Summary
Se presenta un protocolo para la congelación y cryosectioning comunidades levadura para observar los patrones internos de las células fluorescentes. El método se basa en la fijación de metanol y OCT-incrustación de preservar la distribución espacial de las células sin inactivar proteínas fluorescentes dentro de una comunidad.
Abstract
Los microbios suelen vivir en las comunidades. La organización espacial de las células dentro de una comunidad que se cree un impacto en la supervivencia y la función de la comunidad 1. Ópticos técnicas de seccionamiento, incluyendo microscopía confocal y dos fotones, han demostrado ser útiles para la observación de la organización espacial de las comunidades bacterianas y archaeal 2,3. Una combinación de imagen confocal y seccionamiento físico de colonias de levaduras ha revelado la organización interna de las células 4. Sin embargo, el seccionamiento óptico directo por microscopía confocal o dos fotones sólo ha sido capaz de llegar a las capas celulares de profundidad en algunas colonias de levaduras. Esta limitación es probable debido a la dispersión de luz intensa a partir de 4 células de levadura.
Aquí, se presenta un método basado en la fijación y crioseccionamiento para obtener la distribución espacial de las células fluorescentes dentro de las comunidades de Saccharomyces cerevisiae. Usamos metanol como agente fijadorpara preservar la distribución espacial de las células. Comunidades fijos se infiltró con el compuesto OCT, congelado, y cryosectioned en un criostato. Imágenes de fluorescencia de las secciones revela que la organización interna de las células fluorescentes dentro de la comunidad.
Ejemplos de comunidades de levadura que consisten en cepas que expresan proteínas fluorescentes rojas y verdes demostrar el potencial del método cryosectioning para revelar la distribución espacial de las células fluorescentes, así como el de la expresión de genes dentro de las colonias de levadura 2,3. Aunque nuestra atención se ha centrado en las comunidades de Saccharomyces cerevisiae, el mismo método que potencialmente se pueden aplicar a examinar otras comunidades microbianas.
Protocol
1. La fijación de Comunidades de levadura
- Grow comunidades de levadura en un filtro de membrana (por ejemplo, Millipore filtro de membrana MF; Figura 2A). Este protocolo corresponde a una comunidad típica de menos de 2x10 8 células sobre un filtro de membrana de 6 mm de diámetro.
- Utilice un trozo de papel de filtro Whatman 541 para cubrir la parte inferior de un 1 cm de diámetro pozo (Figura 2B). Este papel Whatman se usa como portador para transferir la comunidad en las etapas posteriores. Añadir 1 ml de metanol 100% hasta el pozo, y dejar el bien en -20 ° C para la temperatura se equilibre.
- Ponga N 2 líquido en una botella Dewar. Congelar comunidad en nitrógeno líquido por inmersión de la comunidad durante al menos 15 segundos en N 2 líquido utilizando una pinza (Figura 2 C).
- Transferir comunidad congelado al pozo de -20 ° C metanol (Figura 2D). Asegúrese de que la comunidad se mantenga en posición horizontal cuando se sumerge en el metanol.Espere 20 min. El filtro de membrana MF comienza a desintegrarse en metanol.
- Transferir comunidad usando el portador 541 de papel de filtro Whatman del metanol así a una placa de Petri frío mantenido a -20 ° C para la evaporación del metanol (2E Figura). Al transferir, mantener a la comunidad en la parte superior del soporte de filtro Whatman y arrastrar gotas más de metanol utilizando una pieza de papel grueso Whatman antes de poner en el frío plato de Petri. Esto asegurará que el tiempo de evaporación es coherente de muestra a muestra.
- Espere 4-6 horas para la evaporación hasta que el portador de filtro Whatman parezca seca. Evaporación insuficiente deja metanol residual que interfiere con el corte. El secado excesivo causa grietas y deformaciones en las comunidades.
- Tomar la muestra de -20 ° C congelador. Cortar papel de filtro Whatman 541 no cubiertos por la comunidad.
