Summary
We beschrijven een werkwijze voor beeldvorming respons op anti-kankerbehandeling
Abstract
De tumor micro speelt een centrale rol in tumorinitiatie, progressie, metastase, en respons op anti-kankertherapieën. Driedimensionaal co-cultuur systemen worden vaak gebruikt om tumor-stroma interacties, inclusief hun rol in drug reacties zjin. Echter, veel van de interacties die optreden in vivo in het intacte micro niet volledig worden gerepliceerd in deze in vitro instellingen. Zo heeft directe visualisatie van deze processen in real-time een belangrijk hulpmiddel bij het begrijpen tumor respons op therapie en identificatie van de interactie tussen kankercellen en het stroma dat deze reacties kunnen beïnvloeden. Hier geven we een methode om met draaiende schijf confocale microscopie van levende, verdoofde muizen direct observeren distributie van medicijnen, kanker cel responsen en veranderingen in tumor-stroma interacties na toediening van systemische therapie bij borstkanker modellen. We beschrijven procedures voor Labellng verschillende tumor componenten behandeling van dieren voor het waarnemen therapeutische respons en de chirurgische procedure voor het belichten tumorweefsels voor imaging tot 40 uur. De resultaten van dit protocol zijn time-lapse filmpjes, waarin dergelijke processen als medicijn infiltratie, het afsterven van kankercellen en stromale cel migratie kan worden geëvalueerd met behulp van beeldanalyse-software.
Introduction
Vaste tumoren bestaan uit twee grote compartimenten: kankercellen en de stromale bestanddelen (zowel cellulaire en niet-cellulaire) die het behoud van een geschikte omgeving voor tumorgroei 1. Deze stromale bestanddelen spelen kritieke rollen in de ontwikkeling, progressie en metastase van vele soorten kanker, inclusief die van de borst 2-5. De stromale omgeving beïnvloedt ook de therapeutische respons 2,4,5. Aldus bepalen hoe kankercellen conventionele en nieuwe therapieën reageert binnen de context van het intacte micro is belangrijk voor de bevordering van ons begrip van kankerbiologie en verbeteren van de huidige therapeutische strategieën. Bovendien bepalen hoe kankercel-stroma interacties te veranderen na de toediening van de therapie is van cruciaal belang voor het begrijpen van de biologie van de tumor recidief.
Organotypische co-kweken systemen zijn nuttig voor het bestuderen van tumor-stroma interacties
De primaire middel voor het bestuderen reacties op anti-kankertherapie in vivo zijn door metingen van tumorgrootte en histologisch onderzoek van weefsels afkomstig van dieren of patiënten. Er zijn echter ontwikkelingen in de microscopie en fluorescentie verslaggevers in de afgelopen twee decennia kon de visualisatie van inter-en intracellulaire processenmet een hoge resolutie in levende, verdoofde dieren (intravitale imaging) 8. Deze intravitale microscopie technologieën hebben bewezen bijzonder waardevol voor ruimte en tijd ontleden van de in vivo dynamiek van tumor-stroma interacties op cellulaire en sub-cellulaire resolutie 8,9.
Processen die zijn ontrafeld door intravitale imaging omvatten anti-tumor T-cel cytotoxiciteit 10,11, interacties tussen T-cellen en myeloïde cellen 12, de dynamiek van veranderingen in collageen samenstelling en die na een therapeutische behandeling 13, macrofaag-afhankelijke kankercellen intravasatie en metastase 14 en vasculaire permeabiliteit 15.
Er zijn drie belangrijke eisen voor intravitale beeldvorming. Deze omvatten passende voorbereiding en de blootstelling van weefsels voor de beeldvorming, TL-etikettering van het weefsel componenten van belang, en een gepaarde microscopie-camera'system bouwen die beelden 16. De meest voorkomende strategieën gebruikt om deze eisen aan te pakken zijn onder meer: 1) heterotope preparaten (bijvoorbeeld inoculatie van het oor of oog orbitaal), permanente beeldvorming vensters of geëxterioriseerde preparaten (bijvoorbeeld, dorsale huid flap), 2) transgene fluorescerende verslaggevers en.. fluorescerende injectables om weefsel-componenten worden, en 3) multifoton of confocale microscopie systemen gecombineerd met fotomultiplicatorbuizen of charge-coupled device (CCD) camera's, respectievelijk 9. We maken gebruik van een chirurgisch voorbereide huid flap model om de lies borstklier bloot voor beeldvorming bij verdoofde dieren die transgenen die coderen voor fluorescerende verslaggevers uit te drukken. Beelden worden verkregen over een periode van 12 tot 40 uur met een geïntensiveerde CCD (ICCD) camera gekoppeld met vier draaiende schijf laser confocale microscoop systeem 17. Imaging op deze manier heeft ons toegestaan om dergelijke processen te bestuderen in vivo distributie van medicijnen, podium-afhankelijke chemotherapeutic reacties, type chemotherapie geïnduceerde celdood en myeloïde celgedrag 5.
Wij een protocol voor de intravitale beeldvorming van kanker cel responsen op anti-kankertherapie en tumor-stroma interacties in muismodellen van borstkanker. Dit protocol kan worden gebruikt om het gedrag en de dood van zowel kankercellen en stromale componenten met een grote verscheidenheid van transgene en injecteerbare fluorescente labels in zowel transgene en transplantatiemodellen voor een periode van maximaal 40 uur in een opnamesessie volgen.
Protocol
Beschreven Alle procedures moeten worden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen en voorschriften voor het gebruik van gewervelde dieren, met inbegrip van voorafgaande goedkeuring door de plaatselijke Institutionele Animal Care en gebruik Comite.
1. Het genereren van de Muis van mammatumoren for Imaging (Transgene of orthotoop)
- Genereer mammatumoren voor beeldvorming met behulp van genetisch gemanipuleerde muis-modellen (bijvoorbeeld een muis borsttumorvirus long terminal repeat [MMTV]-polyoma midden T-antigeen [PyMT] of de rat C3 (1) promotor gedreven grote T-antigeen (Tag) van SV40 [C3 ( 1)-Tag] modellen) of orthotope transplantatie modellen (syngene, allogene of xenogene).
