Summary
Nós apresentamos um protocolo para congelamento e cryosectioning comunidades de leveduras para observar padrões internos de células fluorescentes. O método baseia-se na fixação de metanol e OCT-incorporação de preservar a distribuição espacial das células sem inactivar proteínas fluorescentes dentro de uma comunidade.
Abstract
Micróbios geralmente vivem em comunidades. A organização espacial das células dentro de uma comunidade é acreditado para impactar a sobrevivência e função da comunidade 1. Ópticos técnicas de seccionamento, incluindo microscopia confocal e de dois fótons, têm se mostrado útil para observar a organização espacial das comunidades de bactérias e archaea 2,3. Uma combinação de imagem confocal e seccionamento física de colónias de levedura revelou a organização interna de celas 4. No entanto, seccionamento óptico direto em microscópio confocal ou dois fótons foi apenas capaz de atingir algumas camadas de células profundas em colônias de leveduras. Esta limitação é provavelmente devido à dispersão de luz forte a partir de células de levedura 4.
Aqui, apresentamos um método baseado na fixação e cryosectioning para obter uma distribuição espacial de células fluorescentes dentro de comunidades de Saccharomyces cerevisiae. Usamos metanol como agente fixadorpara preservar a distribuição espacial das células. Comunidades fixos são infiltradas com OCT composto, congelados, e cryosectioned num criostato. Imagens de fluorescência das seções revela que a organização interna das células fluorescentes dentro da comunidade.
Exemplos de comunidades de leveduras consistindo em estirpes que expressam as proteínas de vermelho e verde fluorescente demonstrar as potencialidades do método cryosectioning para revelar a distribuição espacial de células fluorescentes, bem como a expressão de genes dentro de colónias de levedura 2,3. Mesmo que o foco tem sido sobre as comunidades de Saccharomyces cerevisiae, o mesmo método pode ser potencialmente aplicada a examinar outras comunidades microbianas.
Protocol
1. Fixação de comunidades de leveduras
- Crescer comunidades de leveduras em um filtro de membrana (por exemplo, Millipore MF filtro de membrana; Figura 2A). Este protocolo corresponde a uma comunidade típico inferior a 2x10 8 células sobre um filtro de membrana de 6 mm de diâmetro.
- Utilizar um pedaço de papel Whatman 541 filtro para cobrir o fundo de um 1 cm de diâmetro bem (Figura 2B). Este papel Whatman será usado como um transportador para transferir a comunidade em fases posteriores. Adicionar 1 ml de metanol a 100% para o poço, e deixar o bem em -20 ° C para a temperatura equilibrar.
- Coloque N2 líquido num dewar. Congelar comunidade em nitrogênio líquido por imersão a comunidade por pelo menos 15 segundos em N2 líquido usando uma pinça (Figura 2C).
- Transferir comunidade congelado para o bem de -20 ° C de metanol (Figura 2D). Garantir que a comunidade seja mantido na horizontal quando submergindo-o no metanol.Espere 20 min. O filtro de membrana de MF começa a desintegrar-se em metanol.
- Transferir comunidade usando o transportador 541 de papel de filtro Whatman partir do metanol bem para uma placa de Petri frio manteve a -20 ° C para a evaporação de metanol (Figura 2E). Ao transferir, manter a comunidade no topo da transportadora Whatman filtro e afastar gotas extras de metanol usando outro pedaço de papel Whatman grossa antes de colocar a placa de Petri frio. Isto irá assegurar que o tempo de evaporação é consistente de amostra para amostra.
- Espere 4-6 horas para a evaporação até que o transportador de filtro Whatman parece seca. Evaporação insuficiente deixa metanol residual que interfere com o corte. Excesso de secagem causas rachaduras e deformações nas comunidades.
- Tome o exemplo de -20 ° C congelador. Corte o papel Whatman 541 filtro não cobertos pela comunidade.
- Fazer um contentor rectangular de folha de alumínio-cúbico que é suficientemente grande tal que a amostra possui pelo menos 2 mm ~ margem decada um dos lados (Figura 2F). Coloque a comunidade sobre a superfície do fundo do recipiente de folha de alumínio; cobrir imediatamente a amostra com OCT para 3 ~ 4 mm acima altura comunidade. Se importante, a orientação da amostra pode ser ajustada neste passo em relação aos lados do recipiente. Esperar 10 min.
- Coloque a amostra outubro embutida em uma placa metálica em gelo seco para congelar. Armazenar as comunidades congelados a -20 ° C ou -80 ° C congelador.
2. Seccionamento Comunidades congelada por Fluorescência de imagem
- Ajuste a temperatura da câmara de criocorte para -25 ° C e deixar as amostras na câmara até que a sua temperatura atinge a temperatura da câmara.
- Monte a amostra para um crio-montagem após a aplicação de uma gota de outubro no monte. Espalhe outubro uniformemente sobre o lado da amostra com papel de filtro Whatman exposto (fundo do recipiente), de modo que a espessura da OCT é de 2-3 mm. Vamos congelar outubro dentro da câmara antes de se criostatoctioning. Assegurar uma margem de outubro de 2-3 mm em todos os lados da amostra de ajuda a preservar a integridade das secções.
