Summary
우리는 형광 세포의 내부 패턴을 관찰 할 효모 커뮤니티를 동결 cryosectioning을위한 프로토콜을 제시한다. 방법은 메탄올 - 고정에 의존하고 지역 사회 내에서 형광 단백질의 운영을 중지시키지 않고 세포의 공간 분포를 유지하기 위해 월 퍼가기.
Abstract
미생물은 일반적으로 지역 사회에 살고 있습니다. 지역 사회 내에서 세포의 공간적 조직은 지역 사회 (1)의 생존과 기능에 영향을 미칠 것으로되어 있습니다. 공 촛점과 두 광자 현미경 등의 광학 sectioning 기술, 박테리아 및 archaeal 지역 사회 2,3의 공간 조직을 관찰하는 데 유용 입증했습니다. 공 촛점 이미징 및 효모 식민지의 물리적 sectioning의 조합이 세포 4의 내부 조직을 밝혔다. 그러나, 공 촛점 또는 두 광자 현미경을 사용하여 직접 광학 sectioning는 효모 식민지에 깊은 몇 가지 세포 레이어에 도달 할 만 수있었습니다. 이 제한 때문에 효모 세포 4 빛의 강력한 분산의 가능성이 높습니다.
여기, 우리는 고정와 Saccharomyces cerevisiae의 지역 사회 내에서 형광 세포의 공간적 분포를 얻기 위해 cryosectioning에 따라 방법을 제시한다. 우리는 정착액 에이전트로 메탄올을 사용하여세포의 공간적 분포를 유지합니다. 고정 사회는 그라 이오 스탯에 10월 화합물, 냉동 및 cryosectioned으로 침투하고 있습니다. 섹션의 형광 이미징은 지역 사회의 형광 세포의 내부 조직을 드러내고있다.
빨간색과 녹색 형광 단백질을 표현 변종으로 구성된 효모 지역 사회의 예로는뿐만 아니라 효모 식민지 2,3에서 유전자 발현의 같은 형광 세포의 공간 분포를 표시하는 방법 cryosectioning 방법의 가능성을 보여줍니다. 우리의 초점을 Saccharomyces cerevisiae의 지역 사회에있다하더라도, 같은 방법은 잠재적으로 다른 미생물 커뮤니티를 검사하기 위해 적용 할 수 있습니다.
Protocol
1. 효모 커뮤니티 해결
- 막 필터 (, 그림 2A 예를 들어, Millipore MF 막 필터)에 효모 커뮤니티를 성장. 이 프로토콜은 6mm 지름의 멤브레인 필터에 미만 2x10 8 셀의 전형적인 지역 사회에 해당합니다.
- 잘 1cm 지름 (그림 2B)의 하단을 충당하기 위해 워트 먼지 541 필터 종이를 사용합니다. 이 워트 먼지 용지는 나중에 단계에서 지역 사회를 전송하는 캐리어로 사용됩니다. 잘에 1 ML 100 % 메탄올을 추가하고 평형을 할 수있는 온도 -20에서 잘 ° C 둡니다.
- dewar의 액체 N 2 놔. 액체에 적어도 15 초 동안 지역 사회를 찍어 N 2 트위터 (그림 2C)를 사용하여 액체 질소에 지역 사회를 멈춰 봐.
- -20 ° C의 메탄올 (그림 2D)의 우물 냉동 사회를 전송합니다. 메탄올에 잠수 할 때 지역 사회가 수평 유지되어 있는지 확인합니다.20 분 동안 기다리십시오. MF 막 필터는 메탄올에서 분해하기 시작합니다.
- 잘 메탄올의 증발 (그림 2E)에 -20 ° C에서 보관 감기에 페트리 접시에 메탄올의 커뮤니티 캐리어를 사용하여 워트 먼지 541 필터 종이를 전송합니다. 전송하면, 캐리어 워트 먼지 필터의 상단에있는 지역 사회를 유지하고 추위를 페트리 접시에 올려 놓기 전에 두꺼운 워트 먼지 용지의 다른 부분을 사용하여 메탄올의 추가 하락을 멀리립니다. 이 증발 시간이 샘플에서 샘플에 일관성이 있는지 확인합니다.
- 캐리어 워트 먼지 필터가 건조해질 때까지 증발하는 데 4 ~ 6 시간 정도 기다립니다. 부족 증발 sectioning을 방해 잔류 메탄올을 남긴다. 지역 사회에 원인의 균열과 변형을 걸쳐 건조.
- -20 ° C의 냉동고의 샘플을보세요. 커뮤니티에 포함되지 워트 먼지 541 필터 종이를 멀리 자른다.
