Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

सेल संस्कृति में शाही सेना संश्लेषण, प्रसंस्करण और क्षय के उच्च संकल्प जीन एक्सप्रेशन प्रोफाइलिंग के लिए नव लिखित आरएनए की मेटाबोलिक लेबल

Published: August 8, 2013 doi: 10.3791/50195
Automatic Translation
*1, *2, 1, 3, 1, 2
1Max von Pettenkofer Institute, 2Department of Medicine, University of Cambridge, 3Institute for Informatics, Ludwig-Maximilians-University Munich
* These authors contributed equally

Summary

कुल सेलुलर शाही सेना अल्पकालिक शाही सेना संश्लेषण और क्षय में परिवर्तन के साथ ही शाही सेना प्रसंस्करण के कैनेटीक्स के अध्ययन के लिए एक गरीब टेम्पलेट प्रदान करता है. यहाँ, हम 4 thiouridine साथ नव लिखित आरएनए की चयापचय लेबलिंग का वर्णन इन सीमाओं को पार करने की अनुमति नव लिखित आरएनए की thiol विशेष biotinylation और शुद्धि द्वारा पीछा किया.

Abstract

पूरे transcriptome प्रोटीन और अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के विकास सेलुलर जीन अभिव्यक्ति की जटिलता की हमारी समझ में क्रांति ला दी है. इसमें शामिल आणविक तंत्र की एक बेहतर समझ के साथ साथ, अंतर्निहित कैनेटीक्स के सटीक मापन तेजी से महत्वपूर्ण बन गए हैं. इधर, इन शक्तिशाली तरीके टेम्पलेट नमूने वे अध्ययन, यानी कुल सेलुलर शाही सेना के आंतरिक गुणों के कारण प्रमुख सीमाओं का सामना. कई मामलों में कुल सेलुलर शाही सेना में बदलाव के लिए पर्याप्त संकल्प के साथ अंतर्निहित आणविक घटनाओं और उनके कैनेटीक्स का प्रतिनिधित्व करने के लिए या तो बहुत धीरे धीरे या भी जल्दी होते हैं. इसके अलावा, शाही सेना संश्लेषण, प्रसंस्करण, और क्षय में परिवर्तन के योगदान को आसानी से भेदभाव नहीं कर रहे हैं.

हमने हाल ही में इन सीमाओं को पार करने के लिए उच्च संकल्प जीन अभिव्यक्ति की रूपरेखा विकसित. हमारा दृष्टिकोण 4 thiouri साथ नव लिखित आरएनए की चयापचय लेबलिंग पर आधारित हैभोजन (इस प्रकार भी 4sU टैगिंग के रूप में) thiol विशेष biotinylation और streptavidin लेपित चुंबकीय मोतियों का उपयोग नव लिखित शाही सेना के कठोर शुद्धि द्वारा पीछा किया. यह रीढ़, ड्रोसोफिला, और खमीर सहित जीवों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए लागू है. हम सफलतापूर्वक, प्रतिलेखन कारक गतिविधियों की वास्तविक समय कैनेटीक्स अध्ययन आरएनए आधा जीवन की सटीक मापन प्रदान करते हैं, और शाही सेना प्रसंस्करण के कैनेटीक्स में उपन्यास अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए 4sU टैगिंग लागू. अंत में, कम्प्यूटेशनल मॉडलिंग अंतर्निहित आणविक तंत्र का एक एकीकृत, व्यापक विश्लेषण उत्पन्न करने के लिए नियोजित किया जा सकता है.

Introduction

जीन अभिव्यक्ति की रूपरेखा सेलुलर प्रक्रियाओं और जुड़े जटिल बातचीत नेटवर्क का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल एक महत्वपूर्ण उपकरण है. MRNA के बहुतायत पर अध्ययन आमतौर पर अंतर्निहित आणविक तंत्र में बुनियादी अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए पसंद की विधि से किया गया है. पूरे transcriptome प्रोटीन 1 और, आरएनए (आरएनए सेक) 2-4 से अधिक हाल ही में, अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के विकास के इस दृष्टिकोण को शह. इन प्रौद्योगिकियों सेलुलर जीन अभिव्यक्ति की जटिलता की हमारी समझ में क्रांति ला दी है, वहीं वे अपने टेम्पलेट नमूना के आंतरिक गुणों, यानी कुल सेलुलर शाही सेना के कारण प्रमुख सीमाओं का सामना. कुल शाही सेना के स्तर में प्रथम, अल्पकालिक परिवर्तन प्रतिलेखन दरों में परिवर्तन से मेल, लेकिन शाही सेना संबंधित टेप के आधे जीवन पर स्वाभाविक निर्भर नहीं कर रहे हैं. एक प्रतिलेखन कारक के लिए एक अल्पकालिक प्रतिलिपि, जैसे एन्कोडिंग की एक पांचगुना प्रेरण, कुल शाही सेना में आसानी से पता लगाने योग्य हो जाएगाएक घंटे के भीतर, एक चयापचय एंजाइम के लिए एक लंबे समय रहते प्रतिलिपि, जैसे एन्कोडिंग का एक ही प्रेरण, लगभग अदृश्य रहेगा. इसके अलावा, यह भी एक बंद नीचे (> 1,000 गुना नीचे विनियमन) एक शाही सेना के पांच घंटे के आधे जीवन के साथ एक औसत जीन प्रतिलेखन दर में पूरी बस केवल दुगना से कम करने के लिए अपने कुल शाही सेना के स्तर के लिए पांच घंटे लगेंगे . इसलिए, कुल शाही सेना के विश्लेषण विनियामक कार्यों 5 के साथ प्रतिलेखन कारक और जीनों के लिए सांकेतिक शब्दों में बदलना, जिनमें से कई अल्पकालिक टेप के ऊपर विनियमन का पता लगाने के पक्ष में है. इसके अलावा, विनियमन का सच गतिज झरना छिप जाता है और प्राथमिक संकेत घटनाओं माध्यमिक से भेदभाव नहीं किया जा सकता. दोनों, बारी में, बहाव के जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण में पर्याप्त पूर्वाग्रह में हो सकता है. दूसरा, कुल शाही सेना के स्तर में परिवर्तन शाही सेना संश्लेषण या क्षय में परिवर्तन के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता. बाद के माप transcripti अवरुद्ध सेल आक्रामक दृष्टिकोण, जैसे की आवश्यकताactinomycin डी 6, और समय के साथ चल रही शाही सेना क्षय की विस्तारित निगरानी के प्रयोग पर. 5 के स्तनधारी कोशिकाओं में एक मतलब mRNA के आधे जीवन के साथ - 10 घंटा 5,7, सबसे जीन की mRNA स्तर केवल दुगना ट्रांसक्रिप्शनल गिरफ्तारी के कई घंटे निम्न से कम से कम होगा. ये बल्कि छोटे मतभेदों अंतर्निहित गणितीय समीकरणों के घातीय प्रकृति की वजह से सेलुलर जीनों के बहुमत के लिए mRNA आधा जीवन की निहायत imprecise माप में परिणाम. अंत में, जबकि कुल सेलुलर शाही सेना के आरएनए seq के हमारे जीन में से आधे से लगभग वैकल्पिक splicing घटनाओं 8, अंतर्निहित कैनेटीक्स के साथ ही बुरा समझा रहते आरएनए प्रसंस्करण के ऊतक और संदर्भ विशेष विनियमन मार्गदर्शक गतिशील तंत्र के अधीन हैं कि पता चला. इसके अलावा, शाही सेना का योगदान विशेष रूप से गैर कोडन RNAs के लिए, निर्धारित किया है, अंतर जीन की अभिव्यक्ति के लिए संसाधन. कुल मिलाकर, इन सीमाओं के लिए प्रमुख बाधाओं का प्रतिनिधित्वअंतर्निहित आणविक तंत्र की bioinformatic गतिज मॉडलिंग.