- Hacer una cúbica rectangular papel de aluminio contenedor que es lo suficientemente grande de tal manera que la muestra tiene al menos 2 ~ mm de margencada lado (Figura 2F). Coloque la comunidad en la superficie inferior del envase de aluminio papel de aluminio; cubrir inmediatamente la muestra con octubre al 3 ~ 4 mm por encima de la altura de la comunidad. Si importante, la orientación de la muestra se puede ajustar en este paso con respecto a los lados del recipiente. Esperar 10 min.
- Coloque la muestra OCT-integrado en una placa metálica en hielo seco para congelar. La tienda de las comunidades congelados a -20 ° C o -80 ° C congelador.
2. Seccionamiento Comunidades congelados para imágenes fluorescentes
- Ajustar la temperatura de la cámara de sección criogénica a -25 ° C y dejar las muestras en la cámara hasta que su temperatura alcanza la temperatura de la cámara.
- Montar la muestra en un crio de montaje después de aplicar una gota de octubre en el monte. Corre octubre uniformemente en el lado de la muestra con papel de filtro Whatman expuesta (parte inferior del contenedor) de modo que el espesor de octubre es 2-3 mm. Vamos a congelar octubre dentro de la cámara antes de criostato síctioning. Garantizar un margen de octubre de 2-3 mm en todos los lados de la muestra ayuda a preservar la integridad de las secciones.
- Los lados del bloque de muestras de octubre se puede utilizar para alinear la muestra. Si la muestra no está alineada con respecto a la cuchilla, la sección se iniciará desde una esquina o lado de la muestra. Ajustar el montaje para asegurar que la cuchilla corta un perfectamente vertical (u horizontal) la cara del bloque de muestras.
- Las secciones típicas de las comunidades levaduras son ~ 14 micras de espesor. Después de cortar una sección, usar un portaobjetos de microscopio mantenido a temperatura ambiente para recoger la sección, se aproxima lentamente por la corredera a la sección de corte. La sección se fundirá y transferir al portaobjetos de microscopio. Hasta 18 secciones pueden ser transferidos a una diapositiva.
- Guarde las diapositivas a las bajas temperaturas, preferiblemente -20 º C, antes de obtención de imágenes. Pérdida de la señal es mínima cuando se mantienen durante una semana a 4 ° C. Para señal de fluorescencia máxima, la imagen se hace preferiblemente inmediatamente después de la sección.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fluorescencia imágenes de secciones transversales verticales de las comunidades de levadura que contienen rojo y verde-etiquetados poblaciones competitivos 6 se muestran en la Figura 3. Estas comunidades constan de dos cepas prototróficas de levadura y su competencia por los recursos compartidos, incluyendo el espacio, conduce a patrones columnar 7, como se muestra en sus secciones transversales verticales. Resoluciones de hasta una sola célula se pueden resolver en las secciones transversales. Figura 3 compara las secciones transversales de las comunidades replicados obtenidos con (parte inferior) y sin (parte superior) de fijación de metanol, siguiendo los protocolos de la figura 1. Para cryosectioning comunidades de levadura sin fijación, el protocolo se siguió desde el paso 1,8. La señal de fluorescencia se conserva en las secciones de la comunidad sin fijar, pero la integridad de la comunidad se ve comprometida. Como resultado: (1) algunas células flotar alrededor del borde de la sección, y (2) el total yield (es decir, la fracción de las secciones no perturbado por los artefactos del procedimiento de corte) es menor en comparación con las comunidades fijos.
La figura 4 muestra un resultado representativo de campo brillante y de fluorescencia secciones transversales verticales de una comunidad de levadura. Las células en la parte superior de la comunidad forma una corona que aparece distinta de otras células que se caracterizan por una mayor dispersión de la fluorescencia de campo brillante y brillante. Estos patrones son consistentes con los patrones registrados de diferenciación en colonias de levadura 4.
Figura 1. Diagrama de flujo del procedimiento típico para cryosectioning comunidades con levadura (izquierda) y sin (derecha) de fijación.
Figura 2.
