Summary
Мы представляем протокол для замораживания и cryosectioning дрожжей общин соблюдать внутренние модели флуоресцентные клетки. Метод основан на фиксации метанолом и октябре-вложение сохранить пространственное распределение клеток без инактивации флуоресцентных белков внутри сообщества.
Abstract
Микробы, как правило, живут в общинах. Пространственной организации клеток внутри сообщества, как полагают, влияют на выживание и функционирование сообщества 1. Оптические методы секционирования, в том числе конфокальной и двухфотонной микроскопии, доказали свою полезность для наблюдения пространственной организации бактерий и архей общинами 2,3. Сочетание конфокальной микроскопии и физического срезов дрожжевых колоний показало, внутренней организации клеток 4. Тем не менее, прямых оптических срезов с помощью конфокальной или двух-фотонного микроскопа были только способны достигать нескольких слоев клеток дрожжей в глубь колонии. Это ограничение, скорее всего, из-за сильного рассеяния света из дрожжевых клеток 4.
Здесь мы представляем метод, основанный на установлении и cryosectioning получить пространственное распределение флуоресцентных клеток внутри общины Saccharomyces CEREVISIAE. Мы используем метанол в качестве закрепителясохранить пространственное распределение клеток. Исправлена общины проникли с октября соединение, замороженные и cryosectioned в криостат. Флуоресценции из разделов раскрывает внутреннюю организацию флуоресцентные клетки внутри сообщества.
Примеры дрожжей общины, состоящей из штаммов выразив красного и зеленого флуоресцентного белка продемонстрировать потенциал cryosectioning метод выявления пространственного распределения флуоресцентные клетки, а также, что экспрессии генов в дрожжевых колоний 2,3. Хотя наш акцент был сделан на общины Saccharomyces CEREVISIAE тот же метод потенциально может быть применен для изучения других микробных сообществ.
Protocol
1. Крепление дрожжи Сообщества
- Рост дрожжей сообщества на мембранный фильтр (например, Millipore MF мембранный фильтр; рис. 2А). Этот протокол соответствует типичным сообщество менее 2х10 8 ячеек на 6 мм в диаметре мембранный фильтр.
- Используйте кусок ватмана 541 фильтровальной бумаги, чтобы покрыть дно 1 см диаметра скважины (рис. 2В). Это ватмана будет использоваться в качестве носителя для передачи сообщества на более поздних стадиях. Добавить 1 мл на 100% метанола в скважины, и оставить хорошо в -20 ° C для температуры, чтобы уравновесить.
- Положите жидкий N 2 в сосуд Дьюара. Замораживание сообщества в жидкий азот путем погружения сообщества, по крайней мере 15 секунд в жидком N 2 с помощью пинцета (рис. 2С).
- Передача замороженных сообщества и от -20 ° C метанола (рис. 2D). Убедитесь, что община держится горизонтально, когда погружая его в метанол.Подождите 20 мин. MF мембранный фильтр начинает распадаться на метанол.
- Передача сообщества, используя носитель Whatman 541 фильтровальная бумага из метанола, а в холодную чашку Петри выдерживали при -20 ° C для испарения метанола (рис. 2E). При передаче, держать сообщество в верхней части носителя Whatman фильтр и отвлечь дополнительные капель метанола с использованием другой кусок плотного ватмана, прежде чем положить в холодную чашку Петри. Это будет гарантировать, что время испарения соответствует от образца к образцу.
- Подождите 4-6 часа для испарения, пока перевозчик Whatman фильтр выглядит сухой. Вашем испарения оставляет остаточного метанола, который мешает секционирования. За сушки причины трещин и деформаций в общинах.
- Возьмем пример из морозильной камере -20 ° C. Срежьте Whatman 541 фильтровальной бумаги не распространяется сообщества.
- Сделайте прямоугольное кубических алюминиевой фольги контейнер, который является достаточно большим, что образец имеет по крайней мере ~ 2 мм от краякаждую сторону (рис. 2F). Поместите сообщества на нижней поверхности алюминиевой фольги контейнер; сразу покрытия образца с октября по 3 ~ 4 мм выше сообщество высоте. Если важно, ориентации образца может быть скорректирована на этом этапе с учетом сторон контейнера. Подождите 10 мин.
- Поместите октября встраиваемый образца на металлической пластине на сухом льду, чтобы заморозить. Хранить замороженные общинах при температуре -20 ° C или -80 ° C морозильнике.
2. Секционирование Frozen Сообщества для флуоресцентной микроскопии
- Установить температуру cryosection камере до -25 ° С и оставляют образцы в камере, пока ее температура не достигнет температуры в камере.
- Установить образец на крио-гора после нанесения капли октября на горе. Распространение октября равномерно на стороне образца с открытыми Whatman фильтровальной бумаги (в нижней части контейнера), так что октябрь толщиной 2-3 мм. Пусть октября замораживание внутри криостата камеры перед SEctioning. Обеспечение рентабельности по октябрь 2-3 мм со всех сторон образца помогает сохранить целостность разделов.
- Стороны блока образца октября могут быть использованы для выравнивания образца. Если образец не выровнен по отношению к лезвию, секционирования начнется с угла или стороны образца. Опора регулируется для того, чтобы лезвие режет строго вертикально (или горизонтально) поверхность образца блока.
- Типичные разделы для дрожжей сообщества ~ 14 мкм толщины. После резки раздела, используйте стекло микроскопа храниться при комнатной температуре, чтобы собрать разделе, медленно приближаясь к слайд разреза разделе. В этом разделе будет таять и передать в стекле микроскопа. До 18 разделов могут быть перенесены на один слайд.