- Label kankercellen door kruising genetisch model met transgene reporter lijnen (bijvoorbeeld ACTB-ECFP) of gebruik ex vivo manipulatie van primaire kanker cellen of cellijnen (bijvoorbeeld transductie) gevolgd door transplantatie. Voor een monster protocol voor transplantatie orthotope, see 18.
2. Visualiseren Onderdelen van de tumor micro-of sub-cellulaire componenten
- Visualiseren tumor onderdelen met behulp van transgene labels. Genetisch gemanipuleerde tumormodellen kruisen met transgene reporter muizen (bijvoorbeeld c-fms-EGFP voor myeloïde cellen of ACTB-H2B-EGFP voor kernen) of gebruik zoals muizen als ontvangers van getransplanteerde, gelabeld weefsels. Dit maakt visualisatie van kankercel-stromale cel interacties in respons op therapie of nucleaire veranderingen geassocieerd met celdood, respectievelijk.
- Het visualiseren van de micro-omgeving met behulp van injectables. Een grote verscheidenheid van stoffen (bijv. fluorescerend gemerkte antilichamen of chemische kleurstoffen) worden gebruikt om verschillende onderdelen van de tumor te merken. Afhankelijk van de halfwaardetijd van de kleurstof en de respons men geïnteresseerd in tracking, kunnen de injecteerbare geschieden vóór de aanvang van imaging of tijdens de opnamesessie ofwel intraveneus (iv.) Of intraperitoneally (ip. Figuur 1).
3. Microscopen en Imaging software
- Microscoop. Verschillende microscoop en software kan worden gebruikt voor de beeldvorming van levende muizen. De meest gebruikte systemen confocale microscopen of multifoton. We maken gebruik van een micro-lensed draaiende schijf confocale microscoop (Solamere Technologies, Salt Lake City, UT) met een ICCD camera (XR-Mega-10EX S-30, Stanford Photonics, Palo Alto, CA).
- Imaging software. We maken gebruik van de open source software μManager (Vale Lab, Universiteit van Californië, San Francisco [UCSF]).
- Beeldanalyse. Wij gebruiken Imaris (bitplane), Volocity (PerkinElmer), en ImageJ (National Institute of Health [NIH]) voor beeldanalyse.
4. (Pre)-behandeling van dieren voor Imaging
- Lies mammatumoren zijn optimaal voor beeldvorming met behulp van onze protocol als de langste diameter is ongeveer 8 mm of minder door schuifmaat meetbareement.
- Voor grafische dieren behandeld met een kleine molecule inhibitor, therapeutisch antilichaam of chemotherapeuticum, behandeling beginnen vóór of tijdens de beeldvorming zoals vereist voor het experiment. Bijvoorbeeld, beeldvorming van drugs extravasatie en distributie vereist administratie na de belichting is geïnitieerd (Films 1 en 2), terwijl de beeldvorming van celdood geïnduceerd door het chemotherapeuticum doxorubicine wordt het best vastgelegd door het starten van beeldvorming 24 uur of later na de behandeling met geneesmiddelen (Films 3 en 4).
5. Bereiding van Saline voor het behouden Hydratatie en bloed osmolariteit van het dier tijdens Imaging
- Tekenen ongeveer 1 ml 1x PBS in een 1 ml spuit. Propidiumjodide (PI, Invitrogen, 1 mg / ml, verdund 1:15) kunnen worden toegevoegd aan deze oplossing die periodiek wordt (ip.) Toegediend tijdens de opnamesessie. Dit zal zorgen voor beeldvorming van de kernen van dode of stervende cellen die permeabel celmembranen hebben. PI heeft een korte half-life in het vaatstelsel en derhalve opnieuw worden toegediend in de opnamesessie.
- Bevestig een gevleugelde infusieset (23 gauge, ¾ inch naald 12 inch pijp) en deze druk spuit de oplossing door de buis tot een druppel zoutoplossing verlaat de punt van de naald aan het einde van de buis.
- Haal de spuit uit de infusieset, en vul het met de juiste zoutoplossing.
- Re-Bevestig de spuit aan de infusieset, zorg ervoor dat u bellen introduceren in de lijn.
6. Voorbereiding van de isofluraananesthesie System
- Voeg water toe aan de vernevelaar en schroef deze op zijn plaats. Dit zal bevochtigen de gassen geleverd aan het dier, het voorkomen van irritatie van de longen en de overleving verlengen van dieren op basis van lange termijn anesthesie.
- Vul het isofluraan tank naar de bovenste regel. LET OP: Isofluraan is een krachtige verdovingsmiddel die ook invloed hebben op de onderzoeker. Geschikte vacuümsystemen moet be om ervoor te zorgen dat overtollige gassen uit de ruimte verwijderen.
- Schakel beide zuurstoftank en de stikstof tanks en stel flow. De stikstof moet ongeveer 1,0 L / min, terwijl de zuurstof moet op ongeveer 0,2 l / min (~ 21%).
- Zet de (in-house) vacuüm. De onderdruk ongeveer 1,2 L / min.
- Controleer of de verdoving lijn naar de inductiekamer geopend en de lijnen operatiekamer en de microscoop gesloten.
- Controleer of de latex ademzak aan de anesthesie wordt opgeblazen. Als de zak niet opblazen, vervangen.
- Controleer de rubberen membraan op elk van de neuzen leveren anesthesie de microscooptafel en de chirurgische platform. Als de rubber begint te dun, te vervangen.
7. Voorbereiding van chirurgische instrumenten en chirurgische Platform
- Zet een hete kraal sterilisator en laten komen> 200 ° C.
- Was de chirurgische instrumenten met water en zeep(Een pincet [voorkeur met tanden] en scharen snijden door de huid van het dier, een pincet [voorkeur getande] en scharen verdere belichting van de tumor).
- Steriliseer de chirurgische instrumenten gedurende ten minste 30 seconden met de hete kraal sterilisator (anders de chirurgische instrumenten kunnen worden geautoclaveerd vooraf).
- Laat de chirurgische instrumenten af te koelen terwijl ervoor te zorgen om te voorkomen dat besmetting van de gesteriliseerde instrumenten.