हमने हाल ही में इन समस्याओं 5,7,9 काबू पाने के लिए, कहा जाता है उच्च संकल्प जीन अभिव्यक्ति की रूपरेखा, एक दृष्टिकोण विकसित किया है. यह 4 thiouridine (4sU टैगिंग), एक स्वाभाविक रूप से होती uridine व्युत्पन्न का उपयोग नव लिखित आरएनए की चयापचय लेबलिंग के आधार पर, और सेल के विकास और जीन अभिव्यक्ति में कम से कम हस्तक्षेप (चित्रा 1 देखें) 5 के साथ नव लिखित टेप के लिए सीधी पहुँच प्रदान करता है 10-12. इसकी तेजी से तेज, 4sU-ट्रायफ़ोस्फेट को phosphorylation, और नव लिखित शाही सेना में शामिल करने में 4sU परिणाम के लिए कोशिकाओं का एक्सपोजर. कुल सेलुलर शाही सेना के अलगाव के बाद, 4sU लेबल शाही सेना अंश thiol विशेष रूप बायोटिन और नव लिखित शाही सेना के बीच एक डाइसल्फ़ाइड बांड पैदा biotinylated है. 'कुल सेलुलर आरएनए' तो मात्रात्मक ('नव लिखित') और unlabeled ('पूर्व existin लेबल में विभाजित किया जा सकता हैstreptavidin लेपित चुंबकीय मोतियों का उपयोग उच्च शुद्धता के साथ जी ') आरएनए. अंत में, लेबल शाही सेना बस डाइसल्फ़ाइड बांड cleaving एक कम करने एजेंट (जैसे dithiothreitol) को जोड़ने और मोतियों से नव लिखित आरएनए रिहा द्वारा मोतियों से बरामद किया है.

नव लिखित आरएनए 4sU जोखिम की समय सीमा के दौरान हर जीन के transcriptional गतिविधि को दर्शाया गया है. मिनट के timescale में 4sU टैगिंग इस प्रकार यूकेरियोटिक जीन अभिव्यक्ति का एक स्नैपशॉट चित्र और डाउन स्ट्रीम bioinformatic विश्लेषण करती है (उदाहरण के प्रमोटर विश्लेषण) के लिए एक आदर्श टेम्पलेट प्रदान करता है. स्थिर राज्य की स्थिति माना जा सकता है जहां मामलों में, के अनुपात नव लिखित / कुल, नव लिखित / unlabeled और unlabeled / कुल शाही सेना सटीक आरएनए आधा जीवन 7,13 करने के लिए गैर इनवेसिव पहुँच प्रदान करते हैं. इसके अलावा, यह 4sU टैगिंग के रूप में छोटे रूप में 5 मिनट (5 मिनट 4sU-आरएनए) के बाद शुद्ध कि नव लिखित आरएनए नोट करना महत्वपूर्ण है 15 और 60 मिनट 4sU-शाही सेना की तुलना में छोटी है.आरएनए seq के साथ संयुक्त एक भी प्रयोगात्मक सेटिंग में 4sU टैगिंग अति लघु और उत्तरोत्तर अब दोनों प्रदर्शन, आरएनए प्रसंस्करण के कैनेटीक्स न्यूक्लियोटाइड संकल्प 9 में पता चला रहे हैं. अंत में, कम्प्यूटेशनल मॉडलिंग के साथ संयुक्त नव लिखित और कुल शाही सेना के समय पाठ्यक्रम विश्लेषण शाही सेना संश्लेषण और क्षय 14 के एक एकीकृत विश्लेषण अनुमति देते हैं.