- Os lados do bloco de amostras de outubro pode ser usada para alinhar a amostra. Se a amostra não está alinhada em relação à lâmina, seccionando vai começar a partir de um canto ou lado da amostra. Regular a montagem para assegurar que a lâmina corta um rosto perfeitamente vertical (ou horizontal) do bloco de amostra.
- Seções típicas para comunidades de leveduras são ~ 14 um de espessura. Após o corte de uma secção, a utilizar uma lâmina de microscópio mantido à temperatura ambiente para recolher a secção, pelo que se aproximava lentamente a lâmina para o corte. A seção vai derreter e transferir para a lâmina de microscópio. Até 18 seções podem ser transferidos para um slide.
- Armazenar as lâminas a baixas temperaturas, de preferência -20 ° C, antes da imagiologia. A perda de sinal é mínima quando mantidos durante uma semana a 4 ° C. Para sinal de fluorescência máxima, a imagem é de preferência feito imediatamente após o corte.
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Representative Results
Imagens de fluorescência de secções transversais verticais das comunidades de levedura contendo vermelho-verde e marcada com populações competitivos 6 são mostrados na Figura 3. Essas comunidades consistem em duas linhagens de levedura prototróficos e sua competição por recursos compartilhados, incluindo espaço, leva a colunar padrões 7, como mostrado em suas verticais transversais. As resoluções para baixo para uma única célula pode ser resolvido em secções transversais. Figura 3 compara secções transversais das comunidades replicados obtidos com (parte inferior) e sem (em cima) de fixação de metanol, seguindo os protocolos na Figura 1. Para cryosectioning comunidades de leveduras sem fixação, o protocolo é seguido a partir do passo 1.8. O sinal de fluorescência é preservada nas secções da comunidade sem fixação, mas a integridade da comunidade é comprometida. Como resultado: (1) algumas células flutuar em torno da borda da secção, e (2) o yi globaleld (ou seja, a fração de seções não perturbado por artefatos do processo de corte) é menor em comparação com as comunidades fixas.
A Figura 4 mostra a representação de campo brilhante e fluorescência verticais transversais de uma comunidade de levedura. Células na parte superior do formulário comunidade uma coroa que aparece distinta de outras células caracterizadas por forte dispersão de fluorescência de campo claro e brilhante. Estes padrões são consistentes com os padrões de diferenciação relatados em colônias de leveduras 4.
Figura 1. Fluxograma do processo típico para cryosectioning comunidades de levedura com (esquerda) e sem (direita) de fixação.
Figura 2.
Figura 3. Representativos imagens de fluorescência de secção transversal vertical de replicate comunidades de leveduras cultivadas sob condições idênticas são mostrados sem (em cima) e com o (inferior)-metanol fixação. A comunidade é composta de duas estirpes de S. cerevisiae prototróficos marcados com mCherry e proteínas fluorescentes yEGFP 7. Sem fixação, as células não estão unidos e pode flutuar ou reorganizar durante o corte. Metanol fixação mantém as células da comunidade juntos, mas provoca retração observada na diferença entre a comunidade alturas (média%).
Figura 4. Representante de campo brilhante (topo) e de fluorescência (inferior) imagens de secção transversal vertical de uma comunidade de levedura são mostrados. A comunidade é composta de duas estirpes de S. cerevisiae prototróficos marcados com DsRed e YFP proteínas fluorescentes 7.
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Discussion
O procedimento aqui apresentado oferece um modo para inspeccionar a estrutura interna das comunidades de leveduras. O passo de fixação faz com que o metanol colónia de levedura rígida 8 e preserva a integridade da colónia, no entanto, também provoca 8 encolhimento que devem ser tidos em conta na interpretação dos resultados. Se costuma ver em torno de 30% de encolhimento da altura de colônias de leveduras, em comparação com as colônias diretamente embutidos em outubro sem fixar 9.
Para evitar o encolhimento, uma abordagem alternativa para cryosectioning é incorporar diretamente as comunidades em outubro e congelá-los. Fluorescência é preservada no método baseado na incorporação directa, mas a desvantagem é que as células dentro de cada secção não são ligados em conjunto. Como resultado, algumas das células nas extremidades do flutuador secção de distância, e as secções são mais susceptíveis de sofrer perturbações no processo de corte (Figura 4). Embora não seja focada no que elere, brilhante-campo imagens de seções transversais de comunidades de leveduras também podem nos dar informações úteis sobre o estado de células dentro da comunidade 9. Seja ou não a propriedade de interesse é afetada pela etapa de fixação tem de ser analisada numa base caso-a-caso.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer a Jonathan Cooper Lab no Fred Hutchinson Cancer Research Center for a permissão para usar seu criostato. Este trabalho foi financiado pelo NIH e do WM Keck Foundation. BM é um Gordon e Betty Moore companheiro de Vida Fundação de Pesquisa Científica. Somos gratos a Daniel Gottschling para compartilhar seu protocolo de fixação com a gente.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100% Methanol | J.T. Baker | 9070-01 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Andwin Scientific | 4583 | |
| Whatman Grade No. 541 Quantitative Filter Paper | Whatman | 1541-047 | |
| Millipore-MF Membrane Filter | Millipore | HAWP04700 | |
| Cryostat | Leica | CM 1510 S |
References
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