Summary
Vi beskriver en metod för avbildning av svar på anti-cancerbehandling
Abstract
Tumören mikromiljö spelar en central roll i tumör initiering, progression, metastas, och svaret på cancerbehandlingar. Tredimensionella sam-odlingssystem används ofta för att explicera tumör-stroma interaktioner, inklusive deras roll i narkotika svar. Däremot kan många av det samspel som sker in vivo i den intakta mikromiljön inte helt replikeras i dessa in vitro-inställningar. Sålunda har direkt visualisering av dessa processer i realtid blivit ett viktigt verktyg för att förstå tumör svar på behandlingar och identifiera interaktioner mellan cancerceller och stroma som kan påverka dessa svar. Här ger vi en metod för att använda roterande skiva konfokalmikroskopi av levande, sövda möss att direkt observera läkemedelsdistribution, svar cancercell och förändringar i tumör-stroma interaktioner efter administrering av systemisk terapi i modeller bröstcancer. Vi beskriver förfaranden för labeling olika tumörer komponenter, behandling av djur för observation terapeutiska svar, och det kirurgiska ingreppet för att exponera tumörvävnad för avbildning upp till 40 timmar. De resultat som erhållits från detta protokoll tidsförlopp filmer, där sådana processer som drog infiltration, cancer celldöd och stromal migration kan utvärderas med hjälp av programvara bildanalys.
Introduction
Solida tumörer består av två stora avdelningar: cancerceller och de stromala beståndsdelar (både cellulära och icke-cellulära) som hjälper till att upprätthålla en lämplig miljö för tumörtillväxt 1. Dessa stromala komponenter spelar avgörande roller i utvecklingen, utveckling och metastasering av många typer av cancer, däribland bröst 2-5. Den stromala miljö påverkar också terapeutiska responser 2,4,5. Sålunda, bestämma hur cancerceller svarar på konventionella och nya terapier inom ramen för den intakta mikromiljön är viktig för att främja vår förståelse av cancer biologi och förbättra dagens terapeutiska strategier. Dessutom definierar hur cancer cell-stroma interaktioner förändras efter administrering av behandlingen är avgörande för att förstå biologi tumörrecidiv.
Organotypic samodling system har varit till nytta för att studera tumör-stroma interaktioner
Det primära sättet att studera reaktioner på anti-cancerbehandling in vivo har gått igenom mätningar av tumörstorlek och histologisk utvärdering av vävnader som härrör från behandlade djur eller patienter. Däremot har framsteg inom mikroskopi och fluorescerande reportrar under de senaste två decennierna gjort det möjligt att visualisering av inter-och intracellulära processermed hög upplösning i levande, sövda djur (intravital avbildning) 8. Dessa intravital mikroskopi tekniker har visat sig vara särskilt värdefullt för rumsligt och tidsmässigt dissekera in vivo dynamik tumör-stroma interaktioner vid cellulär och sub-cellulära upplösning 8,9.
Processer som har unraveled genom intravital avbildning inkluderar anti-tumör T-cell cytotoxicitet 10,11, interaktioner mellan T-celler och myeloida celler 12, dynamiken av förändringar i kollagen sammansättning och organisation efter terapeutisk behandling 13, makrofag-beroende cancercell intravasering och metastasering 14 och vaskulär permeabilitet 15.
Det finns tre huvudsakliga krav för intravital avbildning. Dessa inkluderar lämpliga förberedelser och exponering av vävnader för avbildning, fluorescerande märkning av vävnadskomponenter av intresse, och en parad mikroskopi-kamera ssystemprogram kan förvärva bilder 16. De vanligaste strategier som används för att hantera dessa krav är: 1) heterotopiska preparat (t.ex. inympning av örat eller ögat orbital), permanent avbildning fönster eller exterioriserades preparat (t.ex. rygghuden flik), 2) transgena fluorescerande reportrar och.. fluorescerande injicerbara att märka vävnadskomponenter, och 3) multiphoton eller konfokalmikroskopi system ihop med fotomultiplikatorrör eller charge-coupled device (CCD) kameror respektive 9. Vi använder en kirurgiskt preparerad modell hud flik för att exponera inguinal bröstkörteln för avbildning av sövda djur som uttrycker transgener som kodar fluorescerande reportrar. Bilder erhålls under en period av 12 till 40 timmar med en intensifierad CCD (ICCD) kamera paras ihop med en fyra-laser spinning skiva konfokalmikroskop systemet 17. Imaging på detta sätt har vi kunnat studera sådana processer som in vivo läkemedelsdistribution, steg-beroende lmemotherapeutic svar, typ av kemoterapi-inducerad celldöd och myeloid cellbeteende 5.
Vi erbjuder ett protokoll för intravital avbildning av svaren cancercellinjer till anti-cancerbehandling och tumör-stroma interaktioner i musmodeller av bröstcancer. Detta protokoll kan användas för att spåra beteenden och död för både cancerceller och stromala komponenter med ett brett utbud av transgena och injicerbara fluorescerande etiketter både transgena och transplantation modeller för perioder på upp till 40 timmar i en enda avbildning session.
Protocol
Alla beskrivna förfaranden måste utföras i enlighet med de riktlinjer och regler för användning av ryggradsdjur, inklusive förhandsgodkännande av lokala institutionella Animal Care och användning kommittén.
1. Generera Mus brösttumörer för Imaging (transgena eller ortotop)
- Generera brösttumörer för avbildning med genetiskt manipulerade musmodeller (t.ex. mus brösttumörvirus långa terminala upprepning [MMTV]-polyoma mitten T-antigenet [PyMT] eller råtta C3 (1) promotorn drivna stort T-antigen (Tag) av SV40 [C3 ( 1)-Tag] modeller) eller ortotop modeller transplantation (syngen, allogen eller xenogen).