अंत में, इस दृष्टिकोण कोशिकाओं में शाही सेना संश्लेषण, प्रसंस्करण, और गिरावट की गतिशीलता के प्रत्यक्ष विश्लेषण के लिए अनुमति देता है. यह स्तनधारी, कीड़े (ड्रोसोफिला), उभयचर (Xenopus), और खमीर 5,15,16 सहित सभी प्रमुख मॉडल जीवों में लागू है. यह माइक्रोएरे विश्लेषण 5,17, आरएनए seq के 9,13,14 साथ सीधे संगत है, और इन विवो 12,15 में लागू है. यहाँ, हम विस्तार पद्धति, लेबल को अलग, और सुसंस्कृत स्तनधारी कोशिकाओं में नव लिखित आरएनए को शुद्ध करने के लिए. इसके अलावा, potenti मेंअल समस्याओं और नुकसान पर चर्चा कर रहे हैं.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. 4 thiouridine साथ मेटाबोलिक लेबल

प्रयोगात्मक सेटअप / निर्धारित समय से एक विस्तृत योजना बनाओ, सेल संस्कृति को 4sU जोड़ने के लिए जब और नमूने फसल के लिए जब उदा. हर हालत के बीच में कम से कम 5 मिनट के लिए योजना. केवल एक बार में एक ही हालत की कोशिकाओं का इलाज. अधिकतम संभाल लेना. 3 - एक निश्चित समय पर 5 व्यंजन. तापमान और सीओ 2 के स्तर में परिवर्तन को कम करने के रूप में जल्दी संभव के रूप में कोशिकाओं को संभाल लेना. इस सेलुलर प्रोटीन को 4sU लेबल शाही सेना की crosslinking में हो सकता है के रूप में 4sU जोड़ा जाता है के बाद चमकदार रोशनी के लिए कोशिकाओं को प्रकाश में लाने से बचें.

लेबलिंग का प्रारंभ

  1. पिघलना 4 thiouridine (4sU) सिर्फ एक बाँझ फाल्कन ट्यूब में हर हालत के लिए 4sU के उपयोग और पिपेट आवश्यक राशि से पहले.
  2. व्यंजन बंद सेल संस्कृति के माध्यम से आवश्यक राशि (10 सेमी पकवान प्रति 5 एमएल) ले लो और 4sU युक्त फाल्कन ट्यूब को जोड़ने और मिश्रण अच्छी तरह से. निकालें और बर्तन से शेष मध्यम त्यागें.
    3. <ली> बर्तन को 4sU युक्त मध्यम वापस लागू करें.

लेबलिंग का अंत

  1. सेल से सेल संस्कृति के माध्यम से निकालें. प्रत्येक थाली को Trizol के 5 मिलीलीटर जोड़ें. कई बार अंक या शर्तों सहित जटिल प्रयोगों के लिए, इस कदम का सबसे अच्छा दो लोग, मध्यम, Trizol जोड़ने और lysate कटाई अन्य को हटाने के एक द्वारा किया जाता है.
  2. पूरा सेल के लिए कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए सेते हैं.
  3. जोड़ा Trizol साथ सावधानी से प्लेट कुल्ला करने के लिए एक 10 मिलीलीटर विंदुक का प्रयोग करें. यह पूरा सेल और नमूना वसूली एड्स. त्वचा या आंखों के साथ संपर्क में हो रही है जब Trizol बेहद खतरनाक है के रूप में देखभाल के साथ संभाल! हाथ में फिनोल जलता (जैसे पॉलिथिलीन ग्लाइकोल 300 या औद्योगिक methylated आत्माओं (70:30) में 400) के लिए मारक है. Polypropylene ट्यूब के लिए नमूने स्थानांतरण. मानक फाल्कन ट्यूब) इन उच्च छ बलों का विरोध नहीं करते हैं कि कृपया ध्यान दें. नमूने मैं कुल शाही सेना जब तक कम से कम एक महीने के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता हैहै तैयार.

2. संशोधित Trizol प्रोटोकॉल का प्रयोग आरएनए तैयारी

  1. 1 मिलीलीटर क्लोरोफॉर्म (मिलीलीटर Trizol प्रति 0.2 मिलीग्राम) जोड़ें और 15 सेकंड के लिए सख्ती से हिला. 3 मिनट - 2 के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं.
  2. 4 में 15 मिनट के लिए 13,000 × जी पर अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस
  3. एक नया 15 मिलीलीटर polypropylene ट्यूब जलीय ऊपरी चरण (आरएनए युक्त) स्थानांतरण.
  4. जोड़ें साढ़े शाही सेना तेज़ी बफर और isopropanol दोनों की प्रतिक्रिया मात्रा (3 मिलीग्राम तैरनेवाला जैसे 1.5 मिलीलीटर शाही सेना तेज़ी बफर और 1.5 मिलीलीटर isopropanol जोड़ने).
  5. अच्छी तरह से मिलाएं. 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं.
  6. 4 में 10 मिनट के लिए 13,000 × जी पर अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस सतह पर तैरनेवाला त्यागें.
  7. संक्षेप में स्पिन (5000 × छ 30 सेकंड के लिए) और 200 μl विंदुक के साथ अवशिष्ट isopropanol हटा दें.
  8. 75% इथेनॉल के एक बराबर मात्रा में जोड़ें और गोली detaches तक ट्यूब हिला. Residua के इस रूप में कई छोटे टुकड़ों में तोड़ने से बचने के लिए कर सकते हैं हटानेएल इथेनॉल मुश्किल.
  9. 4 में 10 मिनट के लिए 13,000 × जी पर अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस सतह पर तैरनेवाला त्यागें.
  10. संक्षेप में शाही सेना स्पिन और एक 200 μl विंदुक के साथ शेष इथेनॉल हटा दें. एक 20 μl विंदुक के साथ शेष इथेनॉल कदम और हटाने दोहराएँ. इन दो चरणों के बाद, गोली के आगे नहीं सूखने प्रदर्शन किया जाना चाहिए.
  11. 100 ग्राम उम्मीद शाही सेना उपज प्रति एच 2 ओ के 100 μl जोड़ें और 5 नीचे pipetting और अच्छी तरह से मिश्रण - 6 बार शाही सेना को भंग करने में सहायता करने के लिए.
  12. भंग और 65 से हीटिंग द्वारा शाही सेना denature डिग्री सेल्सियस 10 मिनट (एक प्रकार के बरतन) के लिए और तुरंत बर्फ पर जगह है.
  13. निर्माता के निर्देशों का पालन, एक NanoDrop स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग 260 एनएम एकाग्रता शाही सेना के उपाय. इस शाही सेना के कम से कम एक महीने के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है.