Figura 3. Representativos imágenes de fluorescencia de sección transversal vertical de replicate comunidades de levadura cultivadas en condiciones idénticas se muestran sin (parte superior) y con (inferior)-metanol fijación. La comunidad se compone de dos cepas de S. cerevisiae prototróficas etiquetados con mCherry y las proteínas fluorescentes yEGFP 7. Sin fijación, las células no están unidos entre sí y pueden flotar o reorganizar durante el corte. Metanol de fijación impide que las células de la comunidad juntos, pero provoca la contracción como se observa en la diferencia entre la comunidad alturas (promedio%).
Figura 4. Representante de campo brillante (parte superior) y de fluorescencia (parte inferior) de imágenes de sección transversal vertical de una comunidad de levadura se muestran. La comunidad se compone de dos cepas de S. cerevisiae prototróficas etiquetados con proteínas fluorescentes DsRed y YFP 7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
El procedimiento presentado aquí ofrece una manera de inspeccionar la estructura interna de las comunidades de levadura. La etapa de fijación de metanol hace que la colonia de levadura rígido 8 y preserva la integridad de la colonia, sin embargo, también provoca la contracción 8 que deben tenerse en cuenta en la interpretación de los resultados. Normalmente vemos alrededor del 30% de contracción en la altura de las colonias de hongos, en comparación con las colonias directamente embebidos en OCT sin fijación 9.
Para evitar el encogimiento, un enfoque alternativo para cryosectioning es incorporar directamente a las comunidades en octubre y congelarlos. La fluorescencia se conserva en el método basado en la incorporación directa, pero la desventaja es que las células dentro de cada sección no están unidos entre sí. Como resultado, algunas de las células en los bordes de la sección del flotador de distancia, y las secciones son más propensos a sufrir alteraciones en el proceso de corte (Figura 4). Aunque no se centra en élre, las imágenes de campo brillante de las secciones transversales de las comunidades de hongos también pueden darnos información útil sobre el estado de las células dentro de la comunidad 9. Sea o no la propiedad de interés se ve afectada por la etapa de fijación tiene que ser examinado sobre una base caso por caso.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Nos gustaría dar las gracias a Jonathan Cooper Lab en Fred Hutchinson Cancer Research Center para el permiso de usar su criostato. Este trabajo fue apoyado por el NIH y la Fundación WM Keck. BM es un compañero Gordon y Betty Moore de Investigación de la Fundación Ciencias de la Vida. Damos las gracias a Daniel Gottschling por compartir su protocolo de fijación con nosotros.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100% Methanol | J.T. Baker | 9070-01 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Andwin Scientific | 4583 | |
| Whatman Grade No. 541 Quantitative Filter Paper | Whatman | 1541-047 | |
| Millipore-MF Membrane Filter | Millipore | HAWP04700 | |
| Cryostat | Leica | CM 1510 S |
References
- Tolker-Nielsen, T., Molin, S. Spatial Organization of Microbial Biofilm Communities. Microbial Ecology. 40 (2), 75-84 (2000).
- Moller, S., et al. In Situ Gene Expression in Mixed-Culture Biofilms: Evidence of Metabolic Interactions between Community Members. Appl. Environ. Microbiol. 64 (2), 721-732 (1998).
- Lepp, P. W., et al. Methanogenic Archaea and human periodontal disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (16), 6176-6181 (2004).
- Váchová, L., et al. Architecture of developing multicellular yeast colony: spatio-temporal expression of Ato1p ammonium exporter. Environmental Microbiology. 11 (7), 1866-1877 (2009).
- Mináriková, L., et al. Differentiated Gene Expression in Cells within Yeast Colonies. Experimental Cell Research. 271 (2), 296-304 (2001).
- Shou, W., et al. Synthetic cooperation in engineered yeast populations. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 1877-1882 (2007).
- Momeni, B., et al. Cooperation generates a unique spatial signature in microbial communities. , Submitted (2012).
- Kiernan, J. Histological and Histochemical Methods: Theory and Practice. ed, , 4th, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 4 (2008).
- Piccirillo, S., et al. The Rim101p/PacC Pathway and Alkaline pH Regulate Pattern Formation in Yeast Colonies. Genetics. 184 (3), 707-716 (2010).
