Summary
我々は、蛍光細胞の内部のパターンを観察するために酵母コミュニティを凍結および凍結セクショニングするためのプロトコルを提示します。この方法は、メタノール固定に依存しており、コミュニティ内での蛍光タンパク質を不活性化することなく、細胞の空間的な分布を維持するために10月エンベディング。
Abstract
微生物は、一般的に地域社会に住んでいます。コミュニティ内での細胞の空間的な組織は、コミュニティ1の生存と機能に影響を及ぼすと考えられている。焦点と二光子顕微鏡を含む光学セクショニング技術は、細菌や古細菌群集2,3の空間組織を観察するために有用であることが証明されています。酵母のコロニーの共焦点イメージングおよび物理的なセクショニングの組み合わせは、セル4の内部組織を明らかにした。しかし、共焦点や2光子顕微鏡を用いた直接的な光学セクショニングは、酵母のコロニーの奥深くまで少数の細胞層に到達することができるだけであった。この制限があるため4酵母細胞からの光の強い散乱の可能性があります。
ここでは、固定及びSaccharomyces cerevisiaeのコミュニティ内で蛍光細胞の空間分布を得るために、凍結セクショニングに基づく方法を提案する。我々は、定着剤としてメタノールを使用細胞の空間分布を保存する方法について説明します。固定されたコミュニティはクライオスタットにおけるOCT化合物、冷凍、および凍結切片を浸透されています。セクションの蛍光イメージングは、コミュニティ内の蛍光細胞の内部組織を明らかにする。
赤と緑の蛍光タンパク質を発現する株から成る酵母コミュニティの例としては、同様に酵母のコロニー2,3内の遺伝子発現の場合と蛍光細胞の空間分布を明らかにするために凍結セクショニング法の可能性を実証している。我々の焦点は、Saccharomyces cerevisiaeのコミュニティになっているにもかかわらず、同じ方法を用いて、潜在的に他の微生物群集を検討するために適用することができる。
Protocol
1。酵母のコミュニティを修正
- メンブレンフィルター（; 図2A 例えば 、ミリポアMF膜フィルター）に酵母のコミュニティを育てています。このプロトコルは、6mm径のメンブレンフィルター上の未満2×10 8個の細胞の典型的な地域に対応しています。
- ウェル1センチ直径（ 図2B）の底をカバーする541ワットマン濾紙を使用しています。このワットマン紙は後の段階でコミュニティを転送するためのキャリアとして使用されます。ウェルに1ミリリットル100％メタノールを追加し、平衡化するために、温度を-20でよく℃を残す。
- デュワーに液体窒素を入れてください 。ピンセット（ 図2C）を使用して、液体N 2中で少なくとも15秒間コミュニティを浸漬することにより、液体窒素中でコミュニティをフリーズします。
- -20℃メタノール（ 図2D）のウェルに凍結コミュニティを転送します。メタノールでそれを浸すとき社会が水平に保たれていることを確認します。20分待ってください。 MF膜フィルターは、メタノール中で崩壊し始めます。
- よくメタノールの蒸発（ 図2E）は-20℃で保た冷たいペトリ皿にメタノールからコミュニティの担体を用いて541ワットマンろ紙を転送します。転送する場合は、キャリアWhatmanフィルターの上にコミュニティを維持し、寒いペトリ皿に入れる前に厚いワットマン紙の別の部分を用いてメタノールの余分な水滴を離れて描画します。これは蒸発時間は、サンプルとサンプルの間の一貫性があることを保証します。
- キャリアWhatmanフィルターが乾燥して見えるまで蒸発のために4から6時間待ちます。不十分な蒸発はセクショニングと干渉残留メタノールを残します。過乾燥は、地域社会に亀裂や変形が生じる。
- -20℃の冷凍庫からサンプルを取り出します。コミュニティで覆われていないワットマン541濾紙を切り取った。
- サンプルはから少なくとも約2 mmのマージンを持っているような十分な大きさの長方形の立方体のアルミ箔コンテナを作るそれぞれの側（ 図2F）。アルミ箔容器の底面にコミュニティを置き、すぐに3〜10月でサンプル〜コミュニティの高さ上記4ミリメートルをカバーしています。重要な場合は、試料の配向が容器の側面に関連して、このステップで調整することができます。 10分待ってください。
- 凍結するドライアイス上に金属板の上に10月包埋サンプルを置きます。 -20℃または-80℃の冷凍庫で凍結コミュニティを保管してください。
2。蛍光イメージング用冷凍コミュニティセク
- -25℃に凍結切片室の温度を設定し、その温度が室内の温度に達するまでチャンバー内のサンプルのままにしておきます。
- 台紙に10月のドロップを適用した後にクライオマウントにサンプルをマウントします。 10月の厚さが2-3 mmであるように、露出したワットマン濾紙（容器の底部）で試料の側面に均一に10月を広げた。 10月はSE前クライオスタット室の内部に凍結しましょうctioning。サンプルのすべての側面に2〜3mmの10月のマージンを確保することは、セクションの整合性を維持するのに役立ちます。
- 10月のサンプルブロックの辺はサンプルを整列させるために使用することができます。サンプルがブレードに対して位置合わせされていない場合は、セクション化は、サンプルのコーナーやサイドからスタートします。ブレードはサンプルブロックの完全に垂直（もしくは水平）面をカットしていることを確認するためにマウントを調整します。
- 酵母のコミュニティのための典型的なセクションでは、〜14μmの厚さである。セクションをカットした後、ゆっくりと切断部にスライドを接近して、セクションを収集するために室温に保っ顕微鏡スライドを使用しています。セクションでは、溶融し、顕微鏡スライドに移ります。最大18のセクションには、1つのスライドに転写することができる。