3. नव लिखित आरएनए की thiol विशेष Biotinylation

  1. 60 से शुरू करें - कुल सेलुलर शाही सेना की 80 ग्राम.
  2. प्रतिक्रिया लेबलिंग का गठन. निम्नलिखित में पिपेटआदेश (प्रति ग्राम आरएनए):
    1. 1 μl 10x Biotinylation बफर
    2. 7 μl आरएनए (nuclease मुक्त एच 2 ओ में पतला 1 ग्राम आरएनए युक्त)
    3. 2 μl बायोटिन HPDP (1 मिलीग्राम / एमएल DMF)

हमेशा बायोटिन HPDP पिछले जोड़ने और pipetting द्वारा तुरंत मिश्रण. बायोटिन precipitates मामले में, DMF सामग्री 40% की एक अंतिम एकाग्रता के लिए बढ़ाया जा सकता है.

  1. रोटेशन के साथ 1.5 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं.
  2. क्लोरोफॉर्म के एक बराबर मात्रा में जोड़ें. सख्ती से मिलाएं. चरणों को अलग करने के लिए शुरू और बुलबुले गायब शुरू तक 3 मिनट - 2 के लिए सेते हैं.
  3. 4 डिग्री सेल्सियस से कम 5 मिनट के लिए 20,000 × छ पर अपकेंद्रित्र ध्यान से एक नया ट्यूब में ऊपरी जलीय चरण हस्तांतरण.
  4. एक बार कदम 3.4 और 3.5 दोहराएँ. आप शाही सेना के नुकसान को कम करने के लिए 2 मिलीलीटर चरण लॉक जेल भारी ट्यूबों में इस चरण को पूरा करने के लिए चाहते हो सकता है.
  5. शाही सेना तेज़ी: ऐड 1/10 5 एम NaCl की मात्रा और के एक बराबर मात्रापानी चरण के लिए isopropanol.
  6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 20,000 × छ पर अपकेंद्रित्र सतह पर तैरनेवाला त्यागें.
  7. सतह पर तैरनेवाला त्यागें, 4 में 10 मिनट डिग्री सेल्सियस के लिए 20,000 से कम 75% इथेनॉल, सेंट्रीफ्यूज के एक बराबर मात्रा × छ जोड़ें.
  8. संक्षेप में स्पिन और 200 μl विंदुक के साथ अवशिष्ट इथेनॉल हटा दें.
  9. संक्षेप में स्पिन और 20 μl विंदुक के साथ अवशिष्ट इथेनॉल हटा दें.
  10. शाही सेना शुष्क करने की अनुमति न दें. 50 में यह फिर से निलंबित - 100 μl एच 2 ओ (1 ग्राम इनपुट शाही सेना के प्रति ~ 1 μl). 6 बार - 5 नीचे pipetting और से अच्छी तरह से मिलाएं.
  11. आरएनए गिरावट को बाहर करने electrophoretical विश्लेषण से शाही सेना गुणवत्ता की जाँच करें.

4. 4sU-समावेश की डॉट ब्लाट विश्लेषण (वैकल्पिक)

4sU समावेश आसानी biotinylated शाही सेना की डॉट धब्बा विश्लेषण द्वारा निर्धारित किया जा सकता है. इस मुसीबत शूटिंग और एक biotinylated डीएनए oligo नियंत्रण के सापेक्ष 4sU समावेश दरों के आकलन की अनुमति देता है कि एक वैकल्पिक कदम है. इस परख हम अनुसंधान के लिए3.2 कदम में 4sU लेबल शाही सेना के biotinylation के बजाय बायोटिन HPDP की iodoacetyl बायोटिन उपयोग कर ecommend. 4sU-शाही सेना के एक अपरिवर्तनीय biotinylation में यह परिणाम है. इसलिए, स्तंभ आधारित विधियों (जैसे RNeasy) biotinylated शाही सेना की बहुत छोटी मात्रा में (उदाहरण के लिए 5 ग्राम) की वसूली के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. शाही सेना भी इस परख के लिए उपयुक्त है बायोटिन HPDP उपयोग कर biotinylated जबकि, जिसके परिणामस्वरूप संकेत (चित्रा 3) कमजोर और संकेत से शोर अनुपात कम अनुकूल है.