- 샘플은 적어도 ~ 2mm 여백에서이되도록 충분히 큰 사각형 입방 알루미늄 호일 컨테이너를 확인각면 (그림 2F). 알루미늄 호일 컨테이너의 바닥 표면에 커뮤니티를 놓고, 즉시 3 10월와 샘플 ~ 지역 사회의 높이 위의 4mm을 다룹니다. 중요한 경우, 샘플의 방향은 컨테이너의 측면과 관련하여이 단계에서 조정할 수 있습니다. 10 분 기다립니다.
- 고정하는 드라이 아이스에 금속 접시에 월 임베디드 샘플을 놓습니다. -20 ° C 또는 -80 ° C의 냉동고에서 냉동 커뮤니티를 저장합니다.
2. 형광 이미징을위한 냉동 커뮤니티 Sectioning
- -25 ° C에 cryosection 챔버의 온도를 설정하고 그 온도가 챔버의 온도를 도달 할 때까지 챔버에서 샘플을 둡니다.
- 마운트에 10월 한 방울를 적용한 후에 cryo-마운트에 샘플을 탑재합니다. 10월 두께 2-3 MM이야 수 있도록 노출 워트 먼지 필터 종이 (컨테이너의 하단)와 시료의 측면에 균일하게 10월을 알리십시오. SE 전에 그라 이오 스탯 챔버 내부 10월 동결하자ctioning. 샘플의 모든 측면에 2~3밀리미터의 10월 마진을 보장하는 것은 섹션의 무결성을 유지하는 데 도움이됩니다.
- 10월 샘플 블록의 측면은 샘플을 정렬하는 데 사용할 수 있습니다. 샘플이 블레이드에 대해 정렬되지 않은 경우 sectioning은 샘플의 구석 또는 측면에서 시작됩니다. 블레이드는 샘플 블록의 완벽한 수직 (또는 수평)의 얼굴을 잘라 수 있도록 마운트를 조정합니다.
- 효모 지역 사회를위한 일반적인 섹션 ~ 14 μm 두께입니다. 섹션을 절단 한 후, 천천히 컷 섹션으로 슬라이드를 접근하여 섹션을 수집 실온에서 보관 현미경 슬라이드를 사용합니다. 섹션은 녹기과 현미경 슬라이드에 전송합니다. 18 섹션으로 하나의 슬라이드에 전송 할 수 있습니다.
- 바람직하게는 -20 차가운 온도, ° C, 이미징 전에에서 슬라이드를 저장합니다. 4 ° C.에 1 주일 동안 보관했을 때 신호의 손실을 최소화합니다 최대 형광 신호를 들어, 영상은 바람직 sectioning 후 즉시 이루어집니다.
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Representative Results
붉은 색과 녹색으로 태그 경쟁력 인구에게 6를 포함하는 효모 지역 사회의 수직 교차 부분의 형광 이미지는 그림 3에 표시됩니다. 이러한 커뮤니티, 효모 및 공간 등의 공유 자원, 대한 경쟁의 두 prototrophic의 변종으로 구성되어 그들의 수직 교차 섹션에 표시 주상 패턴 7로 연결됩니다. 단일 셀 해상도 아래는 크로스 섹션에서 해결 할 수 있습니다. 그림 3은 그림 1의 프로토콜 다음과 같은 (아래)와 (위) 메탄올 - 고정하지 않고 얻은 복제 사회의 크로스 섹션을 비교합니다. 고정하지 않고 효모 커뮤니티를 cryosectioning를 들어, 프로토콜은 단계 1.8부터 시작을합니다. 형광 신호는 수정하지 않고 지역 사회의 섹션에 보존되어 있지만, 지역 사회의 무결성이 손상됩니다. 결과 : (1) 일부 셀 부분의 가장자리 주위에 거리에 떠 있으며, (2) 전체 순연령 (즉, 섹션의 일부 sectioning 절차의 유물에 의해 어리둥절)은 고정 된 사회에 비해 낮습니다.
도 4는 효모 지역 사회의 대표 밝은 분야와 형광 수직 교차 섹션을 보여줍니다. 지역 사회 양식 밝은 분야와 밝은 형광의 강력한 분산을 특징으로 다른 세포와 구별 표시 왕관의 꼭대기에서 셀. 이러한 패턴은 효모 식민지 4 차별화의보고 패턴과 일치합니다.
그림 1.과 (왼쪽)와 (오른쪽) 고정하지 않고 효모 커뮤니티를 cryosectioning위한 일반적인 절차의 흐름도.
그림 2.