- Etikett cancerceller genom att korsa genetiskt modifierade modeller med transgena reporter linjer (t.ex. ACTB-ECFP) eller använd ex vivo manipulation av primär cancer celler eller cellinjer (t.ex. transduktion) följt av transplantation. För ett prov protokoll för ortotop transplantation, see 18.
2. Visualisera komponenter av tumören mikromiljön eller sub-cellulära komponenter
- Visualisera tumör komponenter med transgena etiketter. Blandras genetiskt modifierade tumörmodeller med transgena reporter möss (t.ex. C-fms-EGFP för myeloida celler eller ACTB-H2B-EGFP för kärnor) eller använder sådana möss som mottagare av transplanterade märkta, vävnader. Detta möjliggör visualisering av cancer cell-stromacellinjer interaktioner som svar på terapi eller nukleära förändringar som förknippas med celldöd, respektive.
- Visualisering mikromiljön med injicerbara. Ett stort antal olika medel (t.ex. fluorescensmärkta antikroppar eller färgämnen kemiska) kan användas för att märka olika komponenter av tumören. Beroende på halveringstiden av färgämnet och svaret man är intresserad spårning, kan den injicerbara administreras före starten av avbildning eller under avbildning sessionen antingen intravenöst (iv.) Eller intraperitoneally (ip., figur 1).
3. Mikroskop och bildbehandling
- Mikroskop. En mängd olika mikroskop system och programvara kan användas för avbildning av levande möss. De vanligaste systemen är konfokala eller multiphoton mikroskop. Vi använder en mikro-lensed spinning skiva konfokalmikroskop (Solamere Technologies, Salt Lake City, UT) med en ICCD kamera (XR-Mega-10EX S-30, Stanford Photonics, Palo Alto, CA).
- Bildbehandlingsprogram. Vi använder öppen μManager källkod (Vale Lab, University of California, San Francisco [UCSF]).
- Bildanalys. Vi använder Imaris (Bitplane), Volocity (PerkinElmer) och ImageJ (National Institute of Health [NIH]) för bildanalys.
4. (Pre)-behandling av djur för Imaging
- Inguinal brösttumörer är optimala för avbildning med hjälp av vår protokoll när den längsta diametern mäter ca 8 mm eller mindre bromsok mätningement.
- För avbildning djur behandlade med en lågmolekylär hämmare, terapeutisk antikropp eller kemoterapeutiskt läkemedel, påbörja behandling före eller under avbildning som krävs för experimentet. Till exempel kräver avbildning av narkotika extravasering och distribution administrering efter avbildning har initierats (filmer 1 och 2), medan avbildning av celldöd inducerad av kemoterapeutiska läkemedel doxorubicin bäst fångas genom att starta avbildning 24 timmar eller senare efter läkemedelsbehandling (filmer 3 och 4).
5. Beredning av saltlösning för att upprätthålla hydrering och blod osmolaritet djuret under Imaging
- Rita ca 1 ml 1 x PBS till en 1 ml spruta. Propidiumjodid (PI, Invitrogen, 1 mg / ml, utspädda 1:15) kan sättas till denna lösning som kommer att periodiskt administreras (ip.) Under det bildgivande sessionen. Detta kommer att möjliggöra avbildning av kärnorna av döda eller döende celler som har permeabla cellmembran. PI har en mycket kort half-livet i kärlsystemet och måste därför ges igen under avbildning sessionen.
- Bifoga en bevingad infusionsset (23 gauge, ¾ tum nål, 12 tum slang) till denna spruta och tryck lösningen genom slangen tills en droppe saltlösning lämnar nålspetsen i slutet av slangen.
- Ta bort sprutan från infusionssetet och fyll den med lämplig saltlösning.
- Sätt tillbaka sprutan till infusionssetet, noga med att inte införa bubblor i linjen.
6. Framställning av isoflurananestesi systemet
- Tillsätt vatten i nebulisatorn och skruva fast den på plats. Detta kommer att fukta de gaser som levereras till djuret, vilket förhindrar irritation av lungor och förlänga överlevnaden av djur under långfristiga anestesi.
- Fyll isofluran tanken till översta raden. VARNING: Isofluran är ett potent bedövningsmedel som även kan påverka forskaren. Lämpliga vakuumsystem ska be på plats för att säkerställa att överskott gaser avlägsnas från området.
- Slå på både syre tank och tankarna kväve och justera flödet. Kvävet bör vara ca 1,0 l / min, medan syre bör vara ca 0,2 l / min (~ 21%).
- Slå på (in-house) vakuum. Vakuumet bör vara ca 1,2 l / min.
- Bekräfta att anestesi linjen till induktion kammaren är öppen, och linjerna till operationen området och mikroskopet är stängda.
- Kontrollera att latex andningspåsen ansluten till anestesi-systemet är uppblåst. Om påsen inte blåsa, byt ut den.
- Kontrollera gummimembranet på varje noskoner levererar anestesi till mikroskopet scenen och kirurgiska plattformen. Om gummit börjar tunna, byt ut den.
7. Beredning av kirurgiska verktyg och kirurgisk Platform
- Slå på en varm pärla autoklav och låt den når> 200 ° C.
- Tvätta de kirurgiska verktyg i tvål och vatten(En pincett [företrädesvis med tänder] och sax för att skära genom huden hos djuret, en pincett [företrädesvis tandad] och saxar för ytterligare exponering av tumören).
- Sterilisera kirurgiska verktyg för minst 30 sekunder med hjälp av varma pärla autoklav (alternativt kan de kirurgiska verktygen autoklaveras i förväg).
- Låt kirurgiska instrument svalka samtidigt se till att undvika kontaminering de steriliserade verktyg.