- Verzamel de deksel op een piepschuim scheepvaart koeler. Dit zal uw chirurgische platform.
- Leg een stuk van een lab soaker op de top van het piepschuim deksel (genoeg om het te bedekken).
- Kleef een neuskegel met een streep om de anesthesiesysteem het lab soaker met laboratorium tape (1 "tape het beste werkt hier). Plaats een 18 G x1 ½" naald door de band in de Styrofoam deksel aan weerszijden van de neus om de neuskegel vastgezet.
- Braaklegging betadine, steriel gaas, twee 70% isopropanol doekjes, een microscoopglijbaan, Krazy Glue, en 4 stukjes lab tape (½ "breedte).
8. Voorbereiding van de Microscoop
- Zet de microscoop, de camera en de computer waarop de microscoop.
- Zet de verwarming deken.
- Als een omgekeerde microscoop wordt gebruikt, moet een maat fase insert worden opgezet imaging poorten overeenkomt met de locatie van de lies borstklieren. Reinig het podium goed te voegen met water en zeep en droog. Gebruik lab tape (½ "werkt het beste) naar afdekglas (# 1.5 dikte) veilig te stellen over de beeldvorming havens en het gehele oppervlak schoon met 70% isopropanol. Bedek het podium met een steriel gaasje om te beschermen tegen besmetting. Leg het podium insert in de fase en laat het aan de lucht drogen.
- Scheuren 4-6 stukjes lab tape (1 "breedte), ongeveer 6 centimeter lang en bevestig ze aan de zijkant van de microscoop. Deze stukjes tape wordt gebruikt om de neuskegel leveren verdoving het dier een positied vast op zijn plaats.
- Scheur twee stukken tape (½ inch breedte) die ongeveer een centimeter in lengte. Deze worden gebruikt om de vlindernaald leveren PBS de muis en het objectglaasje gebruikt om de tumor bloot plaats te houden.
9. Het ontmaskeren van de lies borstklier for Imaging
- Verdoven van het dier in een inductiekamer met 4% isofluraan met 21% zuurstof en rest stikstof (stromingssnelheid aan ongeveer 1,0 L / min) als draaggas. Dit duurt 2-4 min..
- Breng de muis om de chirurgische platform zodra deze is diep en langzaam ademhalen, met het ventrale oppervlak naar boven. Open de anesthesie lijn naar de chirurgische platform en sluit vervolgens de anesthesie lijn naar de inductie kamer, in deze volgorde te hoge druk in de anesthesie te vermijden. Verlagen de concentratie van isofluraan van 4% tot 2,5% op dit moment.
- Controleer het pedaal terugtrekking reflex om te bevestigen dat het dier voldoende Anesthetized voor de chirurgische procedure door het uitvoeren van een voetzool pinch. Het dier is voldoende verdoofd als het niet (bijvoorbeeld twitch of krullen haar staart) reageren op de voetzool knijpen. Als het dier reageren op de voetzool kneep, de concentratie van isofluraan.
- Bevestig de ledematen van de muis om de chirurgische platform met laboratorium tape (½ "tape werkt het beste voor dit).
- (Optioneel) Zodra het dier is bevestigd aan de chirurgische platform kan haar worden verwijderd uit het ventrale oppervlak met elektronische apparaat. Als chemische ontharing voorkeur moet deze worden uitgevoerd 24-48 uur voor de operatie. Het verwijderen van haar voorafgaand aan de operatie helpt bij het voorkomen verontreiniging van de beeldvorming site, zoals haren kunnen induceren sterk en acute immuunrespons.
- Desinfecteer het ventrale oppervlak van het dier met 70% isopropanol doekjes en betadine.
- Met de eerste paar steriele schaar en forceps (met tanden), een subcutane ventrale middellijn incisiedat loopt van ~ 3 mm boven de urethra om de zwaardvormig proces. Pas op dat doorprikken of snijden door het buikvlies.
- Met het tweede paar steriele schaar en forceps (getand), voorzichtig los de huid, de lies verbonden uier, uit de peritoneale holte.
- Neem een microscoopglaasje en plaats het op de huid flap gegenereerd in de vorige stap. Plaats de dia zodanig dat het merendeel van de tumor vlak zitten wanneer de muis wordt op het podium, en niet interfereert met de mobiliteit van de achterpoten.
- Zodra de microscoop dia is goed geplaatst, bevestigt u de dia om het buitenoppervlak van de huid met behulp van superlijm (bijv.., Krazy Glue).
10. Het plaatsen van de muis in het werkgebied
- Verwijder het laboratorium tape waarmee de benen van het dier om de chirurgische platform.
- Open de anesthesie lijn naar de microscoop podium en sluit de anesthesia lijn naar de chirurgische platform, in deze volgorde.
- Snel over het dier de microscooptafel.
- Zodra het dier is overgedragen, positie en zet de anesthesie lijn en neuskegel goed (met behulp van bijvoorbeeld lab tape) om ervoor te zorgen dat de muis verdoofd blijft en zich in een comfortabele positie.
- Bloot tumor zodat het gepositioneerd boven en in het midden van een van het dekglas bedekte imaging poorten in de microscooptafel.
- Met behulp van de oculairs, controleert u of de tumor goed geplaatst is, en zachtjes band naar beneden de microscoop dia. De dia moet losjes worden beveiligd, zodat de bloedtoevoer naar het weefsel niet wordt belemmerd. Taping beneden het objectglaasje minimaliseert de beeldvormingsartefacten die door ademhaling van het dier.
- Plaats de inwonende intraperitoneale overeenkomstig gevleugelde infusieset aan een 1 ml spuit met steriele 1x PBS of zoutoplossing (eventueel een kleurstof zoals PI) bereid onder nr. 5. Inject het dier met 100 ul wanneer het ip. regel ingevoegd. Vanaf dit tijdstip tot het einde van de opnamesessie injecteren het dier met 50 pi zoutoplossing bij 1 uur intervallen (of 25 pi zoutoplossing met PI elke 30 min).
- Om het dier vitale functies te controleren, sluit u een oximeter probe (bijv. MouseOx systeem Starr Life Sciences, Inc) 19.
