Summary
نقدم بروتوكول للتجميد وcryosectioning المجتمعات الخميرة لمراقبة أنماط من الخلايا الداخلية الفلورسنت. وتعتمد الطريقة على التلاعب في نتائج الميثانول وOCT-تضمين الحفاظ على التوزيع المكاني للخلايا دون تعطيل البروتينات الفلورية داخل مجتمع ما.
Abstract
الميكروبات تعيش عادة في المجتمعات المحلية. ويعتقد أن التنظيم المكاني للخلايا داخل المجتمع للتأثير على بقاء وظيفة من وظائف المجتمع 1. وقد أثبتت التقنيات البصرية تقطيع، بما في ذلك الفحص المجهري متحد البؤر واثنين من الفوتون، مفيدة لمراقبة التنظيم المكاني للمجتمعات البكتيرية وarchaeal 2،3. وقد كشفت مجموعة من مبائر التصوير وباجتزاء المادية للمستعمرات الخميرة التنظيم الداخلي للخلايا 4. ومع ذلك، فقد كان باجتزاء البصرية باستخدام المجهر متحد البؤر مباشرة أو اثنين الفوتون-فقط قادرة على الوصول إلى طبقات الخلايا قليلة في عمق المستعمرات الخميرة. هذا القيد هو المرجح بسبب تشتت الضوء القوي من خلايا الخميرة 4.
هنا، نقدم طريقة يعتمد على تحديد وcryosectioning للحصول على التوزيع المكاني للخلايا الفلورسنت داخل المجتمعات خميرة الخباز. نستخدم الميثانول وكيلا مثبتللحفاظ على التوزيع المكاني للخلايا. تنقل خلالها المجتمعات الثابتة مع مجمع OCT، المجمدة، وcryosectioned في ناظم البرد. التصوير مضان من الأقسام يكشف عن التنظيم الداخلي للخلايا الفلورسنت داخل المجتمع.
أمثلة من المجتمعات تتكون من سلالات الخميرة التعبير عن البروتينات الفلورية الخضراء والحمراء تظهر إمكانات الأسلوب cryosectioning للكشف عن التوزيع المكاني للخلايا الفلورسنت وكذلك في التعبير الجيني داخل مستعمرات الخميرة 2،3. على الرغم من تركيزنا كان على المجتمعات خميرة الخباز، ويمكن يحتمل نفس الأسلوب يمكن تطبيقها على دراسة المجتمعات الميكروبية الأخرى.
Protocol
1. تصحيح المجتمعات الخميرة
- تنمية المجتمعات المحلية على الخميرة من غشاء (مثل ميليبور MF غشاء التصفية؛ 2A الشكل). هذا البروتوكول يتوافق مع المجتمع نموذجية من أقل من 8 خلايا 2X10 على فلتر غشاء 6 ملم القطر.
- استخدام قطعة من الورق 541 WHATMAN مرشح لتغطية الجزء السفلي من وقطره 1 سم جيدا (الشكل 2B). وسوف تستخدم هذه الورقة WHATMAN باعتبارها الناقل لنقل المجتمع في مراحل لاحقة. إضافة 1 مل الميثانول بنسبة 100٪ إلى البئر، وترك البئر في -20 درجة مئوية لدرجة الحرارة للتوازن.
- وضع السائل N 2 في ديوار. تجميد المجتمع في النيتروجين السائل عن طريق غمس المجتمع لما لا يقل عن 15 ثانية في السائل N 2 باستخدام منتاش (الشكل 2C).
- نقل المجتمع المجمدة إلى البئر من الميثانول ° -20 درجة (الشكل 2D). ضمان أن يتم الاحتفاظ المجتمع الأفقي عندما غمر في الميثانول.انتظر 20 دقيقة. غشاء MF تصفية يبدأ في التفكك في الميثانول.
- نقل المجتمع باستخدام الناقل WHATMAN 541 ورق الترشيح من الميثانول إلى جانب طبق بيتري الباردة أبقى في -20 درجة مئوية لمدة تبخر الميثانول (2E الشكل). عند نقل، والحفاظ على المجتمع على رأس الناقل WHATMAN تصفية واستخلاص قطرات بعيدا إضافية من الميثانول باستخدام قطعة أخرى من الورق السميك WHATMAN قبل وضع في طبق بتري الباردة. وسوف يضمن هذا الوقت من التبخر يتسق عينة لعينة.
- الانتظار 4-6 ساعة حتى لتبخر الناقل WHATMAN مرشح تبدو جافة. تبخر الميثانول المتبقية غير كافية يترك التي تتعارض مع تقطيع. الإفراط في تجفيف أسباب الشقوق وتشوه في المجتمعات المحلية.