- Samla locket till en frigolit sjöfart svalare. Detta kommer att vara din kirurgiska plattform.
- Placera en bit av ett labb soaker ovanpå frigolit lock (tillräckligt för att täcka det).
- Fästa en noskon med en linje till anestesi-systemet till labbet soaker med laboratorie band (1 "band fungerar bäst här). Sätt en 18 G x1 ½" nål genom band i frigolit locket på vardera sidan av noskonen för att hålla noskonen fäst på plats.
- Avsätt Betadine, steril gasbinda, två 70% isopropanol våtservetter, ett mikroskopslide, Krazy Lim och 4 stycken lab tejp (½ "bredd).
8. Framställning av mikroskop
- Slå på mikroskopet, kameran och datorn som kör mikroskop.
- Slå på värmefilt.
- Om ett inverterat mikroskop skall användas, bör en skräddarsydd steget insats utformas med imaging portar motsvarande placeringen av de inguinala mjölkkörtlarna. Rengör scenen in ordentligt med tvål och vatten och torka. Använd lab tejp (½ "fungerar bäst) för att säkra täckglas (# 1,5 tjocklek) över imaging portarna och rengöra hela ytan med 70% isopropanol. Täck scenen med steril gasbinda för att skydda mot nedsmutsning. Placera scenen insatsen i steget och låta det lufttorka.
- Riv 4 till 6 stycken lab tejp (1 "bredd), ca 6 inches i längd och fäst dem vid sidan av mikroskopet. Dessa tejpbitar kommer att användas för att positionera noskonen levererar anestesi till djuret end fäst den på plats.
- Riv två tejpbitar (½ tum bredd) som är omkring en tum i längd. Dessa kommer att användas för att hålla fjärilsnål levererar PBS till musen och objektglas som används för att exponera tumören på plats.
9. Exponera inguinal bröstkörteln för Imaging
- Bedöva djuret i en induktionskammare med 4% isofluran med 21% syre och resten kväve (flödeshastighet ca 1,0 l / min) som bärargas. Detta bör ta 2-4 minuter.
- Överför musen till kirurgiska plattformen när den andas djupt och långsamt, med den ventrala ytan vänd uppåt. Öppna anestesi linjen till den kirurgiska plattformen och stäng anestesi linjen till induktion kammare, i denna för att undvika alltför högt tryck i anestesi-systemet. Minska koncentrationen av isofluran från 4% till 2,5% vid denna tidpunkt.
- Kontrollera pedalen tillbakadragande reflexen att bekräfta att djuret är tillräckligt Anesthetized för den kirurgiska proceduren genom att utföra en trampdyna nypa. Djuret är tillräckligt bedövad om det inte reagerar (t.ex. rycka eller curl svansen) till trampdynan nypa. Om djuret reagerar på trampdynan nypa, öka koncentrationen av isofluran.
- Säkra lemmar musen till den kirurgiska plattform med laboratorie band (½ "band som fungerar bäst för detta).
- (Valfritt) När djuret är fäst vid kirurgiska plattformen, kan hår avlägsnas från den ventrala ytan med hjälp av en elektronisk rakapparat. Om kemisk hårborttagning föredrages, bör detta utföras 24-48 timmar före operation. Bort hår före operation hjälper till att förhindra kontaminering av det bildgivande platsen, eftersom herrelösa hår kan inducera starka och akut immunsvar.
- Desinficera ventrala ytan av djuret med 70% isopropanol våtservetter och betadin.
- Använda det första paret steril sax och pincett (med tänder), gör en subkutan ventralt mittlinjeincisionsom går från ~ 3 mm ovanför urinröret till xiphoid processen. Var noga med att undvika punktering eller skära genom bukhinnan.
- Använda det andra paret av steril sax och tång (rafflade), försiktigt loss huden, med inguinal fäst bröstkörteln, från peritonealhålan.
- Ta en glasskiva mikroskop och placera den mot huden flik genereras i föregående steg. Placera bilden så att den största delen av tumören sitter platt när musen placeras på scenen, och det stör inte rörlighet bakbenen.
- När objektglas är korrekt positionerad, fäst bilden till den yttre ytan av huden med hjälp superlim (t.ex.., Krazy lim).
10. Placering av musen på scenen
- Ta laboratoriet tejpen som håller benen på djuret till kirurgiska plattformen.
- Öppna anestesi linjen till mikroskop scenen och stäng anestesisia linje till den kirurgiska plattformen, i denna ordning.
- Snabbt överföra djuret till mikroskopet stadiet.
- När djuret har överförts, position och säkra anestesi linje och noskonen på rätt sätt (med hjälp av t.ex. lab tejp) för att säkerställa att musen är sövd och ligger i en bekväm ställning.
- Exponera tumören så att den är placerad på toppen och i mitten av en av de täckta täckglas avbildning hamnar i mikroskop scenen.
- Med hjälp av okularen, kontrollera att tumören är rätt placerad, och försiktigt tejpa ner objektglas. Bilden bör säkras löst så blodflödet till vävnaden inte hindras. Tejpa ner objektglas hjälper till att minimera imaging artefakter som införs genom djurets andning.
- Sätt kvarliggande intraperitoneala linje med bevingade infusionssetet fäst till en 1-ml spruta innehållande steril 1 x PBS eller saltlösning (eventuellt innehållande ett färgämne, såsom PI) framställdes under # 5. Inject djuret med 100 ^ När IP. rad införas. Från denna tidpunkt till slutet av den avbildande sessionen, injicera djuret med 50 pl saltlösning vid 1 h intervall (eller 25 pl koksaltlösning med PI varje 30 min).
- För att övervaka djurens vitala, bifoga en oximeter sond (t.ex. MouseOx system genom Starr Life Sciences, Inc.) 19.
