereret af caliper måling, som giver ringe mekanistisk oplysninger om, hvordan eller hvorfor tumorer reagerer på den indgivne terapeutiske eller histologisk serie afledt fra væv høstet på forskellige tidspunkter, som kræver store mængder af dyr, tilvejebringer vor teknik direkte, kvantificerbar oplysninger på dynamikken i celledød og om eventuelle vekselvirkninger med stromaceller med kræftceller i små årgange. Således fordelen ved at anvende fremgangsmåden beskrevet her er, at den tilvejebringer dynamisk information om lægemiddel-respons i forbindelse med et intakt tumor-mikromiljøet i realtid. Sådanne oplysninger kan føre til vigtige indsigter i de underliggende processer, der driver terapeutiske respons 5 </ Sup>.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at afsløre. Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med IACUC godkendte protokoller.
Acknowledgments
Vi takker J. Cappellani og J. Qiu for teknisk support. Dette arbejde blev støttet af midler fra National Cancer Institute (U01 CA141451), den Starr Cancer Consortium, Susan G. Komen for Cure, Long Island 2 Day Walk to Fight Breast Cancer, Manhasset Dame Coalition Against Breast Cancer til mig, og en præ-ph.d.-stipendium fra Kongressen Instrueret Breast Cancer Research Program, US til ESNESN er også modtageren af Leslie C. Hurtig og William Randolph Hearst Foundation stipendier fra Watson School of Biological Sciences. HAA blev støttet af midler fra Norges Forskningsråd (160698/V40 og 151.882), og sydøstlige regionale sundhedsmyndigheder (2.007.060).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| MMTV-PyMT mice | Jackson Laboratory | 2374 | |
| C3(1)-Tag mice | Jackson Laboratory | 13591 | |
| ACTB-ECFP mice | Jackson Laboratory | 3773 | |
| ACTB-H2B-EGFP mice | Jackson Laboratory | 5418 | |
| 1 x PBS | Made in-house | ||
| 2 MD Dextran, Fluorescein-conjugated | Invitrogen | D-7137 | Reconstitute in dH2O (4 mg/mL, store at -20 °C); dilute to 1 mg/ml in 1 x PBS |
| 10 kD Dextran, Alexa Fluor 647-conjugated | Invitrogen | D-22914 | Reconstitute in dH2O (4 mg/mL, store at -20 °C); dilute to 1 mg/ml in 1 x PBS |
| Doxorubicin hydrochloride | Sigma-Aldrich | 44583 | Reconstitute in dH2O and store at 4 °C; dilute in 1 x PBS |
| Isothesia (Isoflurane) | Butler Animal Health Supply | 029450 | 250 ml |
| Propidium iodide | Invitrogen | P3566 | 1 mg/ml; dilute 1:15 in 1 x PBS |
| Nitrogen | |||
| Oxygen | |||
| Equipment | |||
| 18G x 1½" regular bevel needle | BD | 305196 | |
| μManager | Vale Lab, UCSF | www.micro-manager.org | Open-source software |
| Alcohol swab | BD | 326895 | 70% isopropyl alcohol swabs |
| Anesthesia system | Molecular Imaging Products, Co. | ||
| Cover glass | Corning | 2940-245 | No. 1½, 24x50 mm; disinfect with 70% isopropanol wipes |
| Curity gauze sponges (sterile) | Kendall | 6939 | |
| Glass microscope slides | Corning | 2948-75x25 | Pre-cleaned; if not pre-cleaned, disinfect with 70% isopropanol wipes |
| Hardened fine scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | 2 pairs; stainless steel, sharp-sharp tips, straight tip, 26 mm cutting edge, 11 cm length |
| Heated blanket | Gaymar Industries | ||
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | Turn on approximately 30 min before use; sterilize tools at >200 °C for 30 sec |
| Imaris | Bitplane | www.bitplane.com | |
| Krazy Glue | Elmer’s Products | KG484 | |
| Laboratory tape ( ½") | |||
| Laboratory tape (1") | |||
| Lid to a Styrofoam shipping cooler | This will be used as the surgical platform | ||
| Micro dissecting forceps | Roboz | RS-5153 | 1x2 teeth, slight curve, 0.8 mm tip width, 4" length |
| Micro dissecting forceps | Roboz | RS-5135 | Serrated, slight curve, 0.8 mm tip width; 4" length |
| Microscope | Spinning-disk confocal, XYZ Piezo stage, epifluourescence capablility17,25 | ||
| Microscope stage insert | Applied Scientific Instrumentation | Custom fabricated, with two circular imaging ports | |
| MouseOx oximeter, software, and sensors | STARR Life Sciences | www.starrlifesciences.com | |
| Nalgene Super Versi-Dry lab soakers | Thermo Scientific | 74218-00 | Cut into fourths for lining surgical platform |
| Nebulizer | Salter Labs | 8901 | Used to humidify gases; prevents irritation of lung tissues |
| Slip-tip disposable tuberculin syringe (1 ml) | BD | 309659 | |
| Surflo winged infusion set | Terumo | SV-23BLK | 23G x ¾" ultra thin needle, 12" tubing |
| Betadine Spray | Purdue Pharma | BASP3H | |
References
- Egeblad, M., Nakasone, E. S., Werb, Z. Tumors as organs: complex tissues that interface with the entire organism. Dev. Cell. 18, 884-901 (2010).