- تأخذ عينة من الفريزر -20 درجة مئوية. قطع بعيدا WHATMAN 541 رقة الترشيح التي لا تغطيها المجتمع.
- جعل مستطيل مكعب الألومنيوم احباط الحاويات التي هي كبيرة بما يكفي بحيث العينة على الأقل ~ هامش مم 2 منكل جانب (الشكل 2F). وضع المجتمع على السطح السفلي من الألومنيوم احباط الحاويات؛ تغطية مباشرة مع عينة أكتوبر إلى 3 ~ 4 مم فوق ارتفاع المجتمع. إذا هامة، ويمكن تعديل اتجاه العينة في هذه الخطوة فيما يتعلق الجانبين من الحاوية. انتظر 10 دقيقة.
- ضع عينة OCT-جزءا لا يتجزأ من على لوحة معدنية على الثلج الجاف لتجميد. تخزين المجتمعات المجمدة في -20 -80 ° C أو C ° الثلاجة.
2. باجتزاء المجتمعات مجمدة لتصوير الإسفار
- تعيين درجة حرارة الغرفة لC ° cryosection -25 و ترك العينات في غرفة درجة الحرارة حتى تصل إلى درجة حرارة الغرفة.
- تحميل عينة الصعود إلى جبل البرد بعد تطبيق قطرة من أكتوبر على الجبل. انتشرت بشكل موحد أكتوبر على جانب عينة مع تعرض رقة الترشيح WHATMAN (قاع الإناء) بحيث أكتوبر سمك 2-3 مم. اسمحوا أكتوبر تجميد داخل غرفة ناظم البرد قبل SEctioning. ضمان هامش أكتوبر من 2-3 مم من كل جانب من العينة يساعد على الحفاظ على سلامة أقسام.
- ويمكن استخدام الجانبين من كتلة عينة أكتوبر لمحاذاة العينة. إذا لم يتم محاذاة العينة فيما يتعلق شفرة، سوف تبدأ تقطيع من ركلة ركنية أو الجانب من العينة. ضبط جبل لضمان أن نصل يقطع رأسي تماما (أو الأفقي) مواجهة كتلة العينة.
- أقسام نموذجية للمجتمعات الخميرة هي ~ 14 ميكرون سميكة. بعد قطع مقطع، استخدام شريحة المجهر الاحتفاظ بها في درجة حرارة الغرفة لجمع هذا الباب، من خلال تناوله ببطء الشريحة إلى قسم قطع. سوف تذوب القسم ونقل إلى الشريحة المجهر. يمكن نقل ما يصل إلى 18 أقسام على شريحة واحدة.
- تخزين الشرائح في درجات الحرارة الباردة، ويفضل -20 ° C، قبل التصوير. فقدان الإشارة هو الحد الأدنى عند الاحتفاظ بها لمدة أسبوع واحد في C. ° 4 للإشارة مضان أقصى، ويتم ذلك يفضل التصوير على الفور بعد تقطيع.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وتظهر الصور مضان من المقاطع العرضية الرأسية للمجتمعات التي تحتوي على الخميرة الحمراء السكان تنافسية والأخضر الموسومة-6 في الشكل 3. هذه المجتمعات تتكون من سلالات بدئية اثنين من الخميرة والمنافسة على الموارد المشتركة، بما في ذلك الفضاء، إلى أنماط عمودية 7، كما تم عرضه في عمودي على المقاطع العرضية. يمكن حل القرارات وصولا الى خلية واحدة في المقاطع العرضية. الشكل 3 مقارنة المقاطع العرضية للمجتمعات تكرار الحصول عليها مع (القاع) وبدون (أعلى) التلاعب في نتائج الميثانول، وبعد البروتوكولات في الشكل 1. لcryosectioning المجتمعات الخميرة دون تحديد، ويتبع البروتوكول بدءا من الخطوة 1.8. يتم الاحتفاظ إشارة مضان في أقسام المجتمع دون تحديد، ولكن المساس بسلامة المجتمع. ونتيجة لذلك: (1) بعض الخلايا تطفو بعيدا حول حافة الباب، و (2) في العام ييELD (أي جزء من أجزاء لم تتأثر القطع الأثرية من الإجراء تقطيع) أقل مقارنة مع المجتمعات الثابتة.
ويبين الشكل 4 مشرق الميدان ومضان العمودي ممثل المقاطع العرضية للمجتمع الخميرة. الخلايا على أعلى النموذج المجتمع تاج الذي يظهر متميزة عن غيرها من الخلايا التي تتميز أقوى نثر في مضان مشرق الميدان وأكثر إشراقا. هذه الأنماط تتفق مع أنماط ذكرت التمايز في مستعمرات الخميرة 4.
الشكل 1. مخطط انسيابي للإجراءات نموذجية لcryosectioning المجتمعات الخميرة مع (يسار) وبدون (يمين) نتائج مباريات.