- Täck musen med en värmefilt för att förhindra hypotermi.
11. Förvärv av bilder
Den öppna källkod μManager (Vale Lab, UCSF) används för att förvärva time-lapse-bilder. Den råa data sammanställs i Imaris (Bitplane) programvara och kan poäng manuellt av oberoende observatörer, eller analyseras i antingen Imaris eller andra bildanalys programvara (t.ex. Volocity [PerkinElmer] eller ImageJ [NIH]).
12. Eutanasi
Vid slutet av sessionen bilden (1-40 h, beroende på vilken typ av process som analyseras), djuret avlivas.
- Koncentrationen av isofluoran ökas till 4%.
- Djuret observeras förrän 30 sekunder efter det griper andas och sedan bort från scenen.
- Halsdislokation utförs för att säkerställa att djuret har avlivats.
13. Representativa resultat
Intravital avbildning med denna metod möjliggör direkt visualisering av olika processer, inklusive läkemedelstillförsel till tumörer, extravasering och fördelning av läkemedlet när den når tumören, celldöd efter terapeutisk behandling, och tumör-stroma interaktioner som svar på celldöd 5. För att observera ankomsten av ett läkemedel till tumören och dess fördelning efter extravasering i tumörvävnader är djuret injiceras medan bilder förvärvas. Även om flera klasser av chemotherapeutics är svagt fluorescerande (t.ex. doxorubicin), många är det inte. Fluorescens konjugerade dextraner kan användas som surrogatmarkörer för läkemedelsavgivning och diffusion in i vävnader. Visar ankomsten av en fluorescein-isotiocyanat (FITC)-konjugerat 2 MD-dextran (Invitrogen, 1 mg / ml 1 x PBS) injiceras intravenöst Figur 2 och film 1. till en tumör i ett MMTV-PyMT, ACTB-ECFP mus.
Efter ankomsten av läkemedlet in i tumören, kan extravasering och diffusion genom vävnaden avbildas för att bestämma både den intravaskulära halveringstiden för ett läkemedel och läkemedel fördelning 5. Film 2 visar extravasering och distribution av Alexa Fluor-647-konjugerad 10 kDa dextran (Invitrogen, 1 mg / ml i 1 x PBS) injicerades iv. in en C3 (1)-Tag, ACTB-ECFP c-fms-EGFP mus under avbildning. Efter sammanställning av time-lapse-filmer i Imaris (Bitplane) är intravaskulär halveringstid och läkemedelsdistribution kvantifieras. För att mäta intravaskulär halveringstid, Är den genomsnittliga fluorescensintensiteten i tumörblodkärl vid varje tidpunkt beräknades och plottades mot tiden. Läkemedelsdistribution kvantifieras i procent område per total tumör område som är positivt för drogen.
Förutom att spåra kinetiken för läkemedelsadministrering till tumörer, är det ofta viktigt att bestämma hur tumörer svarar på terapi. Som anti-cancerterapier förväntas inducera celldöd, kan propidiumjodid (PI) färgning eller strukturella nukleära förändringar kan användas som en markör för läkemedelsinducerad celldöd 5. Visar tumören svar på cytotoxiska kemoterapeutiska doxorubicin i en MMTV Figur 3 -PyMT, ACTB-ECFP c-fms-EGFP mus. I denna tredubbla transgena MMTV-PyMT, ACTB-ECFP c-fms-EGFP djur, ECFP etiketter bröstcancerceller (blå) och EGFP etiketter myeloida celler (grön). Djuret avbildas under den här sessionen gavs doxorubicin 18 timmar före avbildning började och PI levererades ip hela than avbildning session som beskrivits ovan. Cancerceller (ACTB-ECFP märkning) visas som blå och döda eller döende celler visas som rött (PI färgning). De tidsserier presenteras här visar induktion av doxorubicin-beroende celldöd över tiden. För att kvantifiera induktionen av celldöd i tumörer, är samma typ av analys används för att bestämma läkemedelsdistribution används, där den kvantitativa utsignalen är procent område per totalt tumörområdet som är positiv för PI.
Imaging vid hög förstoring kan ge information om vilken typ av celldöd som cancerceller genomgå 5. Film 3 visar resultaten av en avbildande experiment för att spåra nukleära förändringar typiska för apoptotisk celldöd som svar på systemisk behandling med doxorubicin. För att visualisera kärnor, hamnar djuret avbildas under sessionen ACTB-H2B-EGFP reporter istället för c-fms-EGFP reporter, så kärnorna av cancerceller är märkta i grönt. Detta MMTV-PyMT, ACTB-ECFP, ACTB-H2B-EGFP djur var administered doxorubicin (8 mg / kg i 1 x PBS) ip 24 h före starten av filmen, och fick timme injektioner av 1 x PBS innehållande PI (Invitrogen, 1 mg / ml lösning utspädd 1:15). Strukturella förändringar i kärnan av cancerceller kan observeras i en apoptotisk cell bredvid celler som har genomgått nekros (PI-positiva celler som uppvisar minimala förändringar i kärn morfologi). Kärnor av apoptotiska celler blir slutligen röd på grund av upptagningen av Pl-färgning (ej visad). Antalet nekrotiska och apoptotiska händelser kvantifieras manuellt för varje tidpunkt baserad på Pl-positivitet och nukleär morfologi.
