אנו מציגים פרוטוקול להקפאה וcryosectioning קהילות שמרים להתבונן דפוסים הפנימיים של תאי ניאון. השיטה מסתמכת על מתנול, תיקון ואוקטובר הטבעה-לשמר את הפיזור המרחבי של תאים ללא inactivating חלבוני ניאון בתוך קהילה.
Abstract
חיידקים בדרך כלל לגור ביישובים. הארגון המרחבי של תאים בתוך קהילה הוא האמין כדי להשפיע על ההישרדות והתפקוד של הקהילה 1. שיטות אופטיות, כולל חתך מיקרוסקופיה confocal ושני פוטונים, הוכיחו שימושיות להתבוננות ארגון המרחבי של קהילות חיידקים וarchaeal 2,3. שילוב של הדמית confocal וחתך פיזי של מושבות שמרים חשף ארגון הפנימי של תאים 4. עם זאת, חתך אופטי ישיר באמצעות מיקרוסקופיה confocal או שני פוטונים הצליח רק להגיע לכמה שכבות תאים עמוקים לתוך מושבות שמרים. מגבלה זו עשויה בגלל פיזור אור חזק מתאי שמרים 4.
כאן, אנו מציגים שיטה המבוססת על התיקון וcryosectioning להשיג פיזור המרחבי של תאי ניאון בתוך קהילות cerevisiae Saccharomyces. אנו משתמשים במתנול כסוכן מקבעכדי לשמר את הפריסה המרחבית של תאים. קהילות קבועות הם הסתננו עם מתחם אוקטובר, קפוא, וcryosectioned בcryostat. דימות פלואורסצנטי מהסעיפים חושפת את הארגון הפנימי של תאי ניאון בקהילה.
דוגמאות לקהילות שמרים הכוללות זנים המבטאים חלבוני ניאון אדומים וירוקים מדגימות את הפוטנציאל של שיטת cryosectioning כדי לחשוף את הפיזור המרחבי של תאי ניאון כמו גם זה של ביטוי גנים במושבות שמרים 2,3. למרות ההתמקדות שלנו הייתה בקהילות cerevisiae Saccharomyces, באותה השיטה יכולה באופן פוטנציאלי להיות מיושמת לבחון קהילות חיידקים אחרות.
Protocol
1. תיקון קהילות שמרים לגדול קהילות שמרים על קרום מסנן (למשל, Millipore MF קרום מסנן; 2A איור). פרוטוקול זה מתאים לקהילה טיפוסית של פחות מ 2×10 8 תאים במסנן 6 מ"מ בקוטר הממברנה. השתמ?…
Representative Results
תמונות פלואורסצנציה של חתכים אנכיים של קהילות שמרים המכילות אוכלוסיות לאדומות וירוק מתויגות תחרותיות 6 מוצגות באיור 3. קהילות אלה מורכבות משני זני prototrophic של שמרים והתחרות שלהם למשאבים משותפים, כולל שטח, מובילות לעמודי 7 דפוסים, כפי שהיא מוצגות בח…
Discussion
ההליך שהוצג כאן מציע דרך כדי להתבונן במבנה הפנימי של קהילות שמרים. צעד קיבוע מתנול הופך את מושבת השמרים נוקשה 8 ושומר על שלמותה של המושבה, ואולם, הוא גם גורם להתכווצות 8 שצריכים להילקח בחשבון בלפרש את התוצאות. אנחנו בדרך כלל רואים סביב 30% התכווצות בגובה של מ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו רוצים להודות ליונתן קופר מעבדה בפרד האצ'ינסון לחקר הסרטן לרשות להשתמש cryostat. עבודה זו נתמכה על ידי NIH וקק WM קרן. BM הוא עמית גורדון ובטי מור של קרן לחקר מדעי חיים. אנו מודים לדניאל Gottschling הפרוטוקול לשיתוף קיבועו איתנו.