الشكل 2.
الشكل 3. الصور مضان ممثل العمودي شريحة من مندوبlicate المجتمعات الخميرة نمت في ظل ظروف مماثلة تظهر دون (أعلى) ومع (القاع) التلاعب في نتائج الميثانول. المجتمع يتكون من اثنين من سلالات بدئية خميرة S. ذات الكلمات الدلالية مع mCherry والبروتينات الفلورية yEGFP 7. دون تحديد، ليست ملزمة الخلايا معا، وربما تطفو بعيدا أو إعادة ترتيب خلال تقطيع. الميثانول في نتائج المباريات وتبقي خلايا المجتمع معا، ولكن يسبب انكماش كما لوحظ في الفرق بين مرتفعات المجتمع (متوسط٪).
الشكل 4. الممثل تظهر مشرق الميدان (أعلى) ومضان (القاع) صور العمودي شريحة من مجتمع الخميرة. المجتمع يتكون من اثنين من سلالات بدئية خميرة S. ذات الكلمات الدلالية مع البروتينات الفلورية dsRed وYFP 7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الإجراء المقدمة هنا يوفر وسيلة لتفقد البنية الداخلية للمجتمعات الخميرة. الخطوة تحديد الميثانول يجعل مستعمرة الخميرة جامدة 8 و يحافظ على سلامة المستعمرة، ومع ذلك، فإنه يتسبب أيضا 8 الانكماش التي ينبغي أن تؤخذ في الاعتبار عند تفسير النتائج. نرى عادة حوالي 30٪ انكماش في ارتفاع المستعمرات الخميرة، مقارنة المستعمرات جزءا لا يتجزأ مباشرة في أكتوبر دون تحديد 9.
لتجنب انكماش، وهو نهج بديلة لcryosectioning هو تضمين مباشرة المجتمعات المحلية في أكتوبر وتجميدها. يتم الاحتفاظ مضان في أسلوب يعتمد على تضمين المباشر، ولكن العيب هو أن ليست ملزمة الخلايا داخل كل قسم معا. ونتيجة لذلك، فإن بعض الخلايا على حواف الباب تعويم بعيدا، وأقسام هي أكثر عرضة للمعاناة اضطرابات في عملية تقطيع (الشكل 4). على الرغم من انه لا يركز علىإعادة، قد مشرق الميدان صور المقاطع العرضية للمجتمعات الخميرة تعطي لنا أيضا معلومات مفيدة عن حالة الخلايا داخل المجتمع 9. أم لا يتأثر ممتلكات الفائدة بمقدار الخطوة لابد من تحديد فحص على أساس كل حالة على حدة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نود أن نشكر جوناثان كوبر مختبر في مركز فريد هاتشينسون لأبحاث السرطان للحصول على إذن لاستخدام ناظم البرد بهم. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة ومؤسسة كيك WM. BM هو زميل غوردون مور وبيتي من علوم الحياة مؤسسة البحوث. ونحن ممتنون لGottschling دانيال لبروتوكول قسمة له تثبيت معنا.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100% Methanol | J.T. Baker | 9070-01 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Andwin Scientific | 4583 | |
| Whatman Grade No. 541 Quantitative Filter Paper | Whatman | 1541-047 | |
| Millipore-MF Membrane Filter | Millipore | HAWP04700 | |
| Cryostat | Leica | CM 1510 S |
References
- Tolker-Nielsen, T., Molin, S. Spatial Organization of Microbial Biofilm Communities. Microbial Ecology. 40 (2), 75-84 (2000).
- Moller, S., et al. In Situ Gene Expression in Mixed-Culture Biofilms: Evidence of Metabolic Interactions between Community Members. Appl. Environ. Microbiol. 64 (2), 721-732 (1998).
- Lepp, P. W., et al. Methanogenic Archaea and human periodontal disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (16), 6176-6181 (2004).
- Váchová, L., et al. Architecture of developing multicellular yeast colony: spatio-temporal expression of Ato1p ammonium exporter. Environmental Microbiology. 11 (7), 1866-1877 (2009).
- Mináriková, L., et al. Differentiated Gene Expression in Cells within Yeast Colonies. Experimental Cell Research. 271 (2), 296-304 (2001).
- Shou, W., et al. Synthetic cooperation in engineered yeast populations. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 1877-1882 (2007).
- Momeni, B., et al. Cooperation generates a unique spatial signature in microbial communities. , Submitted (2012).
- Kiernan, J. Histological and Histochemical Methods: Theory and Practice. ed, , 4th, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 4 (2008).
- Piccirillo, S., et al. The Rim101p/PacC Pathway and Alkaline pH Regulate Pattern Formation in Yeast Colonies. Genetics. 184 (3), 707-716 (2010).