- Хранить слайды при низких температурах, предпочтительно от -20 ° C до визуализации. Потеря сигнала минимальна при хранении в течение одной недели при 4 ° C. Для максимального сигнала флуоресценции, изображения предпочтительно сделано сразу же после секционирования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Флуоресцентные изображения вертикального сечения дрожжей общин содержащие красный и зеленый, помеченные конкурентной населения 6 показаны на рисунке 3. Эти общины состоят из двух прототрофный штаммов дрожжей и их конкуренции за общие ресурсы, в том числе пространстве, приводит к столбчатым моделей 7, как показано на их вертикальных сечений. Резолюции вниз на одну ячейку может быть решен в поперечном сечении. Рисунок 3 сравнивает сечения повторных общин, полученные с (внизу) и без (вверху) метанола фиксации, после протоколы на рисунке 1. Для cryosectioning дрожжей общин без фиксации, протокола следует, начиная с шагом 1,8. Флуоресцентного сигнала сохраняется в сообществе разделов без фиксации, но целостность сообщество находится под угрозой. В результате: (1) некоторые клетки уплывают по краю участка, и (2) общий Yiполя (т. е. доля разделов не возмущается артефакты секционирования процедура) ниже по сравнению с фиксированными общин.
На рисунке 4 показана представитель светлого поля и флуоресценции вертикального сечения дрожжей сообщества. Клетки в верхней части сообщества форме короны, которая появляется в отличие от других клеток характеризуется сильным рассеянием в светлое поле и ярче флуоресценции. Эти модели соответствуют сообщили модели дифференциации в дрожжевых колоний 4.
Рисунок 1. Блок-схема стандартная процедура cryosectioning дрожжей общин (слева) и без него (справа) крепления.
Рисунок 2.
Рисунок 3. Представитель флуоресцентных изображений вертикального сечения репутацииlicate дрожжей общин, выращенных в одинаковых условиях указаны без (вверху) и с (внизу) метанол-крепления. Сообщество состоит из двух прототрофный штаммов S.cerevisiae, отмеченных mCherry и yEGFP флуоресцентные белки 7. Без фиксации, клетки не связаны друг с другом и могут уплыть или изменить во время секционирования. Метанол-крепление держит сообщества клетки вместе, но вызывает усадку как это наблюдается в разнице между сообществом высоты (% в среднем).
Рисунок 4. Представитель светлого поля (вверху) и флуоресценции (внизу) изображения вертикального сечения дрожжей сообщества показано на рисунке. Сообщество состоит из двух прототрофный штаммов S.cerevisiae, отмеченных DsRed и YFP флуоресцентные белки 7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Процедура представленные здесь предлагается способ проверить внутреннюю структуру дрожжей общин. Шаг метанола крепления делает дрожжей колонии жесткого 8 и сохраняет целостность колонии, однако, это также приводит к усадке 8, которые должны быть приняты во внимание при интерпретации результатов. Как правило, мы видим около 30% усадки в высоту колонии дрожжей, по сравнению с колониями непосредственно встроенные в октябре без фиксации 9.
Чтобы избежать усадки, альтернативный подход к cryosectioning является непосредственно вставлять общин в октябре и заморозить их. Флуоресценции сохраняется в метод, основанный на прямых вложений, но недостатком является то, что клетки в пределах каждого раздела не связаны друг с другом. В результате некоторые клетки по краям разделе уплывают, а разделы чаще страдают нарушениями в секционирования процесса (рис. 4). Хотя это и не сосредоточены на егоре, светлого поля изображения сечений дрожжей общины могут также дать нам полезную информацию о состоянии клеток внутри сообщества 9. Будь или не собственность интересов пострадавших от крепления шаг должен рассматриваться в каждом конкретном случае на индивидуальной основе.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить Jonathan Cooper лаборатории на Фреда Хатчинсона онкологический научный центр на разрешение использовать их криостата. Эта работа была поддержана NIH и WM Keck Foundation. BM является членом Гордона и Бетти Мур жизни Фонда исследований науки. Мы благодарны Daniel Gottschling для обмена его крепления протокол с нами.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100% Methanol | J.T. Baker | 9070-01 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Andwin Scientific | 4583 | |
| Whatman Grade No. 541 Quantitative Filter Paper | Whatman | 1541-047 | |
| Millipore-MF Membrane Filter | Millipore | HAWP04700 | |
| Cryostat | Leica | CM 1510 S |
References
- Tolker-Nielsen, T., Molin, S. Spatial Organization of Microbial Biofilm Communities. Microbial Ecology. 40 (2), 75-84 (2000).
- Moller, S., et al. In Situ Gene Expression in Mixed-Culture Biofilms: Evidence of Metabolic Interactions between Community Members. Appl. Environ. Microbiol. 64 (2), 721-732 (1998).
- Lepp, P. W., et al. Methanogenic Archaea and human periodontal disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (16), 6176-6181 (2004).
- Váchová, L., et al. Architecture of developing multicellular yeast colony: spatio-temporal expression of Ato1p ammonium exporter. Environmental Microbiology. 11 (7), 1866-1877 (2009).
- Mináriková, L., et al. Differentiated Gene Expression in Cells within Yeast Colonies. Experimental Cell Research. 271 (2), 296-304 (2001).
- Shou, W., et al. Synthetic cooperation in engineered yeast populations. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 1877-1882 (2007).
- Momeni, B., et al. Cooperation generates a unique spatial signature in microbial communities. , Submitted (2012).
- Kiernan, J. Histological and Histochemical Methods: Theory and Practice. ed, , 4th, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 4 (2008).
- Piccirillo, S., et al. The Rim101p/PacC Pathway and Alkaline pH Regulate Pattern Formation in Yeast Colonies. Genetics. 184 (3), 707-716 (2010).