Kemoterapi-inducerad cancer celldöd resulterar ofta i en reaktiv rekrytering av immunceller till tumörer 2,4,5. Figur 4 visar ett exempel på denna stromala svaret på akut behandling med doxorubicin. MMTV-PyMT, ACTB-ECFP c-fms-EGFP djur avbildas här administrerades doxorubicin (8 mg / kg i 1 x PBS) ip ip. under den tid experimentet att visualisera celldöd. De tider som anges representerar antalet timmar efter doxorubicin, och skalan stapeln representerar 100 pm. I detta experiment, myeloidceller infiltrera områden celldöd, såsom indikeras av de vita pilarna. För att kvantifiera myeloid cellinfiltration i tumörer efter doxorubicin administration, samma typ av analys som används för att bestämma läkemedelsdistribution och tumör svar på kemoterapi används, där den kvantitativa produktionen är procent yta per total tumör område som är positivt för EGFP.
Förutom att visualisera den övergripande stromal svar på kemoterapi, kan specialiserade stromala svar också visualiseras 5. Film 4 visar fagocytos av nekrotisk cellmaterialet genom en angränsande cell. Den röda kärnämne kan ses som intas av en cell med en large intakt grönt kärna, som är typiskt för makrofager. MMTV-PyMT, ACTB-ECFP, ACTB-H2B-EGFP djur avbildas under denna session administrerades doxorubicin (8 mg / kg i 1 x PBS) IP. 24 h före starten av filmen. Djuret fick timme injektioner av 1 x PBS innehållande PI (Invitrogen, 1 mg / ml lösning utspädd 1:15). Kärnor (ACTB-EGFP märkning) visas som grönt, men blir röda som cellen genomgår nekros.
Figur 1. Prov märkning av olika tumörer komponenter med transgena och injicerbara etiketter Detta är en trippel-transgen MMTV-PyMT,. ACTB-ECFP c-fms-EGFP djur som cancerceller är märkta i blått med uttryck av ECFP och myeloida celler märks i grön genom expression av EGFP från en myeloisk-promotor. Djuret injicerades med propidiumjodid (PI, röd, ~ 0,07 mg / ml i 1 x PBS) underden avbildande sessionen att visualisera celldöd. PI etiketter DNA men endast korsar cellmembranen av döda eller döende celler. Skala bar = 100 nm.
Figur 2. Drug extravasering och distribution i tumörer Denna dubbel-transgena MMTV-PyMT,. ACTB-ECFP djur som cancerceller märks i blått genom uttryck av ECFP injicerades med FITC-konjugerad 2 MD dextran (grön) under avbildning session att visualisera hur droger når tumörer efter iv injektion (blå). Tid efter avbildning inleddes anges. Skala bar = 100 nm.
Figur 3. Cancer Cell svar på systemisk terapi. Ett MMTV-PyMT, ACTB-ECFP c-fms-EGFP djur som behandlats med kemoterapeutiskaläkemedel doxorubicin före avbildning, och injicerades med PI (röd, ~ 0,07 mg / ml i 1 x PBS) för att märka celldöd. Denna bildserie visar ackumuleringen av PI färgning över tid (som anges av vita pilar), som representerar induktion av celldöd efter doxorubicin behandling. Tid som anges är tid efter doxorubicin behandling. Bilder är maximal intensitet projektioner av en z-stack som innehåller tre bilder i z-axeln. Skala bar = 100 nm.
Figur 4. Myeloid cell svar på kemoterapi i en MMTV-PyMT, ACTB-ECFP,. C-fms-EGFP trippel transgen mus administrerad doxorubicin 20 timmar före avbildning Djuret fick timme ip. injektioner av PI (röd, ~ 0,07 mg / ml i 1 x PBS) för att märka döda celler. Denna bildserie visar ackumuleringen av EGFP-positiva myeloida celler (vilket indikeras av vita pilar) över tid efter doxorubicin behandling. Denna reaktiva immunsvar har visats hindra terapeutiska svaret på flera klasser av kemoterapi 4,5. Tid som anges är tid efter doxorubicin behandling. Bilder är maximal intensitet projektioner av en z-stack som innehåller tre bilder i z-axeln. Skala bar = 100 nm.
Film 1. . Drug delivery i en tumör Detta är en dubbel-transgen MMTV-PyMT, ACTB-ECFP djur som cancerceller märks i blått genom uttryck av ECFP. Djuret injicerades med en 2 MD FITC-konjugerat dextran (grön) under avbildning sessionen att visualisera hur läkemedel når tumörer efter iv injektion. Skala bar = 100 nm. Klicka här för att se filmen .
Film 2. Drug infiltration i tumörvävnad En trippel transgen C3 (1)-Tag,. ACTB-ECFP c-fms-EGFP djur där cancerceller är labeled i blått genom expression av ECFP och myeloida celler märkta i grönt genom expression av EGFP injicerades IV med en Alexa Fluor 647-konjugerad 10 kDa dextran (röd). Synfältet visas omedelbart efter injektion med dextran. Dextranet märker initialt vaskulaturen, snabbt extravasates i tumörvävnaden, och tas slutligen upp av makrofager. Skala bar = 100 nm. Klicka här för att se filmen .
Film 3. Avbildning av nukleära förändringar efter kemoterapi-inducerad celldöd Denna trippel transgena MMTV-PyMT,. ACTB-ECFP, H2B-EGFP djur injicerades med doxorubicin före avbildning. Nuclear morfologi (grön), som spåras av uttryck av en H2B-EGFP fusionsproteinet möjliggör direkt visualisering av kemoterapiinducerad nukleära strukturförändringar typiska för apoptos som ses för cellen i det övre högra hörnet. Djuret RecEived halv-timme ip. injektioner av PI (röd) för varaktigheten av den avbildande sessionen att märka döda och döende celler. Tid som anges är tid efter doxorubicin behandling 24 tim. Bilder förvärvades med en hög objektiv förstoring mål (40x, NA 1,1, vatten lins). Skala bar = 15 nm. Klicka här för att se filmen .