담당자의 수직 단면의 그림 3. 대표 형광 이미지없이 (상단) 및 (아래) 메탄올 - 고정으로 표시됩니다 동일한 조건 하에서 성장 효모 커뮤니티를 licate. 커뮤니티 mCherry과 yEGFP 형광 단백질 7 태그 S. cerevisiae의 두 prototrophic의 변종으로 구성되어 있습니다. 고정하지 않으면 전지가 함께 구속되지 않고 sectioning 동안 멀리 떠 나 다시 정렬 할 수 있습니다. 메탄올 - 고정 함께 지역 사회의 세포를 유지하지만, 지역 사회 차원 (% 평균)의 차이에서 관찰로 수축이 발생합니다.
그림 4. 대표 밝은 분야 (위)과 효모 지역 사회의 수직 단면의 형광 (아래) 이미지가 표시됩니다. 커뮤니티 dsRed와 YFP 형광 단백질 7 태그 S. cerevisiae의 두 prototrophic의 변종으로 구성되어 있습니다.
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Discussion
여기에 제시된 절차는 효모 지역 사회의 내부 구조를 검사 할 수있는 방법을 제공합니다. 메탄올 고정 단계 8 효모 식민지는 융통성하게하고 식민지의 무결성을 유지하지만, 또한 그 결과를 해석에 고려되어야 수축 8됩니다. 우리는 일반적으로 직접 구를 해결하지 않고 10월에 포함 된 식민지에 비해 효모 식민지의 높이에서 30 %의 수축을 참조하십시오.
수축을 방지하기 위해 cryosectioning에 대한 대안 접근 방식은 직접 10월에있는 커뮤니티를 포함하고이를 고정하는 것입니다. 형광은 직접 삽입에 따라 방법으로 보존하지만, 단점은 각 섹션 내에서 세포를 함께 구속하지 않는입니다. 그 결과, 거리에 섹션 부동, 그리고 섹션의 가장자리에있는 세포의 일부가 sectioning 과정에서 장애 (그림 4) 고통 가능성이 더 높습니다. 그는에 초점을 맞춘 아니지만다시, 효모 지역 사회의 크로스 섹션의 밝은 분야 이미지는 우리에게 지역 사회 구 내에서 세포의 상태에 대한 유용한 정보를 제공 할 수 있습니다. 관심의 재산이 고정 단계의 영향을인지 아닌지는 사안별로 심사해야합니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
Acknowledgments
우리는 그라 이오 스탯을 사용하는 권한에 대해 프레드 허친슨 암 연구 센터의 조나단 쿠퍼 연구소 감사드립니다. 이 작품은 NIH와 WM 중사 님 재단에 의해 지원되었다. BM은 생명 과학 연구 재단의 고든 무어와 베티의 동료입니다. 우리는 우리와의 고정 프로토콜을 공유 다니엘 Gottschling에 감사하고 있습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100% Methanol | J.T. Baker | 9070-01 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Andwin Scientific | 4583 | |
| Whatman Grade No. 541 Quantitative Filter Paper | Whatman | 1541-047 | |
| Millipore-MF Membrane Filter | Millipore | HAWP04700 | |
| Cryostat | Leica | CM 1510 S |
References
- Tolker-Nielsen, T., Molin, S. Spatial Organization of Microbial Biofilm Communities. Microbial Ecology. 40 (2), 75-84 (2000).
- Moller, S., et al. In Situ Gene Expression in Mixed-Culture Biofilms: Evidence of Metabolic Interactions between Community Members. Appl. Environ. Microbiol. 64 (2), 721-732 (1998).
- Lepp, P. W., et al. Methanogenic Archaea and human periodontal disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (16), 6176-6181 (2004).
- Váchová, L., et al. Architecture of developing multicellular yeast colony: spatio-temporal expression of Ato1p ammonium exporter. Environmental Microbiology. 11 (7), 1866-1877 (2009).
- Mináriková, L., et al. Differentiated Gene Expression in Cells within Yeast Colonies. Experimental Cell Research. 271 (2), 296-304 (2001).
- Shou, W., et al. Synthetic cooperation in engineered yeast populations. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 1877-1882 (2007).
- Momeni, B., et al. Cooperation generates a unique spatial signature in microbial communities. , Submitted (2012).
- Kiernan, J. Histological and Histochemical Methods: Theory and Practice. ed, , 4th, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 4 (2008).
- Piccirillo, S., et al. The Rim101p/PacC Pathway and Alkaline pH Regulate Pattern Formation in Yeast Colonies. Genetics. 184 (3), 707-716 (2010).