  1. वर्गों 1 और 2 में वर्णित के रूप में कुल सेलुलर शाही सेना के 4sU लेबलिंग और अलगाव के लिए प्रोटोकॉल का पालन करें.
  2. Iodoacetyl बायोटिन साथ बायोटिन HPDP की जगह धारा 3 में वर्णित है और पूरी तरह से अत्यधिक iodoacetyl बायोटिन अवशेषों को हटाने के लिए दो क्लोरोफॉर्म extractions के प्रदर्शन के रूप में Biotinylate आरएनए 4sU लेबल.
  3. वर्णित या मामले आरएनए की छोटी मात्रा में (में (जैसे RNeasy) एक स्तंभ आधारित दृष्टिकोण का उपयोग कर के रूप में isopropanol / इथेनॉल तेज़ी से biotinylated शाही सेना की वसूली <10 ग्राम) का इस्तेमाल कर रहे हैं.
  4. 10 मिनट के लिए कमाल के साथ nuclease मुफ्त पानी में जेटा झिल्ली सेते हैं.
  5. Nuclease मुक्त पानी से बाहर झिल्ली लो और दो साफ कागज तौलिए और मजबूती से दबाने के बीच में झिल्ली रखकर अत्यधिक तरल पदार्थ को हटा दें. एयर सुखाने 5 मिनट के लिए झिल्ली अच्छे डॉट्स का परिणाम देगा.
  6. प्रत्येक नमूने के लिए, बर्फ के ठंडे डॉट धब्बा बाध्यकारी बफर (10 मिमी NaOH, 1 मिमी EDTA) का उपयोग कर 200 μl / एनजी शाही सेना के 20 μl तैयार करते हैं. Pipetting द्वारा जेटा झिल्ली को इस कमजोर पड़ने के 5 μl (आरएनए यानी 1 ग्राम) के साथ ही तीन बाद 10 गुना dilutions (क्रमशः यानी 100, 10, और 1 एनजी शाही सेना,) लागू करें. पिपेट सुझावों में से एक खाली रैक के माध्यम से pipetting समान रूप से वितरित रिक्ति प्रदान करने के लिए नियोजित किया जा सकता है. वैकल्पिक रूप से, निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक डॉट धब्बा उपकरण का उपयोग करें.
  7. एक सकारात्मक ऑन के रूप में 20 से μl / एनजी 20 स्नातकोत्तर / μl (यानी 100-0.1 एनजी oligo) को लेकर सांद्रता में बायोटिन लेबल डीएनए oligo के 5 μl लागू करेंpipetting द्वारा झिल्ली को rol. नकारात्मक नियंत्रण के रूप में एक biotinylated, 4sU अनुभवहीन नमूना प्रयोग करें.
  8. एयर सूखे के 5 मिनट के लिए झिल्ली.
  9. कमाल के साथ 40 मिलीलीटर अवरुद्ध बफर में 30 मिनट के लिए झिल्ली सेते हैं.
  10. 15 मिनट (5 मिलीलीटर पीबीएस + 5 मिलीलीटर 20% एसडीएस + 10 μl streptavidin-हॉर्सरैडिश peroxidase) के लिए 1:1,000 streptavidin-हॉर्सरैडिश peroxidase की 10 मिलीलीटर के साथ झिल्ली सेते
  11. 5 मिनट के लिए 40 मिलीलीटर पीबीएस + 10% एसडीएस (20 मिलीलीटर पीबीएस + 20 मिलीलीटर 20% एसडीएस) में दो बार झिल्ली धो लें.
  12. 40 मिलीलीटर पीबीएस में दो बार झिल्ली धो 5 मिनट के लिए 1% एसडीएस (38 मिलीलीटर पीबीएस + 2 मिलीलीटर 20% एसडीएस).
  13. 40 मिलीलीटर पीबीएस में दो बार झिल्ली धो 5 मिनट के लिए + 0.1% एसडीएस (40 मिलीलीटर पीबीएस + 200 μl 20% एसडीएस).
  14. दो साफ कागज तौलिये के बीच में झिल्ली रखने और मजबूती से उन पर दबाव द्वारा अत्यधिक तरल निकालें.
  15. निर्माता के निर्देशों के अनुसार ईसीएल का उपयोग कर झिल्ली ही सीमित एचआरपी कल्पना.
  16. प्लास्टिक की पन्नी / बैग में झिल्ली, जगह हवाई बुलबुले को दूर करने और अंधेरे में 2 मिनट के लिए सेते हैं.
  17. झिल्ली को बेनकाब1 के लिए फिल्म - 5 मिनट.

5. Streptavidin लेपित चुंबकीय मोती का उपयोग लेबल और unlabeled शाही सेना के पृथक्करण

  1. हीट डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में 65 को (नमूना प्रति 3 मिलीग्राम) बफर धोने.
  2. Nuclease मुक्त एच 2 ओ में ताजा 100 मिमी dithiothreitol (डीटीटी) तैयार करें अल्ट्रा ठीक पैमाने पर रखा एक साफ 50 मिलीलीटर फाल्कन ट्यूब में डीटीटी पाउडर के 30 मिलीग्राम - 15 decanting से ऐसा करते हैं. Nuclease मुक्त एच 2 ओ के लिए आवश्यक राशि वजन और जोड़
  3. हीट डिग्री सेल्सियस 10 denature के लिए न्यूनतम और बर्फ पर तुरंत जगह के लिए 65 को शाही सेना के नमूने biotinylated.
  4. जगह चुंबकीय स्टैंड में कॉलम μMacs. हम एक समय में 12 से अधिक नमूने (- 8 नमूने इष्टतम हैं 6) की प्रक्रिया के लिए नहीं की सलाह देते हैं.
  5. 1 मिलीलीटर कमरे के तापमान बफर धोने के साथ पूर्व संतुलित Miltenyi कॉलम. इस बारे में 15 मिनट का समय लगेगा.
  6. इस बीच, 50 को streptavidin मोतियों की 100 μl जोड़ने - biotinylated शाही सेना के 100 μl. रोटेशन के साथ 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं.
    7. < ली> स्तंभों में से कोई अब तक draining शुरू नहीं किया है, तो यह धीरे एक दस्ताने उंगली के साथ स्तंभ के शीर्ष पर दबाने से मदद की जा सकती. एक बार प्रवाह कॉलम आसानी से पलायन शुरू कर दिया है.
  7. कॉलम को शाही सेना / मोती लागू करें. प्रवाह के माध्यम से आप unlabeled आरएनए अंश (धारा 7 देखें) ठीक करना चाहते जब तक त्यागें.
  8. 0.9 के 65 मिलीलीटर डिग्री सेल्सियस धोने बफर (65 डिग्री सेल्सियस पर बफ़र्स pipetting जब 1 मिलीलीटर विंदुक युक्तियाँ हटना). के साथ तीन बार धोएं
  9. 0.9 मिलीलीटर कमरे के तापमान बफर धोने के साथ तीन बार धोएं.
  10. पिपेट 700 μl बफर नया 2 मिलीलीटर ट्यूबों में RLT (RNeasy MinElute सफाई किट, Qiagen) और स्तंभ के नीचे रख दें.
  11. कॉलम को 100 मिमी डीटीटी के 100 μl जोड़कर RLT बफर में नव लिखित आरएनए Elute.
  12. 100 मिमी डीटीटी का एक और 100 μl जोड़कर बाद ही ट्यूब में एक दूसरे क्षालन दौर 3 मिनट प्रदर्शन करना.