- Bedek de muis met een verwarming deken om onderkoeling te voorkomen.
11. Overname van afbeeldingen
De open source software μManager (Vale Lab, UCSF) wordt gebruikt om time-lapse beelden te verwerven. De ruwe gegevens worden verzameld in Imaris (bitplane) software, en kan handmatig worden gescoord door onafhankelijke waarnemers, of geanalyseerd in een van beide Imaris of andere software voor beeldanalyse (bijv. Volocity [PerkinElmer] of ImageJ [NIH]).
12. Euthanasie
Aan het einde van de afbeelding zitting (1-40 uur, afhankelijk van het type werkwijze geanalyseerd), wordt het dier gedood.
- De concentratie van isofluorane wordt tot 4%.
- Het dier wordt waargenomen tot 30 sec na grijpt ademhaling en vervolgens verwijderd van het podium.
- Cervicale dislocatie wordt uitgevoerd om te verzekeren dat het dier is gedood.
13. Representatieve resultaten
Intravitale imaging deze methode maakt de directe visualisatie van verschillende processen, waaronder drug delivery tumoren, extravasatie en verdeling van het geneesmiddel wanneer het de tumor, celdood na therapeutische behandeling en tumor-stroma interacties in reactie op celdood 5. Om de komst van een geneesmiddel aan de tumor en de verspreiding ervan naar aanleiding extravasatie in tumor weefsel te observeren, wordt het dier geïnjecteerd terwijl beelden worden verkregen. Hoewel verschillende klassen van chemotherapeutics zijn zwak fluorescerend (zoals doxorubicine), veel niet. Fluorescent geconjugeerd dextranen kan worden gebruikt als surrogaat markers voor drug delivery en diffusie in weefsels. Figuur 2 en Film 1 tonen de komst van een fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC)-geconjugeerd 2 MD dextran (Invitrogen, 1 mg / ml 1xPBS) geïnjecteerd iv. in een tumor van een MMTV-PyMT; ACTB-ECFP muis.
Na de komst van het geneesmiddel in de tumor kan extravasatie en diffusie door het weefsel afgebeeld zowel de intravasculaire halfwaardetijd van een geneesmiddel en geneesmiddelendistributie 5 bepalen. Film 2 toont de extravasatie en distributie van Alexa Fluor 647-geconjugeerd 10 kD dextran (Invitrogen, 1 mg / ml in 1 x PBS) geïnjecteerd iv. een C3 (1)-Tag, ACTB-ECFP, c-fms-EGFP muis tijdens beeldvorming. Na compilatie van time-lapse films in Imaris (bitplane), wordt intravasculaire halfwaardetijd en de distributie van medicijnen gekwantificeerd. Om intravasculaire halfwaardetijd te metenWordt de gemiddelde fluorescentie-intensiteit in tumorbloedvaten op elk tijdstip berekend en uitgezet tegen de tijd. De distributie van medicijnen wordt gekwantificeerd als een percentage van het gebied per totaal tumor gebied dat is positief voor de drug.
Naast het volgen van de kinetiek van geneesmiddelafgifte naar tumoren is het vaak belangrijk om te bepalen hoe tumoren reageren op therapie. Als anti-kankertherapieën verwacht celdood kan propidiumjodide (PI) kleuring of structurele nucleaire veranderingen worden gebruikt als een marker van geneesmiddel-geïnduceerde celdood 5. Figuur 3 toont de tumor respons op de cytotoxische chemotherapeutische doxorubicine in een MMTV -PyMT; ACTB-ECFP, c-fms-EGFP muis. In deze triple transgene MMTV-PyMT; ACTB-ECFP, c-fms-EGFP dier, ECFP labels borstkankercellen (blauw) en EGFP labels myeloïde cellen (groen). Het dier afgebeeld tijdens deze sessie werd toegediend doxorubicine 18 uur vóór beeldvorming begon en PI werd geleverd ip heel thij opnamesessie zoals hierboven beschreven. Kankercellen (ACTB-ECFP etikettering) verschijnen als blauwe, en dode of stervende cellen als rode (PI kleuring). De tijdreeksen hier gepresenteerde toont inductie van doxorubicine-afhankelijke celdood in de tijd. De inductie van celdood in tumoren kwantificeren, is hetzelfde soort analyse voor het bepalen van de distributie van medicijnen gebruikt, waarbij de kwantitatieve uitgang percentage gebied per totaal tumorgebied die positief is voor PI.
Imaging bij een sterke vergroting geeft u graag informatie over de aard van celdood dat kankercellen 5 ondergaan. Film 3 toont de resultaten van een experiment imaging nucleaire veranderingen typisch apoptotische celdood volgen in reactie op systemische therapie met doxorubicine. Te visualiseren kernen, het dier afgebeeld in deze sessie wordt ACTB-H2B-EGFP reporter plaats van de c-fms-EGFP reporter herbergt, zodat de kernen van kankercellen gekenmerkt groen. Dit MMTV-PyMT; ACTB-ECFP; ACTB-H2B-EGFP dier was administered doxorubicine (8 mg / kg in 1 x PBS) ip 24 uur voor het begin van de film, en ontving hourly injecties van 1 x PBS bevattende PI (Invitrogen, 1 mg / ml verdund 1:15). Structurele veranderingen in de kernen van kankercellen kan worden waargenomen in een cel naast apoptotische cellen die necrose ondergaan (PI positieve cellen dat minimale wijzigingen in de nucleaire morfologie te geven). Kernen van apoptotische cellen wordt uiteindelijk rood door de opname van PI kleuring (niet getoond). Het aantal necrotische en apoptotische gebeurtenissen handmatig gekwantificeerd voor elk tijdstip gebaseerd op PI-positiviteit en nucleaire morfologie.