Film 4. Avbildning av kärntekniska förändringar och upptag av döda celler material efter kemoterapi-inducerad celldöd Denna trippel transgena MMTV-PyMT,. ACTB-ECFP, H2B-EGFP djur injicerades med doxorubicin före avbildning. Nukleär morfologi (grön), såsom spåras av expression av en H2B-EGFP-fusionsproteinet, medger direkt visualisering av kemoterapi-inducerade nukleära strukturförändringar. Djuret fick halv-timme ip. injektioner av PI (röd) för varaktigheten av den avbildande sessionen att märka döda och döende celler. Bilder förvärvadesmed hjälp av en hög objektiv förstoring mål (40 x, NA 1,1, vatten lins). Bristen på stora strukturella förändringar före märkning med PI och förändringen i det nukleära morfologin och förlust av GFP-signal är indikativ för nekros-liknande celldöd. Den döda materialet ses tas upp av en cell med en stor kärna, som är typiskt för makrofager. Tid som anges är tid efter doxorubicin behandling 24 tim. Skala bar = 10 nm. Klicka här för att se filmen .
Discussion
Svaren av tumörer på systemiska behandlingar in vivo kan vara dramatiskt annorlunda med de av cancerceller in vitro, eftersom mikromiljön påverkar både akuta svaret och återfall 5. Ett av de största hindren för explicating in vivo chemoresistance vägar är komplicerade samspelet mellan cancerceller och deras mikromiljö. I synnerhet, eftersom solida tumörer har utvecklat en balans mellan cancer och stromaceller, perturbationer av en komponent, såsom celldöd som sker under anti-cancerbehandling, kan resultera i dramatiska effekter på vävnad organisation.
Den intravital bildteknik som här möjliggör direkt visualisering av cancer cell-stroma interaktioner inom tumörerna hos levande, bedövade möss under behandling med anti-cancerläkemedel. Vi använder spinnskivan konfokalmikroskopi, vilket har en relativt begränsad penetrationsdjup (se 17 (t.ex. på grund av infiltration av en märkt population eller induktion av celldöd), cellmotilitet, distribution av injicerbara (t.ex. för att spåra vaskulär läckage) och co- lokalisering av fluorescerande signaler 5,12,17,20.
Vi rutinmässigt image möss för över 6 timmar och även utfört imaging i över 18 timmar. Detta kräver upprätthållande mössen kontinuerligt under anestesi för dessa långa tidsperioder. Med rätt anestesi, över 90% av våra djur överlever 6 timmar, och ca 80% överlever under 18 timmar. Detaljer om hur man utför en långsiktig anestesi har publicerats tidigare 19. Enligt vår erfarenhet fem faktorer är kritiska: undvika hypotermi, undvika uttorkning, upprätthålla fysiologiska blodet syremättnad, usjunger fuktad bärgas för isofluran, och hålla djuren på den lägsta nivån av anestesi vid vilken de inte visar tecken på smärta. För att upprätthålla kroppstemperaturen håller vi möss i en uppvärmd filt (vid 38 ° C). För att undvika uttorkning, injicera vi små volymer av saltlösning ip hela avbildning förfarande. För att bibehålla fysiologiska blodet syremättnad, börjar vi med 21% syre i bärgasen (snarare än vanliga 100%). Detta ger oss möjlighet att öka inhalerade syrenivåer om en mus - timmar i ett experiment - visar en minskning i blodet syrgasmättnad. I vår erfarenhet, öka inhalerade syrenivåer vid sådan tidpunkt (t.ex. 30-40%) nästan alltid kommer att stabilisera djuret möjliggör timmar av ytterligare avbildning. Den optimala nivån av anestesi är för de flesta möss uppnås med 1-1,5% isofluran och resulterar i andningsljud andelen 60-65/min och puls andelen 400-450/min. I våra imaging experiment använder vi främst transgen musmodells (MMTV-PyMT och C3 [1] Tag) där tumörer är multifokala, vilket möjliggör avbildning av multipla lesioner i olika stadier av tumörprogression parallellt på flera x-, y positioner under en enda avbildning session. Detta minskar oro mus-till-mus variation med avseende på experiment som syftar till att identifiera stadiet beroende terapeutiska responser, och minskar antalet djur som behövs för avbildning.
MMTV-PyMT modell (och andra spontana cancer modeller) går igenom progressiva histopatologiska steg som kan kännas igen under intravital avbildning, även om patologiska iscensättningen av tumör lesioner som kan göras under intravital avbildning skiljer sig från, och mindre detaljerad än den för histologiska snitt 5,17. Däremot transplantation modeller tenderar att återspegla sent stadium tumörer bäst, eftersom cancerceller vanligen isolerade från avancerade tumörer. Sådana modeller är därför mer mottagliga för att studera tumörer stromainteraktioner av sena stadium tumörer än skillnader i dessa interaktioner mellan olika stadier.
Vi visar exempel på hur bilden nukleära strukturella förändringar som inträffar efter celldöd inducerad av behandling. I frånvaro av anti-cancerbehandling, kan denna märkning strategi istället användas för att avbilda celldelning in situ belysa, exempelvis hur cellproliferation och dvala påverkas av mikromiljön. I framtiden kan fluorescerande märkning av mitokondriella komponenter gör det möjligt att avbilda mitokondriella förändringar som sker under apoptotisk celldöd.
I detta protokoll har vi visat också exempel på hur man kan bilden cancer cell-immunceller interaktioner efter terapi, men andra microenvironmental komponenter kan också visualiseras och avbildas. Befintliga transgena reporter linjer för stromala komponenter innefattar de för fibroblaster (t.ex.., FSP1-EGFP 17, αSMA-RFP 21, COL1A1-EGFP 21) eller celler i vaskulaturen (t.ex. Tie2-GFP 22, VEGF-GFP 23).