6. नव लिखित शाही सेना की वसूली

ontent "> निर्माता के निर्देशों का पालन RNeasy MinElute क्लीनअप (Qiagen) प्रोटोकॉल के साथ जारी रखें. 25 μl nuclease मुक्त एच 2 ओ उपाय शाही सेना सांद्रता में Elute एक Nanodrop स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग कर. प्रस्तुत करने से पहले शाही सेना पिघलना और फिर से फ्रीज करने के लिए जरूरत से बचने के लिए यह एक उच्च throughput परख करने के लिए, हम तुरंत नव लिखित आरएनए के बाद सीडीएनए की तैयारी की सिफारिश शुद्ध होता है. निर्माता के निर्देशों का पालन सीडीएनए संश्लेषण के लिए 20 μl सीडीएनए संश्लेषण मिश्रण में नव लिखित आरएनए के 2.5 μl का प्रयोग करें. 1 का उपयोग QRT-पीसीआर नियंत्रण का प्रदर्शन करना : सीडीएनए मिश्रण के 10 dilutions के -80 पर स्टोर आरएनए डिग्री सेल्सियस.

7. लेबल न किए गए, अपार शाही सेना (वैकल्पिक) की वसूली

मामले में अपार शाही सेना बरामद होने की जरूरत है, के माध्यम से प्रवाह (स्तंभों को शाही सेना streptavidin मोती समाधान जोड़ने के बाद) और बाद में वर्षा के लिए पहले धो इकट्ठा करने और गठबंधन. आमतौर पर थी के रूप में अपार शाही सेना का केवल 50% वेग के लिए पर्याप्त हैएस सामग्री शुरू की> 80% शामिल होंगे.

  1. Isopropanol के एक बराबर मात्रा में जोड़ें (कोई नमक धोने बफर पहले से ही 1 एम NaCl होता है के रूप में जोड़ा जाना चाहिए).
  2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 20,000 × छ पर अपकेंद्रित्र सतह पर तैरनेवाला त्यागें.
  3. सतह पर तैरनेवाला त्यागें, 4 में 10 मिनट डिग्री सेल्सियस के लिए 20,000 से कम 75% इथेनॉल, सेंट्रीफ्यूज के एक बराबर मात्रा × छ जोड़ें.
  4. संक्षेप में स्पिन और 200 μl विंदुक के साथ अवशिष्ट इथेनॉल हटा दें.
  5. संक्षेप में स्पिन और 20 μl विंदुक के साथ अवशिष्ट इथेनॉल हटा दें.
  6. शाही सेना शुष्क करने की अनुमति न दें. 100 μl एच 2 ओ में यह Resuspend 6 बार - 5 नीचे pipetting और से अच्छी तरह से मिलाएं. झटकों के साथ 10 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं और बर्फ के लिए सीधे हस्तांतरण.
  7. आरएनए गिरावट को बाहर करने electrophoretical विश्लेषण से शाही सेना गुणवत्ता की जाँच करें.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