Chemotherapie geïnduceerde kanker celdood resulteert vaak in een reactieve rekrutering van immuuncellen in tumoren 2,4,5. Figuur 4 toont een voorbeeld van stromale reactie op acute behandeling met doxorubicine. De MMTV-PyMT; ACTB-ECFP, c-fms-EGFP dier afgebeeld hier doxorubicine werd toegediend (8 mg / kg in 1 x PBS) ip ip. voor de duur van het experiment om celdood te visualiseren. De aangegeven tijden vertegenwoordigen het aantal uur na doxorubicine behandeling, en de schaal balk vertegenwoordigt 100 pm. In dit experiment, myeloïde cellen infiltreren in gebieden van celdood, zoals aangegeven door de witte pijlen. Om myeloïde celinfiltratie kwantificeren in tumoren na doxorubicine toediening hetzelfde soort analyse voor het bepalen van de distributie van medicijnen en tumor respons op chemotherapie gebruikt, waarbij de kwantitatieve uitgang percentage gebied per totaal tumorgebied die positief is voor EGFP.
Naast het visualiseren van de totale stromale respons op chemotherapie, kan gespecialiseerde stromale reacties ook gevisualiseerd 5. Movie 4 toont de fagocytose van necrotisch celmateriaal door een naburige cel. De rode kernmateriaal kan worden gezien wordt opgenomen door een cel met een large intact groene kern, die typisch macrofagen. De MMTV-PyMT; ACTB-ECFP; ACTB-H2B-EGFP dier afgebeeld tijdens de sessie werd toegediend doxorubicine (8 mg / kg in 1 x PBS) ip. 24 uur voor het begin van de film. Het dier kreeg hourly injecties van 1 x PBS bevattende PI (Invitrogen, 1 mg / ml verdund 1:15). Kernen (ACTB-EGFP etikettering) worden weergegeven als groen, maar rood als de cel ondergaan necrose.
Figuur 1. Voorbeeld etikettering van verschillende tumor onderdelen met behulp van transgene en injecteerbare etiketten Dit is een triple-transgene MMTV-PyMT;. ACTB-ECFP, c-fms-EGFP dier waarbij kankercellen worden in het blauw aangeduid door middel van expressie van ECFP en myeloïde cellen worden geëtiketteerd groen door expressie van EGFP van een myeloïde specifieke promoter. Het dier werd geïnjecteerd met propidiumjodide (PI, rood, ~ 0,07 mg / ml in 1X PBS) tijdensde imaging-sessie tot celdood te visualiseren. PI etiketten DNA, maar enkel over de celmembranen van dode of stervende cellen. Schaal bar = 100 urn.
Figuur 2. Drug extravasatie en distributie in tumoren Deze dubbele transgene MMTV-PyMT;. ACTB-ECFP dier waarbij kankercellen in blauw gelabeld door expressie van ECFP werd geïnjecteerd met FITC-geconjugeerde 2 MD dextran (groen) tijdens de opnamesessie te visualiseren hoe drugs te bereiken tumoren na iv injectie (blauw). Na beeldvorming werd ingeleid aangegeven. Schaal bar = 100 urn.
Figuur 3. Kankercel respons op systemische therapie. An MMTV-PyMT; ACTB-ECFP, c-fms-EGFP dier behandeld met het chemotherapeutischedoxorubicine voorafgaand aan beeldvorming en geïnjecteerd met PI (rood, ~ 0,07 mg / ml in 1X PBS) om celdood te labelen. Dit beeld serie toont de ophoping van PI kleuring tijd (zoals aangegeven door witte pijlen), die de inductie van celdood volgende doxorubicine behandeling. Aangegeven tijd is het tijd na doxorubicine behandeling. Afbeelding zijn maximale intensiteit uitsteeksels van een z-stack met drie beelden in de z-as. Schaal bar = 100 urn.
Figuur 4. Myeloïde cel respons op chemotherapie in een MMTV-PyMT; ACTB-ECFP;. C-fms-EGFP triple transgene muis toegediend doxorubicine 20 uur voorafgaand aan de beeldvorming Het dier kreeg per uur ip. injecties van PI (rood, ~ 0,07 mg / ml in 1X PBS) om dode cellen te labelen. Dit beeld serie toont de ophoping van EGFP-positieve myeloïde cellen (zoals aangegeven door witte pijlen) in de tijd na doxorubicin behandeling. Deze immuunrespons is aangetoond dat therapeutische respons tot verschillende klassen van chemotherapieën 4,5 belemmeren. Aangegeven tijd is het tijd na doxorubicine behandeling. Afbeelding zijn maximale intensiteit uitsteeksels van een z-stack met drie beelden in de z-as. Schaal bar = 100 urn.
Movie 1. . Drug delivery in een tumor Dit is een dubbel-transgene MMTV-PyMT; ACTB-ECFP dier waarbij kankercellen worden in het blauw aangeduid door middel van uitdrukking van ECFP. Het dier werd geïnjecteerd met een 2 MD FITC-geconjugeerd dextran (groen) tijdens de opnamesessie te visualiseren hoe drugs tumoren te bereiken na iv injectie. Scale bar = 100 um. Klik hier om film te bekijken .
Movie 2. Drug infiltratie in het tumorweefsel A triple transgene C3 (1)-Tag,. ACTB-ECFP, c-fms-EGFP dier waarbij kankercellen labeled in blauw door expressie van ECFP en myeloïde cellen gelabeld in groen door expressie van EGFP werd iv geïnjecteerd met een Alexa Fluor 647-geconjugeerd 10 kD dextran (rood). Het gezichtsveld wordt onmiddellijk na injectie met dextran. De dextran labelt aanvankelijk de vasculatuur, snel extravasates in het tumorweefsel en wordt tenslotte opgenomen door macrofagen. Scale bar = 100 um. Klik hier om film te bekijken .
Movie 3. Beeldvorming van nucleaire veranderingen na chemotherapie geïnduceerde celdood Deze triple transgene MMTV-PyMT;. ACTB-ECFP, H2B-EGFP dier werd geïnjecteerd met doxorubicine voorafgaand aan beeldvorming. Nucleaire morfologie (groen) en gevolgd door expressie van een H2B-EGFP-fusie-eiwit, maakt directe visualisatie van door chemotherapie geïnduceerde nucleaire structurele veranderingen typisch apoptose gezien de cel in de rechterbovenhoek. Het dier receIVED half uur ip. injecties van PI (rood) voor de duur van de opnamesessie op dode en stervende cellen te labelen. Aangegeven tijd is het tijd na doxorubicine behandeling +24 uur. Beelden werden verkregen met behulp van een hoge vergroting objectief (40x, NA 1.1, water lens). Scale bar = 15 micrometer. Klik hier om film te bekijken .
