Framhjärna Elektrofysiologiska inspelning i larver Zebrafish
Summary
En enkel metod för att spela in extracellulära fält potentialer i larver zebrafisk framhjärnan beskrivs. Metoden ger en robust<em> In vivo</em> Avläsning av beslag-liknande aktivitet. Denna teknik kan användas med genetiskt modifierade zebrafisk larver bär epilepsi-relaterade gener eller kramper framkallade genom administrering av konvulsiva läkemedel.
Abstract
Epilepsi drabbar nästan 3 miljoner människor i USA och upp till 50 miljoner människor över hela världen. Definierades som förekomst av spontana oprovocerade anfall, kan epilepsi förvärvas som ett resultat av en förolämpning mot hjärnan eller en genetisk mutation. Arbetet med att modellen anfall hos djur har främst utnyttjat förvärvat förolämpningar (konvulsiva läkemedel, stimulering eller hjärnskada) och genetiska manipulationer (antisens ÖVERVÄLDIGANDE, homolog rekombination eller genmodifiering) hos gnagare. Zebrafisk är ett ryggradsdjur modellsystem 1-3 som kunde ge ett värdefullt alternativ till gnagare-baserad epilepsi forskning. Zebrafisk användes i stor utsträckning i studier av vertebrat genetik eller utveckling, uppvisar en hög grad av genetisk likhet med däggdjur och uttrycka homologer för ~ 85% av kända humana enda gen epilepsi mutationer. På grund av deras lilla storlek (4-6 mm i längd), kan zebrafisk larver bibehållas i fluidvolymer så låga som 100 pl under tidig utveckling och ArraYED i multi-brunnarsplattor. Reagens kan sättas direkt till den lösning i vilken embryon utvecklas, förenkla läkemedelsadministrering och möjliggöra snabb in vivo-screening av testföreningar 4. Syntetiska oligonukleotider (morpholinos), mutagenes, zinkfinger nukleas och transgena metoder kan användas för att snabbt generera gen ÖVERVÄLDIGANDE eller mutation i zebrafisk 5-7. Dessa egenskaper ger zebrafisk studier en aldrig tidigare skådad statistisk fördel maktanalys över gnagare i studien av neurologiska sjukdomar, såsom epilepsi. Eftersom den "gyllene standarden" för epilepsi forskning är att övervaka och analysera de onormala elektriska urladdningar som har sitt ursprung i en central hjärna struktur (dvs. kramper), en metod för att effektivt registrera hjärnaktivitet i larver zebrafisk beskrivs här. Denna metod är en anpassning av konventionella extracellulära inspelningstekniker och möjliggör en stabil och långsiktig uppföljning av hjärnaktivitet i intakt zebrafisk larver. Sgott inspelningar visas för akut anfall som induceras av bad tillämpning av konvulsiva läkemedel och spontana kramper registreras i en genetiskt modifierad fisk.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den extracellulära inspelning metod som presenteras här möjliggör en mycket känslig och snabb analys av hjärnaktivitet. Dessa inspelningar är analoga med elektroencefalografiska (EEG) övervakning vanligen används för att utvärdera närvaron av onormala elektrisk urladdning (dvs. kramper) i gnagarmodeller av epilepsi 11 och patienter 12. Extracellulära inspelningar kan kombineras med farmakologiska manipulationer, som visas här. Dessa typer av inspelningar kan också användas …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författaren vill tacka Peter Castro och Matthew Dinday för deras tidiga ansträngningar för att etablera zebrafisk i laboratoriet. Detta arbete har finansierats av National Institutes of Health EUREKA bidrag (# R01NS079214-01).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Agarose low melting | Fisher-Scientific | BP1360-100 | Dissolve in embryo media at 1.2% |
| Recording media | Fisher-Scientific | BP3581, P330-3, BP410-1, BP214-500, D16-1, C77-500 | 1 mM NaCl, 2.9 mM KCl, 10 mM HEPES, 1.2 mM MgCl2, 10 mM Dextrose, 2.1 mM CaCl2 pH to approximately 7.3 with 1 N NaOH |
| Tricaine | Argent Labs | MS-222 | 0.02% |
| α-bungarotoxin | Tocris Bioscience | 2133 | 1 mg/ml |
| Capillary glass tubing | Warner Instruments | G120TF-3 | Pull to a resistance of 2 -7 MΩ |
| Patch clamp amplifier | Warner Instruments | PC-505B | We use a Warner amplifier in current-clamp mode; Gain set at 2 mV/pA and Bessel filter set at 2K. Comparable models can be used according to manufacturer’s instructions. |
| Filter/amplifier | Cygnus Technology | FLA-01 | We use a Cygnus pre-amplifier; Gain set at 10-20; Cut-off frequency set at 1-2K; Notch filter IN. Comparable models can be used according to manufacturer’s instructions. |
| Axon A/D board and Axoscope software | Molecular Devices | Axon Digidata 1320A; Axoscope 8.2 | Data is collected in Axoscope using gap-free acquisition mode; sampling at 10 kHz. Comparable models and programs can be used according to manufacturer’s instructions. |
| Egg water | Instant Ocean | 3 g Instant Ocean sea salt, 2 ml 0.1% methylene blue in 10 ml deionized water |
References
- Clark, K. J., et al. Stressing zebrafish for behavioral genetics. Reviews in Neuroscience. 22 (1), 49 (2011).
- Rinkwitz, S., et al. Zebrafish: an integrative system for neurogenomics and neurosciences. Progress in Neurobiology. 93 (2), 231 (2011).
- Penberthy, W. T., et al. The zebrafish as a model for human disease. Frontiers in Bioscience. 7, d1439 (2002).
- Letamendia, A., et al. Development and validation of an automated high-throughput system for zebrafish in vivo screenings. PLoS One. 7, e36690 (2012).
- Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene ‘knockdown’ in zebrafish. Nature Genetics. 26 (2), 216 (2000).
- Haffter, P., et al. Mutations affecting development of the zebrafish inner ear and lateral line. Development. 123, 1 (1996).
- Suster, M. L., et al. Transgenesis in zebrafish with the tol2 transposon system. Methods Molecular Biology. 561, 41 (2009).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).
- Baraban, S. C., et al. Pentylenetetrazole induced changes in zebrafish behavior, neural activity and c-fos expression. Neuroscience. 131 (3), 759 (2005).
- Baraban, S. C., et al. A large-scale mutagenesis screen to identify seizure-resistant zebrafish. Epilepsia. 48 (6), 1151 (2007).
- Williams, P., et al. The use of radiotelemetry to evaluate electrographic seizures in rats with kainate-induced epilepsy. Journal of Neuroscience Methods. 155 (1), 39 (2006).
- Marsh, E. D., et al. Interictal EEG spikes identify the region of electrographic seizure onset in some, but not all, pediatric epilepsy patients. Epilepsia. 51 (4), 592 (2010).
- Zhu, C., et al. Evaluation and application of modularly assembled zinc-finger nucleases in zebrafish. Development. 138 (20), 4555 (2011).