- 好ましくは-20低温、℃、イメージングの前でスライドを格納します。 4℃で1週間保持する際、信号の損失が最小限に抑えられます最大蛍光シグナルは、イメージングは、好ましくは、セクショニングの直後に行われます。
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Representative Results
赤と緑のタグを付けた競争力のある集団6を含む酵母群集の垂直断面の蛍光画像を図3に示します。これらのコミュニティは2原栄養酵母の菌株とスペースを含む共有リソースのための彼らの競争から成り、それらの垂直断面に表示されているように、円柱状のパターンに7をリードしています 。単一細胞の解像度ダウン、クロスセクションで解決することができます。 図3は図1のプロトコールに従ってして（下）と（上）、メタノール固定せずに得られた複写社会の断面を比較します。固定せずに酵母コミュニティを凍結セクショニングの場合、プロトコルは、ステップ1.8から始めて続いている。蛍光シグナルは固定せず、コミュニティセクションに保存されますが、コミュニティの完全性が損なわれます。結果として、（1）いくつかのセルは、セクションのエッジの周りに離れて浮かぶと、（2）全体的な義ELD（ すなわち 、セクションの数分のセクショニング手順のアーティファクトによって乱されていない）は、一定の社会に比べて低くなっています。
図4は、酵母コミュニティの代表明視野と蛍光垂直断面を示しています。コミュニティの上に細胞は、明視野と明るい蛍光の強い散乱によって特徴付けられる他の細胞とは異なる表示され冠を形成している。これらのパターンは、酵母のコロニー4における分化の報告されたパターンと一致している。
図1で（左）と（右）固定せずに酵母コミュニティを凍結セクショニングのための典型的な手順を示すフローチャート。
図2。
repの垂直断面の図3代表的な蛍光画像せず（上）と（下）メタノール固定で表示され、同一の条件の下で生育した酵母コミュニティをlicate。コミュニティはmCherryとyEGFP蛍光タンパク質7でタグ付けS.cerevisiaeの2原栄養株で構成されています。固定せずに、細胞を一緒にバインドされていないとセクショニング中離れてフロートまたは再配置することがあります。メタノール固定は一緒にコミュニティ細胞を保持しますが、コミュニティの高さ（％の平均）との差で観察されるような収縮を引き起こす。
図4：酵母コミュニティの垂直断面の明視野代表（上）および蛍光（下）の画像が表示されます。コミュニティは、DsRedのとYFPの蛍光タンパク質7でタグ付けS.cerevisiaeの2原栄養株で構成されています。
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Discussion
ここで紹介する手順は、酵母のコミュニティの内部構造を検査する方法を提供します。メタノール固定工程は8リジッド酵母コロニーを作り、コロニーの整合性を維持しますが、それはまた、結果を解釈する際に考慮すべき8収縮を引き起こす。我々は通常、直接9を固定せずに 10月中に埋め込 まれたコロニーに比べて酵母のコロニーの高さの約30％収縮を参照してください。
収縮を回避するために、凍結セクショニングのための代替的アプローチは、直接10月にコミュニティを埋め込み、それらを凍結することである。蛍光を直接埋め込むことに基づく方法で保存されますが、欠点は、各セクション内の細胞が結合していないことです。その結果、先にセクションのフロート、およびセクションの端で細胞の一部は、切削プロセスの障害（ 図4）を被る可能性が高くなります。彼に焦点を当てていないものの再度、酵母社会の断面の明視野像はまた私達のコミュニティ9内の細胞の状態に関する有用な情報を与えるかもしれません。興味のあるプロパティは定着工程によって影響されるかどうかは、ケースバイケースで検討する必要があります。
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Disclosures
特別な利害関係は宣言されません。
Acknowledgments
我々は彼らのクライオスタットを使用するための許可フレッドハッチンソンがん研究センターのジョナサン·クーパーラボに感謝したいと思います。この作品は、NIHとWMケック財団によってサポートされていました。 BMは、ライフサイエンス研究財団のゴードンとベティ·ムーア仲間です。私達は私達と彼の固定プロトコルを共有するためのダニエルGottschlingに感謝しています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100% Methanol | J.T. Baker | 9070-01 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Andwin Scientific | 4583 | |
| Whatman Grade No. 541 Quantitative Filter Paper | Whatman | 1541-047 | |
| Millipore-MF Membrane Filter | Millipore | HAWP04700 | |
| Cryostat | Leica | CM 1510 S |
References
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