1. शुरू सामग्री और अपेक्षित पैदावार

4sU जोखिम के 1 घंटे (एचआर) के बाद नव लिखित आरएनए 1 के बारे में प्रतिनिधित्व करता है - कुल सेलुलर शाही सेना के 4%. वे अब सेल के विकास / प्रतिकृति के लिए खाते में शाही सेना synthesize के रूप में इस विकास को गिरफ्तार कोशिकाओं में कम हो जाएगा. कुल शाही सेना के 80 ग्राम - 1 घंटे के लिए लेबलिंग, जब हम 60 के साथ परख शुरू करने की सिफारिश. Biotinylation कदम के बाद देखने के लिए मेहनत कर रहे हैं कि छोटे आरएनए छर्रों में कुल शाही सेना के परिणाम की कम से कम 30 ग्राम के साथ शुरू करने और इस तरह आसानी से खो दिया जा सकता है. इनपुट शाही सेना के स्तर लेबलिंग की बहुत कम durations (- 10 मिनट जैसे 5) के रूप में ज्यादा के रूप में 150 ग्राम तक बढ़ाया जा सकता है. शाही सेना लेबलिंग की अवधि 1 घंटा के लिए 5 मिनट ~ 60% से ~ 80% 9 से नव लिखित आरएनए बढ़ता में अल्पकालिक intronic दृश्यों के योगदान से छोटा होता है. इंट्रोन्स अब काफी हद तक दृश्यों कोडिंग के साथ ही 5'-और 3'-UTRs की तुलना कर रहे हैं, की राशि नव लिखितकम या यहां तक ​​कि अति लघु 4sU टैगिंग का पालन शुद्ध किया जा सकता है, जो शाही सेना, रैखिक नहीं छोड़ देता है. जैसे, हम गैर पक्षपाती मानव बी सेल लाइनों 9 में 4sU टैगिंग के 5 मिनट के बाद कुल शाही सेना के> 0.5% प्राप्त की. यह, हालांकि, लेबलिंग के 4sU और थोड़ा अब durations के उच्च एकाग्रता पक्षपाती कोशिकाओं में समान 4sU समावेश दर को प्राप्त करने के लिए आवश्यक हो सकता है कि ध्यान दिया जाना चाहिए. यहां तक कि एक कम 4sU-समावेश दर की अनुमति होगी जबकि बड़े, uridine युक्त टेप के कुशल पकड़ने और शुद्धि, कम uridine सामग्री के साथ बहुत ही कम प्रतिलेख (जैसे miRNAs) उच्च 4sU सांद्रता (> 1 मिमी) का उपयोग भी जब शुद्धि भागने की संभावना है. 5 100 न्यूक्लियोटाइड (NT) - एनआईएच 3T3 murine fibroblasts में, 200 माइक्रोन 4sU जोखिम के 1 घंटा 50 प्रति 4sU एक के बारे में छाछ के साथ नव लिखित आरएनए लेबल. लंबाई में 1000 NT के - इस टेप> 500 की अत्यधिक कुशल वसूली की अनुमति चाहिए. तदनुसार, हम केवल एक मामूली प्रतिलिपि आकार मनायाmurine fibroblasts और मानव कोशिकाओं बी 7 दोनों में 200 माइक्रोन 4sU का उपयोग करते हुए 1 घंटे के लिए लेबलिंग जब पूर्वाग्रह. 200 माइक्रोन 4sU की 1 घंटा murine fibroblasts, ≥ 200 माइक्रोन 4sU कोशिकाओं की लंबे समय तक निवेश में सेलुलर टेप के स्तर में कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन में परिणाम नहीं था जबकि 24 घंटा (अप्रकाशित डेटा) के भीतर एक औसत दर्जे का विकास घाटे में परिणाम है. इसलिए, लेबलिंग की अवधि और 4sU एकाग्रता कार्यरत दोनों अस्थानिक या विषाक्त प्रभाव से बचने के लिए कम से कम किया जाना चाहिए. नव लिखित शाही सेना के कुशल वसूली के लिए आवश्यक 4sU एकाग्रता न्यूनतम निर्धारित करने के लिए एक आसान तरीका 4sU की बढ़ती सांद्रता (- 1600 माइक्रोन जैसे 50) के साथ 4sU लेबलिंग का पालन नव लिखित आरएनए को शुद्ध करने के लिए है. जैसा कि आंकड़े में दिखाया 2A और 2 बी, प्राथमिक मानव fibroblasts में 1 घंटे के लिए लेबल नव लिखित शाही सेना की वसूली 50 से 4sU 200 माइक्रोन के लिए काफी वृद्धि हुई लेकिन फिर पठार शुरू कर दिया.

2. डॉट4sU निगमन (वैकल्पिक) की मात्रा ब्लाट

कुछ मामलों में यह कुल शाही सेना में 4sU समावेश की मात्रा को मापने के लिए ब्याज की हो सकती है. यह सबसे अच्छा एक streptavidin साधना का उपयोग कर biotinylated शाही सेना पर डॉट धब्बा विश्लेषण द्वारा किया जाता है. इसकी रासायनिक प्रकृति के कारण iodoacetyl बायोटिन नव लिखित शाही सेना में लगभग सभी 4sU अवशेषों की biotinylation में जिसके परिणामस्वरूप बायोटिन HPDP से thiol समूहों को अधिक प्रतिक्रियाशील है. यह बायोटिन HDPD तरह iodoacetyl बायोटिन पानी में घुलनशील नहीं है और इस प्रकार कुशलता के रूप में बायोटिन HPDP के लिए प्रदर्शन किया क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण द्वारा हटा दिया जाता है, यह नोट करना महत्वपूर्ण है. इसलिए, समान स्थितियों की प्रतिक्रिया और सांद्रता बायोटिन HPDP का उपयोग करते समय के रूप में नियोजित किया जा सकता है. हालांकि, iodoacetyl बायोटिन प्रतिवर्ती नहीं है. यह इस प्रकार स्तंभ आधारित दृष्टिकोण में नव लिखित आरएनए की शुद्धि के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता. Iodoacetyl बायोटिन के उपयोग 4sU-समावेश यों के लिए अनुमति देता है, बायोटिन HPDP आधारित मापन दोनों पर विचार4sU-समावेश और biotinylation दक्षता. एक ही नमूने के लिए दो biotinylation अभिकर्मकों रोजगार आरएनए शामिल 4sU की biotinylation दक्षता की माप के लिए अनुमति देता है. 4sU लेबल शाही सेना के लिए बायोटिन HPDP की biotinylation दक्षता नव लिखित शाही सेना में के बारे में केवल एक 4sU तीन में अवशेष वास्तव में बायोटिन HPDP (चित्रा 3) द्वारा biotinylated संकेत है कि iodoacetyl बायोटिन की तुलना में लगभग तीन गुना कम हो रहा है. Biotinylated नियंत्रण डीएनए oligo साथ नमूना संकेत तीव्रता की तुलना करके, biotinylation घनत्व मापा जा सकता है. सबसे स्तनधारी सेल लाइनों के लिए एक सकारात्मक संकेत अभी भी 200 माइक्रोन 4sU लेबलिंग की 1 घंटा निम्नलिखित biotinylated शाही सेना की 10 एनजी में पता लगाने योग्य होना चाहिए. एक कमजोर पृष्ठभूमि संकेत unlabeled शाही सेना के सर्वोच्च एकाग्रता (1 ग्राम) के लिए आमतौर पर detectable है.