Movie 4. Beeldvorming van nucleaire veranderingen en opname van dode celmateriaal na chemotherapie geïnduceerde celdood Deze triple transgene MMTV-PyMT;. ACTB-ECFP, H2B-EGFP dier werd geïnjecteerd met doxorubicine voorafgaand aan beeldvorming. Nucleaire morfologie (groen) en gevolgd door expressie van een H2B-EGFP-fusie-eiwit, maakt directe visualisatie van door chemotherapie geïnduceerde nucleaire structurele veranderingen. Het dier kreeg half uur ip. injecties van PI (rood) voor de duur van de opnamesessie op dode en stervende cellen te labelen. Beelden werden verkregenhet gebruik van een hoge vergroting objectief (40 x, NA 1.1, water lens). Het ontbreken van grote structurele veranderingen vóór codering met PI en de verandering in de nucleaire morfologie en verlies van GFP signaal geeft necrose-achtige celdood. Het dode materiaal wordt gezien wordt opgenomen door een cel met een grote kern, typisch van macrofagen. Aangegeven tijd is het tijd na doxorubicine behandeling +24 uur. Scale bar = 10 micrometer. Klik hier om film te bekijken .
Discussion
De reacties van tumoren voor systemische therapieën in vivo kan sterk verschillen van die van kankercellen in vitro, aangezien de micro zowel de acute respons en recidief 5 beïnvloedt. Een van de grootste obstakels voor expliceren in vivo chemoresistentie paden is de complexiteit van de interacties tussen kankercellen en hun micro-omgeving. Met name omdat solide tumoren hebben een evenwicht tussen kankercellen en stromale cellen, verstoringen van een component, zoals celdood die optreedt tijdens antikankerbehandeling kan leiden tot dramatische gevolgen voor weefsel organisatie.
De intravitale beeldvormingstechniek die hier maakt de directe visualisatie van kankercel-stroma interacties in de tumoren van levende, verdoofde muizen tijdens de behandeling met anti-kanker geneesmiddelen. We maken gebruik van draaiende schijf confocale microscopie, die een relatief beperkte indringdiepte heeft (zie 17 (bijvoorbeeld door infiltratie van een gemerkte populatie of inductie van celdood), celmotiliteit, verdeling van injectables (bijv. vasculaire lekkage sporen), en co-sporen omvatten lokalisatie van fluorescentiesignalen 5,12,17,20.
We routinematig beeld muizen voor meer dan 6 uur en ook uitgevoerd beeldvorming voor meer dan 18 uur. Dit vereist het handhaven van de muizen onder narcose continu voor deze lange tijdsperioden. Met de juiste verdoving, meer dan 90% van onze dieren te overleven 6 uur, en ongeveer 80% overleeft meer dan 18 uur. Details over hoe de lange termijn anesthesie uit te voeren zijn eerder 19 gepubliceerd. In onze ervaring, vijf factoren zijn van cruciaal belang: het vermijden van hypothermie, het vermijden van uitdroging, het onderhouden van fysiologische bloed zuurstof saturatie niveaus, uzingen bevochtigd draaggas voor isofluraan, en het houden van de dieren op het laagste niveau van de anesthesie, waarbij zij geen tekenen van pijn. Om lichaamstemperatuur houden we muizen in een verwarmde deken (bij 38 ° C). Om uitdroging te voorkomen, we injecteren van kleine hoeveelheden zout ip gedurende de gehele beeldvorming procedure. Om fysiologische bloed zuurstof saturatie op peil te houden, beginnen we met 21% zuurstof in het dragergas (in plaats van de gebruikelijke 100%). Dit stelt ons in staat om ingeademde zuurstof te verhogen als een muis - uren in een experiment - laat een daling zien in het bloed zuurstof verzadiging. In onze ervaring, het verhogen van de ingeademde zuurstof niveaus op een zodanig tijdstip (bijv. 30-40%) bijna altijd zullen stabiliseren het dier waardoor uur extra beeldvorming. Het optimale niveau van anesthesie is bereikt met de meeste muizen 1-1,5% isofluraan en resulteert in adem percentages 60-65/min en hartslag van 400-450/min. In onze beeldvorming experimenten hebben we voornamelijk gebruik van transgene muismodels (MMTV-PyMT en C3 [1]-Tag) waarin tumoren multifocale, waardoor beeldvorming van meerdere laesies in verschillende stadia van tumorprogressie in parallel op verschillende x, y posities tijdens een opnamesessie. Dit vermindert bezorgdheid over mouse naar muis variatie met betrekking tot experimenten gericht op het identificeren fase-afhankelijke therapeutische respons en vermindert het aantal dieren vereist voor imaging.
De MMTV-PyMT model (en andere spontane kanker modellen) gaan door middel van progressieve histopathologische fasen die kunnen worden herkend tijdens intravitale beeldvorming, hoewel de pathologische stadiëring van de tumor laesies die kunnen worden gedaan tijdens intravitale beeldvorming is anders, en minder gedetailleerd dan die van de histologische coupes 5,17. In tegenstelling, transplantatie modellen hebben de neiging om het beste weerspiegelen laat stadium tumoren, omdat de kankercellen meestal geïsoleerd van gevorderde tumoren. Dergelijke modellen zijn dus beter geschikt voor het bestuderen van tumor-stromainteracties van laat stadium tumoren dan verschillen in deze interacties tussen verschillende stadia.
We tonen voorbeelden van hoe je beeld nucleaire structurele veranderingen die zich voordoen na celdood geïnduceerd door therapie. Bij afwezigheid van anti-kankerbehandeling Deze strategie labeling plaats kan worden gebruikt om beelden celdeling in situ belichten, bijvoorbeeld hoe celproliferatie en dormantie wordt beïnvloed door de micro-omgeving. In de toekomst kunnen fluorescente labeling van mitochondriale componenten maken het mogelijk om beeld mitochondriale veranderingen tijdens apoptose.