Intravital avbildning möjliggör realtid visualisering av interaktioner och processer som sker in vivo efter administrering av kemoterapi. Med den teknik som för närvarande finns tillgängliga, har vi gjort stora framsteg i att förstå hur myeloida celler påverkar terapeutiskt svar, men eftersom tumören mikromiljön är så komplex, är stora framsteg fortfarande behövs för att börja gräva mekanistiskt in i processer som ligger bakom miljö-medierad resistens. En av de viktigaste framstegen fortfarande krävs är att identifiera bättre markörer för specifika cellpopulationer. Vikten av bättre markörer är väl illustreras med två av de mest framstående stromacellinjer komponenter i brösttumör mikromiljön, fibroblaster och immunceller. α-glattmuskelaktin (αSMA) används ofta för att identifierafibroblaster, men proteinet uttrycks också av vaskulära glatta muskelceller och myoepithelial celler 24. Även om αSMA-GFP reporter möss finns bestämma den specifika celltypen som en följd av under ett intravital avbildning experiment är utmanande. På samma sätt kommer en enda fluorescerande markör såsom EGFP uttryckt under c-fms-promotorn identifiera ofta flera subpopulationer av immunceller 12,17. Även om man skulle helst vilja använda en enda markör för att identifiera en specifik celltyp komplexiteten i den underliggande biologin är en stor utmaning i att använda denna metod.
En partiell lösning på detta problem är att använda injicerbara etiketter för att ytterligare differentiera subpopulationer av celler som uttrycker samma fluorescerande reporter. Exempelvis fluorescerande dextraner tas upp av makrofager och kan användas för att märka de makrofag subpopulationer som är märkta av c-fms-EGFP och Fsp1-EGFP transgena möss reporter
Till skillnad från tumör svarskurvor genereras av bromsok mätning, som ger lite mekanistisk information om hur eller varför tumörer svarar på den administrerade terapeutiska eller histologisk serier härrör från vävnader skördats vid olika tidpunkter som kräver stora kohorter av djur, ger vår teknik direkt, kvantifierbar information på dynamiken i celldöd och på växelverkan av stromala celler med cancerceller i små kohorter. Således är fördelen med att använda det förfarande som rapporterats här att det ger dynamisk information om läkemedels svar i samband med en intakt tumör mikromiljö i realtid. Sådan information kan leda till viktiga insikter i de underliggande processer som driver terapeutiska svar 5 </ Sup>.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att lämna ut. Samtliga djurförsök har utförts i enlighet med IACUC godkända protokoll.
Acknowledgments
Vi tackar J. Cappellani och J. Qiu för teknisk support. Detta arbete stöddes av medel från National Cancer Institute (U01 CA141451), den Starr Cancer Consortium, Susan G. Komen för Cure, Long Island 2 dag promenad för att bekämpa bröstcancer, Manhasset Kvinnors Coalition Against Breast Cancer för mig, och en doktorander stipendium från congressionally Riktad Breast Cancer Research Program, är USA till ESNESN även mottagaren av Leslie C Snabb och William Randolph Hearst Foundation Fellowships från Watson School of Biological Sciences. HAA stöddes av medel från Norges forskningsråd (160698/V40 och 151.882), och sydöstra regionala hälsovårdsmyndigheter (2.007.060).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| MMTV-PyMT mice | Jackson Laboratory | 2374 | |
| C3(1)-Tag mice | Jackson Laboratory | 13591 | |
| ACTB-ECFP mice | Jackson Laboratory | 3773 | |
| ACTB-H2B-EGFP mice | Jackson Laboratory | 5418 | |
| 1 x PBS | Made in-house | ||
| 2 MD Dextran, Fluorescein-conjugated | Invitrogen | D-7137 | Reconstitute in dH2O (4 mg/mL, store at -20 °C); dilute to 1 mg/ml in 1 x PBS |
| 10 kD Dextran, Alexa Fluor 647-conjugated | Invitrogen | D-22914 | Reconstitute in dH2O (4 mg/mL, store at -20 °C); dilute to 1 mg/ml in 1 x PBS |
| Doxorubicin hydrochloride | Sigma-Aldrich | 44583 | Reconstitute in dH2O and store at 4 °C; dilute in 1 x PBS |
| Isothesia (Isoflurane) | Butler Animal Health Supply | 029450 | 250 ml |
| Propidium iodide | Invitrogen | P3566 | 1 mg/ml; dilute 1:15 in 1 x PBS |
| Nitrogen | |||
| Oxygen | |||
| Equipment | |||
| 18G x 1½" regular bevel needle | BD | 305196 | |
| μManager | Vale Lab, UCSF | www.micro-manager.org | Open-source software |
| Alcohol swab | BD | 326895 | 70% isopropyl alcohol swabs |
| Anesthesia system | Molecular Imaging Products, Co. | ||
| Cover glass | Corning | 2940-245 | No. 1½, 24x50 mm; disinfect with 70% isopropanol wipes |
| Curity gauze sponges (sterile) | Kendall | 6939 | |
| Glass microscope slides | Corning | 2948-75x25 | Pre-cleaned; if not pre-cleaned, disinfect with 70% isopropanol wipes |
| Hardened fine scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | 2 pairs; stainless steel, sharp-sharp tips, straight tip, 26 mm cutting edge, 11 cm length |
| Heated blanket | Gaymar Industries | ||
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | Turn on approximately 30 min before use; sterilize tools at >200 °C for 30 sec |
| Imaris | Bitplane | www.bitplane.com | |
| Krazy Glue | Elmer’s Products | KG484 | |
| Laboratory tape ( ½") | |||
| Laboratory tape (1") | |||
| Lid to a Styrofoam shipping cooler | This will be used as the surgical platform | ||
| Micro dissecting forceps | Roboz | RS-5153 | 1x2 teeth, slight curve, 0.8 mm tip width, 4" length |
| Micro dissecting forceps | Roboz | RS-5135 | Serrated, slight curve, 0.8 mm tip width; 4" length |
| Microscope | Spinning-disk confocal, XYZ Piezo stage, epifluourescence capablility17,25 | ||
| Microscope stage insert | Applied Scientific Instrumentation | Custom fabricated, with two circular imaging ports | |
| MouseOx oximeter, software, and sensors | STARR Life Sciences | www.starrlifesciences.com | |
| Nalgene Super Versi-Dry lab soakers | Thermo Scientific | 74218-00 | Cut into fourths for lining surgical platform |
| Nebulizer | Salter Labs | 8901 | Used to humidify gases; prevents irritation of lung tissues |
| Slip-tip disposable tuberculin syringe (1 ml) | BD | 309659 | |
| Surflo winged infusion set | Terumo | SV-23BLK | 23G x ¾" ultra thin needle, 12" tubing |
| Betadine Spray | Purdue Pharma | BASP3H | |
References
- Egeblad, M., Nakasone, E. S., Werb, Z. Tumors as organs: complex tissues that interface with the entire organism. Dev. Cell. 18, 884-901 (2010).