- Ahn, G. -O., Tseng, D., Liao, C. -H., Dorie, M. J., Czechowicz, A., Brown, J. M. Inhibition of Mac-1 (CD11b/CD18) enhances tumor response to radiation by reducing myeloid cell recruitment. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 8363-8368 (2010).
- Tlsty, T. D., Coussens, L. M. Tumor stroma and regulation of cancer development. Annu. Rev. Pathol. 1, 119-150 (2006).
- DeNardo, D. G., Brennan, D. J., et al. Leukocyte complexity predicts breast cancer survival and functionally regulates response to chemotherapy. Cancer Discov. 1, 54-67 (2011).
- Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., et al. Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance. Cancer Cell. 21, 488-503 (2012).
- Kim, J. B., Stein, R., O'Hare, M. J. Three-dimensional in vitro tissue culture models of breast cancer-- a review. Breast Cancer Res. Treat. 85, 281-291 (2004).
- Gilbert, L. A., Hemann, M. T. DNA damage-mediated induction of a chemoresistant niche. Cell. 143, 355-366 (2010).
- Pittet, M. J., Weissleder, R. Intravital imaging. Cell. 147, 983-991 (2011).
- Lohela, M., Werb, Z. Intravital imaging of stromal cell dynamics in tumors. Curr. Opin. Genet. Dev. 20, 72-78 (2010).
- Boissonnas, A., Fetler, L., Zeelenberg, I. S., Hugues, S., Amigorena, S. In vivo imaging of cytotoxic T cell infiltration and elimination of a solid tumor. J. Exp. Med. 204, 345-356 (2007).
- Breart, B., Lemaître, F., Celli, S., Bousso, P. Two-photon imaging of intratumoral CD8+ T cell cytotoxic activity during adoptive T cell therapy in mice. J. Clin. Invest. 118, 1390-1397 (2008).
- Engelhardt, J. J., Boldajipour, B. Marginating dendritic cells of the tumor microenvironment cross-present tumor antigens and stably engage tumor-specific T cells. Cancer Cell. 21, 402-417 (2012).
- Brown, E., McKee, T., et al. Dynamic imaging of collagen and its modulation in tumors in vivo using second-harmonic generation. Nat. Med. 9, 796-800 (2003).
- Wyckoff, J. B., Wang, Y., et al. Direct visualization of macrophage-assisted tumor cell intravasation in mammary tumors. Cancer Res. 67, 2649-2656 (2007).
- Yuan, F., Salehi, H. A., Boucher, Y., Vasthare, U. S., Tuma, R. F., Jain, R. K. Vascular permeability and microcirculation of gliomas and mammary carcinomas transplanted in rat and mouse cranial windows. Cancer Res. 54, 4564-4568 (1994).
- Jain, R. K., Munn, L. L., Fukumura, D. Dissecting tumour pathophysiology using intravital microscopy. Nat. Rev. Cancer. 2, 266-276 (2002).
- Egeblad, M., Ewald, A. J., et al. Visualizing stromal cell dynamics in different tumor microenvironments by spinning disk confocal microscopy. Dis Model Mech. 1, 155-167 (2008).
- Cheng, N., Lambert, D. L. Mammary Transplantation of Stromal Cells and Carcinoma Cells in C57BL/6J. Mice. J. Vis. Exp. (54), ee2716 (2011).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harb. Protoc. 2011, pdb.prot5563 (2011).
- Sounni, N. E., Dehne, K., et al. Stromal regulation of vessel stability by MMP14 and TGFbeta. Dis. Model Mech. 3, 317-332 (2010).
- Magness, S. T., Bataller, R., Yang, L., Brenner, D. A. A dual reporter gene transgenic mouse demonstrates heterogeneity in hepatic fibrogenic cell populations. Hepatology. 40, 1151-1159 (2004).
- Motoike, T., Loughna, S., et al. Universal GFP reporter for the study of vascular development. Genesis. 28, 75-81 (2000).
- Fukumura, D., Xavier, R., et al. Tumor induction of VEGF promoter activity in stromal cells. Cell. 94, 715-725 (1998).
- Sugimoto, H., Mundel, T. M., Kieran, M. W., Kalluri, R. Identification of fibroblast heterogeneity in the tumor microenvironment. Cancer Biol. Ther. 5, 1640-1646 (2006).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Dynamic, long-term in vivo imaging of tumor-stroma interactions in mouse models of breast cancer using spinning-disk confocal microscopy. Cold Spring Harb. Protoc. 2011, pdb.top97 (2011).