In dit protocol hebben wij ook aangetoond voorbeelden van het beeld kankercel-immune cel interacties na de therapie, maar andere microenvironmental componenten kunnen worden gevisualiseerd en afgebeeld. Bestaande transgene reporter lijnen voor stromale componenten omvatten die voor fibroblasten (bijv.., FSP1-EGFP 17, αSMA-RFP 21, COL1A1-EGFP 21) of cellen van de vasculatuur (bijvoorbeeld Tie2-GFP 22; VEGF-GFP 23).
Intravitale beeldvorming maakt het mogelijk om real-time visualisatie van de interacties en processen die zich voordoen in vivo volgende toediening van chemotherapie. Met de technologie die momenteel beschikbaar is, hebben we grote vooruitgang geboekt in het begrijpen hoe myeloïde cellen beïnvloeden therapeutische respons, maar omdat de tumor micro-omgeving is zo complex, grote vooruitgang is nog steeds noodzakelijk om te beginnen te mechanistisch verdiepen in de processen die ten grondslag liggen aan milieu-gemedieerde resistentie tegen geneesmiddelen. Een van de belangrijkste verbeteringen nog steeds nodig is de identificatie van betere markers voor specifieke celpopulaties. Het belang van een betere markers goed geïllustreerd met twee van de belangrijkste componenten stromale cellen van de borst tumor micro-omgeving fibroblasten en immuuncellen. α-gladdespieractine (αSMA) wordt vaak gebruikt om te identificerenfibroblasten, maar het eiwit wordt ook uitgedrukt door vasculaire gladde spiercellen en myo cellen 24. Dus, hoewel αSMA-GFP reporter muizen bestaan, het bepalen van de specifieke celtype dat volgende tijdens een intravitale imaging experiment is een uitdaging. Evenzo zal een fluorescerende marker zoals EGFP expressie gebracht onder de c-fms promoter geven vaak meerdere subpopulaties van immuuncellen 12,17. Ofschoon zou het liefst een marker om een specifiek celtype identificeren de complexiteit van de onderliggende biologie een belangrijke uitdaging in deze aanpak.
Een gedeeltelijke oplossing voor dit probleem is injecteerbare labels gebruiken om verder te differentiëren subpopulaties van cellen die dezelfde fluorescerende reporter. Bijvoorbeeld worden fluorescerende dextranen opgenomen door macrofagen en kan worden gebruikt om de macrofaag subpopulaties die gelabeld door de c-fms-EGFP en Fsp1-EGFP transgene muizen reporter label
Anders tumor respons curven gegenereerd door caliper meting, die weinig mechanistische informatie over hoe of waarom tumoren reageren op de toegediende therapeutische of histologische reeksen uit weefsels geoogst op verschillende tijdstippen dat grote cohorten van dieren criteria beantwoorden, onze techniek levert rechtstreekse, kwantificeerbare informatie op de dynamiek van celdood en interacties van stromale cellen met kankercellen in kleine cohorten. Dus het voordeel dat de procedure die hier is dat het dynamische geneesmiddeleninfo reacties voorziet in de context van een intacte tumor micro-omgeving in real-time. Dergelijke informatie kan leiden tot belangrijke inzichten in de onderliggende processen die therapeutische respons te rijden 5 </ Sup>.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten bekend te maken. Alle dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met IACUC goedgekeurde protocollen.
Acknowledgments
Wij danken J. Cappellani en J. Qiu voor technische ondersteuning. Dit werk werd ondersteund door de middelen van het National Cancer Institute (U01 CA141451), het Starr Cancer Consortium, Susan G. Komen voor de Cure, Long Island 2 Dag Loop naar borstkanker, Manhasset Women's Coalition Against Breast Cancer met mij vechten, en een pre-doctorale beurs van de Congressionally Breast Cancer Research Program, VS ESNESN is ook de ontvanger van de Leslie C. Snel en William Randolph Hearst Stichting Fellowships van de Watson School of Biological Sciences. HAA werd ondersteund door middelen van de Noorse Raad voor Onderzoek (160698/V40 en 151882), en Zuidoost-Regional Health Authorities (2007060).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| MMTV-PyMT mice | Jackson Laboratory | 2374 | |
| C3(1)-Tag mice | Jackson Laboratory | 13591 | |
| ACTB-ECFP mice | Jackson Laboratory | 3773 | |
| ACTB-H2B-EGFP mice | Jackson Laboratory | 5418 | |
| 1 x PBS | Made in-house | ||
| 2 MD Dextran, Fluorescein-conjugated | Invitrogen | D-7137 | Reconstitute in dH2O (4 mg/mL, store at -20 °C); dilute to 1 mg/ml in 1 x PBS |
| 10 kD Dextran, Alexa Fluor 647-conjugated | Invitrogen | D-22914 | Reconstitute in dH2O (4 mg/mL, store at -20 °C); dilute to 1 mg/ml in 1 x PBS |
| Doxorubicin hydrochloride | Sigma-Aldrich | 44583 | Reconstitute in dH2O and store at 4 °C; dilute in 1 x PBS |
| Isothesia (Isoflurane) | Butler Animal Health Supply | 029450 | 250 ml |
| Propidium iodide | Invitrogen | P3566 | 1 mg/ml; dilute 1:15 in 1 x PBS |
| Nitrogen | |||
| Oxygen | |||
| Equipment | |||
| 18G x 1½" regular bevel needle | BD | 305196 | |
| μManager | Vale Lab, UCSF | www.micro-manager.org | Open-source software |
| Alcohol swab | BD | 326895 | 70% isopropyl alcohol swabs |
| Anesthesia system | Molecular Imaging Products, Co. | ||
| Cover glass | Corning | 2940-245 | No. 1½, 24x50 mm; disinfect with 70% isopropanol wipes |
| Curity gauze sponges (sterile) | Kendall | 6939 | |
| Glass microscope slides | Corning | 2948-75x25 | Pre-cleaned; if not pre-cleaned, disinfect with 70% isopropanol wipes |
| Hardened fine scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | 2 pairs; stainless steel, sharp-sharp tips, straight tip, 26 mm cutting edge, 11 cm length |
| Heated blanket | Gaymar Industries | ||
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | Turn on approximately 30 min before use; sterilize tools at >200 °C for 30 sec |
| Imaris | Bitplane | www.bitplane.com | |
| Krazy Glue | Elmer’s Products | KG484 | |
| Laboratory tape ( ½") | |||
| Laboratory tape (1") | |||
| Lid to a Styrofoam shipping cooler | This will be used as the surgical platform | ||
| Micro dissecting forceps | Roboz | RS-5153 | 1x2 teeth, slight curve, 0.8 mm tip width, 4" length |
| Micro dissecting forceps | Roboz | RS-5135 | Serrated, slight curve, 0.8 mm tip width; 4" length |
| Microscope | Spinning-disk confocal, XYZ Piezo stage, epifluourescence capablility17,25 | ||
| Microscope stage insert | Applied Scientific Instrumentation | Custom fabricated, with two circular imaging ports | |
| MouseOx oximeter, software, and sensors | STARR Life Sciences | www.starrlifesciences.com | |
| Nalgene Super Versi-Dry lab soakers | Thermo Scientific | 74218-00 | Cut into fourths for lining surgical platform |
| Nebulizer | Salter Labs | 8901 | Used to humidify gases; prevents irritation of lung tissues |
| Slip-tip disposable tuberculin syringe (1 ml) | BD | 309659 | |
| Surflo winged infusion set | Terumo | SV-23BLK | 23G x ¾" ultra thin needle, 12" tubing |
| Betadine Spray | Purdue Pharma | BASP3H | |
References
- Egeblad, M., Nakasone, E. S., Werb, Z. Tumors as organs: complex tissues that interface with the entire organism. Dev. Cell. 18, 884-901 (2010).