- Ahn, G. -O., Tseng, D., Liao, C. -H., Dorie, M. J., Czechowicz, A., Brown, J. M. Inhibition of Mac-1 (CD11b/CD18) enhances tumor response to radiation by reducing myeloid cell recruitment. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 8363-8368 (2010).
- Tlsty, T. D., Coussens, L. M. Tumor stroma and regulation of cancer development. Annu. Rev. Pathol. 1, 119-150 (2006).
- DeNardo, D. G., Brennan, D. J., et al. Leukocyte complexity predicts breast cancer survival and functionally regulates response to chemotherapy. Cancer Discov. 1, 54-67 (2011).
- Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., et al. Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance. Cancer Cell. 21, 488-503 (2012).
- Kim, J. B., Stein, R., O'Hare, M. J. Three-dimensional in vitro tissue culture models of breast cancer-- a review. Breast Cancer Res. Treat. 85, 281-291 (2004).
- Gilbert, L. A., Hemann, M. T. DNA damage-mediated induction of a chemoresistant niche. Cell. 143, 355-366 (2010).
- Pittet, M. J., Weissleder, R. Intravital imaging. Cell. 147, 983-991 (2011).
- Lohela, M., Werb, Z. Intravital imaging of stromal cell dynamics in tumors. Curr. Opin. Genet. Dev. 20, 72-78 (2010).
- Boissonnas, A., Fetler, L., Zeelenberg, I. S., Hugues, S., Amigorena, S. In vivo imaging of cytotoxic T cell infiltration and elimination of a solid tumor. J. Exp. Med. 204, 345-356 (2007).
- Breart, B., Lemaître, F., Celli, S., Bousso, P. Two-photon imaging of intratumoral CD8+ T cell cytotoxic activity during adoptive T cell therapy in mice. J. Clin. Invest. 118, 1390-1397 (2008).
- Engelhardt, J. J., Boldajipour, B. Marginating dendritic cells of the tumor microenvironment cross-present tumor antigens and stably engage tumor-specific T cells. Cancer Cell. 21, 402-417 (2012).
- Brown, E., McKee, T., et al. Dynamic imaging of collagen and its modulation in tumors in vivo using second-harmonic generation. Nat. Med. 9, 796-800 (2003).
- Wyckoff, J. B., Wang, Y., et al. Direct visualization of macrophage-assisted tumor cell intravasation in mammary tumors. Cancer Res. 67, 2649-2656 (2007).
- Yuan, F., Salehi, H. A., Boucher, Y., Vasthare, U. S., Tuma, R. F., Jain, R. K. Vascular permeability and microcirculation of gliomas and mammary carcinomas transplanted in rat and mouse cranial windows. Cancer Res. 54, 4564-4568 (1994).
- Jain, R. K., Munn, L. L., Fukumura, D. Dissecting tumour pathophysiology using intravital microscopy. Nat. Rev. Cancer. 2, 266-276 (2002).
- Egeblad, M., Ewald, A. J., et al. Visualizing stromal cell dynamics in different tumor microenvironments by spinning disk confocal microscopy. Dis Model Mech. 1, 155-167 (2008).
- Cheng, N., Lambert, D. L. Mammary Transplantation of Stromal Cells and Carcinoma Cells in C57BL/6J. Mice. J. Vis. Exp. (54), ee2716 (2011).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harb. Protoc. 2011, pdb.prot5563 (2011).
- Sounni, N. E., Dehne, K., et al. Stromal regulation of vessel stability by MMP14 and TGFbeta. Dis. Model Mech. 3, 317-332 (2010).
- Magness, S. T., Bataller, R., Yang, L., Brenner, D. A. A dual reporter gene transgenic mouse demonstrates heterogeneity in hepatic fibrogenic cell populations. Hepatology. 40, 1151-1159 (2004).
- Motoike, T., Loughna, S., et al. Universal GFP reporter for the study of vascular development. Genesis. 28, 75-81 (2000).
- Fukumura, D., Xavier, R., et al. Tumor induction of VEGF promoter activity in stromal cells. Cell. 94, 715-725 (1998).
- Sugimoto, H., Mundel, T. M., Kieran, M. W., Kalluri, R. Identification of fibroblast heterogeneity in the tumor microenvironment. Cancer Biol. Ther. 5, 1640-1646 (2006).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Dynamic, long-term in vivo imaging of tumor-stroma interactions in mouse models of breast cancer using spinning-disk confocal microscopy. Cold Spring Harb. Protoc. 2011, pdb.top97 (2011).
