Se presenta un protocolo para la congelación y cryosectioning comunidades levadura para observar los patrones internos de las células fluorescentes. El método se basa en la fijación de metanol y OCT-incrustación de preservar la distribución espacial de las células sin inactivar proteínas fluorescentes dentro de una comunidad.
Los microbios suelen vivir en las comunidades. La organización espacial de las células dentro de una comunidad que se cree un impacto en la supervivencia y la función de la comunidad 1. Ópticos técnicas de seccionamiento, incluyendo microscopía confocal y dos fotones, han demostrado ser útiles para la observación de la organización espacial de las comunidades bacterianas y archaeal 2,3. Una combinación de imagen confocal y seccionamiento físico de colonias de levaduras ha revelado la organización interna de las células 4. Sin embargo, el seccionamiento óptico directo por microscopía confocal o dos fotones sólo ha sido capaz de llegar a las capas celulares de profundidad en algunas colonias de levaduras. Esta limitación es probable debido a la dispersión de luz intensa a partir de 4 células de levadura.
Aquí, se presenta un método basado en la fijación y crioseccionamiento para obtener la distribución espacial de las células fluorescentes dentro de las comunidades de Saccharomyces cerevisiae. Usamos metanol como agente fijadorpara preservar la distribución espacial de las células. Comunidades fijos se infiltró con el compuesto OCT, congelado, y cryosectioned en un criostato. Imágenes de fluorescencia de las secciones revela que la organización interna de las células fluorescentes dentro de la comunidad.
Ejemplos de comunidades de levadura que consisten en cepas que expresan proteínas fluorescentes rojas y verdes demostrar el potencial del método cryosectioning para revelar la distribución espacial de las células fluorescentes, así como el de la expresión de genes dentro de las colonias de levadura 2,3. Aunque nuestra atención se ha centrado en las comunidades de Saccharomyces cerevisiae, el mismo método que potencialmente se pueden aplicar a examinar otras comunidades microbianas.
El procedimiento presentado aquí ofrece una manera de inspeccionar la estructura interna de las comunidades de levadura. La etapa de fijación de metanol hace que la colonia de levadura rígido 8 y preserva la integridad de la colonia, sin embargo, también provoca la contracción 8 que deben tenerse en cuenta en la interpretación de los resultados. Normalmente vemos alrededor del 30% de contracción en la altura de las colonias de hongos, en comparación con las colonias directamente embebidos e…
The authors have nothing to disclose.
Nos gustaría dar las gracias a Jonathan Cooper Lab en Fred Hutchinson Cancer Research Center para el permiso de usar su criostato. Este trabajo fue apoyado por el NIH y la Fundación WM Keck. BM es un compañero Gordon y Betty Moore de Investigación de la Fundación Ciencias de la Vida. Damos las gracias a Daniel Gottschling por compartir su protocolo de fijación con nosotros.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
100% Methanol | J.T. Baker | 9070-01 | |
Tissue-Tek O.C.T. Compound | Andwin Scientific | 4583 | |
Whatman Grade No. 541 Quantitative Filter Paper | Whatman | 1541-047 | |
Millipore-MF Membrane Filter | Millipore | HAWP04700 | |
Cryostat | Leica | CM 1510 S |