- Ahn, G. -O., Tseng, D., Liao, C. -H., Dorie, M. J., Czechowicz, A., Brown, J. M. Inhibition of Mac-1 (CD11b/CD18) enhances tumor response to radiation by reducing myeloid cell recruitment. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 8363-8368 (2010).
- Tlsty, T. D., Coussens, L. M. Tumor stroma and regulation of cancer development. Annu. Rev. Pathol. 1, 119-150 (2006).
- DeNardo, D. G., Brennan, D. J., et al. Leukocyte complexity predicts breast cancer survival and functionally regulates response to chemotherapy. Cancer Discov. 1, 54-67 (2011).
- Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., et al. Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance. Cancer Cell. 21, 488-503 (2012).
- Kim, J. B., Stein, R., O'Hare, M. J. Three-dimensional in vitro tissue culture models of breast cancer-- a review. Breast Cancer Res. Treat. 85, 281-291 (2004).
- Gilbert, L. A., Hemann, M. T. DNA damage-mediated induction of a chemoresistant niche. Cell. 143, 355-366 (2010).
- Pittet, M. J., Weissleder, R. Intravital imaging. Cell. 147, 983-991 (2011).
- Lohela, M., Werb, Z. Intravital imaging of stromal cell dynamics in tumors. Curr. Opin. Genet. Dev. 20, 72-78 (2010).
- Boissonnas, A., Fetler, L., Zeelenberg, I. S., Hugues, S., Amigorena, S. In vivo imaging of cytotoxic T cell infiltration and elimination of a solid tumor. J. Exp. Med. 204, 345-356 (2007).
- Breart, B., Lemaître, F., Celli, S., Bousso, P. Two-photon imaging of intratumoral CD8+ T cell cytotoxic activity during adoptive T cell therapy in mice. J. Clin. Invest. 118, 1390-1397 (2008).
- Engelhardt, J. J., Boldajipour, B. Marginating dendritic cells of the tumor microenvironment cross-present tumor antigens and stably engage tumor-specific T cells. Cancer Cell. 21, 402-417 (2012).
- Brown, E., McKee, T., et al. Dynamic imaging of collagen and its modulation in tumors in vivo using second-harmonic generation. Nat. Med. 9, 796-800 (2003).
- Wyckoff, J. B., Wang, Y., et al. Direct visualization of macrophage-assisted tumor cell intravasation in mammary tumors. Cancer Res. 67, 2649-2656 (2007).
- Yuan, F., Salehi, H. A., Boucher, Y., Vasthare, U. S., Tuma, R. F., Jain, R. K. Vascular permeability and microcirculation of gliomas and mammary carcinomas transplanted in rat and mouse cranial windows. Cancer Res. 54, 4564-4568 (1994).
- Jain, R. K., Munn, L. L., Fukumura, D. Dissecting tumour pathophysiology using intravital microscopy. Nat. Rev. Cancer. 2, 266-276 (2002).
- Egeblad, M., Ewald, A. J., et al. Visualizing stromal cell dynamics in different tumor microenvironments by spinning disk confocal microscopy. Dis Model Mech. 1, 155-167 (2008).
- Cheng, N., Lambert, D. L. Mammary Transplantation of Stromal Cells and Carcinoma Cells in C57BL/6J. Mice. J. Vis. Exp. (54), ee2716 (2011).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harb. Protoc. 2011, pdb.prot5563 (2011).
- Sounni, N. E., Dehne, K., et al. Stromal regulation of vessel stability by MMP14 and TGFbeta. Dis. Model Mech. 3, 317-332 (2010).
- Magness, S. T., Bataller, R., Yang, L., Brenner, D. A. A dual reporter gene transgenic mouse demonstrates heterogeneity in hepatic fibrogenic cell populations. Hepatology. 40, 1151-1159 (2004).
- Motoike, T., Loughna, S., et al. Universal GFP reporter for the study of vascular development. Genesis. 28, 75-81 (2000).
- Fukumura, D., Xavier, R., et al. Tumor induction of VEGF promoter activity in stromal cells. Cell. 94, 715-725 (1998).
- Sugimoto, H., Mundel, T. M., Kieran, M. W., Kalluri, R. Identification of fibroblast heterogeneity in the tumor microenvironment. Cancer Biol. Ther. 5, 1640-1646 (2006).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Dynamic, long-term in vivo imaging of tumor-stroma interactions in mouse models of breast cancer using spinning-disk confocal microscopy. Cold Spring Harb. Protoc. 2011, pdb.top97 (2011).