3. नव लिखित आरएनए का शोधन

नव लिखित शाही सेना की वसूली अत्यधिक क्वान हैtitative. आप एक ही शाही सेना एकाग्रता के साथ शुरू किया, तो आप सभी नमूनों के लिए नव लिखित आरएनए का एक ही मात्रा में प्राप्त करने की उम्मीद कर सकते हैं. आयुध डिपो के 260 माप के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं, जो 260 एनएम (धोने बफ़र्स से व्युत्पन्न डिटर्जेंट की मौजूदगी) - कई कॉलम आधारित assays की तरह, RNeasy MinElute किट का उपयोग कर नव लिखित आरएनए का संग्रह 230 पर अतिरिक्त अवशोषण में हो सकता है. प्रत्येक centrifugation कदम के लिए एक ताजा 2 मिलीलीटर संग्रह ट्यूब का उपयोग करते हैं तो यह एक हद तक कम करने के लिए देखा जाता है. फिर भी, किसी भी अनुचित रूप से उच्च आयुध डिपो माप (अन्य नमूनों से> 2 गुना अधिक) आयुध डिपो 260/280 अनुपात <1.7 कर रहे हैं, खासकर अगर सावधानी से विचार किया जाना चाहिए. डाउन स्ट्रीम विश्लेषण के लिए यह सभी नमूनों के लिए टेम्पलेट शाही सेना मात्रा का एक ही राशि का उपयोग करने के लिए अक्सर इस प्रकार सबसे अच्छा है. लेबल शाही सेना की पैदावार electrophoretical विश्लेषण द्वारा आरएनए गिरावट के संकेत के लिए उम्मीद की जांच की तुलना में कम कर रहे हैं मामलों में जहां. नव लिखित आरएनए काफी अधिक मात्रा में होता है ठेठ rRNA बैंड (चित्रा 4) बहुत कम प्रमुख होने के साथ बड़े, unspliced ​​टेप की.

4. नव लिखित आरएनए की मात्रा

अंत में, नव लिखित शाही सेना में 4sU का समावेश दरों सीधे 330 एनएम पर 4sU के अवशोषण को अधिकतम और आयुध डिपो 330/260 अनुपात 5,18 के आधार पर spectrophotometric विश्लेषण द्वारा मात्रा निर्धारित किया जा सकता है. Isopropanol / इथेनॉल तेज़ी से - यह एक छोटी मात्रा (20 μl 10) में केंद्रित लेबल शाही सेना के> 3 ग्राम की आवश्यकता है. Nuclease मुक्त ग्लाइकोजन के 30 ग्राम (Fermentas, # R0551) के साथ छोटे आरएनए गोली सह वर्षा को खोने से बचने के लिए किया जाना चाहिए. एक अतिरिक्त शिखर नव लिखित आरएनए (चित्रा 5) में 4sU का समावेश दर दर्शाती 330 एनएम पर दिख रहा है.

/ Files/ftp_upload/50195/50195fig1highres.jpg "/>
चित्रा 1. . कुल सेलुलर शाही सेना की तैयारी द्वारा पीछा समय - 4 thiouridine (4sU) के साथ चयापचय लेबलिंग के सिद्धांत 4sU आवश्यक (120 मिनट 5) के लिए कोशिकाओं को जोड़ा जाता है. Thiol विशेष biotinylation बाद कुल सेलुलर शाही सेना streptavidin लेपित चुंबकीय मोतियों का उपयोग 4sU लेबल, नव लिखित आरएनए, और unlabeled, पूर्व मौजूदा शाही सेना में विभाजित है. नव लिखित आरएनए मोतियों को नव लिखित आरएनए लिंक कि डाइसल्फ़ाइड बांड cleaves जो एक कम करने एजेंट का उपयोग मोतियों से बरामद किया है. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 2
चित्रा 2. निम्नलिखित नव लिखित शाही सेना की वसूली 4sU की बढ़ती सांद्रता. (ए) प्राथमिक मानव चमड़ी fibroblasts (HFF) 100 के साथ incubated रहे थे, 4sU के 200, 400, 800 या 1600 माइक्रोन. नव लिखित आरएनए 50 ग्राम कुल सेलुलर शाही सेना से शुद्ध और electrophoretical विश्लेषण के अधीन था. जैसी कि उम्मीद थी, बरामद नव लिखित शाही सेना में एक एकाग्रता निर्भर वृद्धि उच्च सांद्रता में पठार के लिए शुरू कर दिया है, जो मनाया गया. (बी) के नव लिखित आरएनए शुद्ध राशि ImageJ 1.45s सॉफ्टवेयर का उपयोग मात्रा गया. 800 माइक्रोन 4sU (एन = 2) या 100 - - नव लिखित आरएनए की मात्रा पर चार स्वतंत्र प्रयोगों के संयुक्त डेटा 50 या तो से लेकर 4sU लेबलिंग के विभिन्न सांद्रता निम्नलिखित बरामद किया. 1600 माइक्रोन 4sU (एन = 2) दिखाए जाते हैं यहां क्लिक करें बड़ा आंकड़ा देखने के लिए .

upload/50195/50195fig3.jpg "alt =" चित्रा 3 "के लिए: सामग्री चौड़ाई =" 4.5in "के लिए: src =" / files/ftp_upload/50195/50195fig3highres.jpg "/>
चित्रा 3. डॉट धब्बा विश्लेषण का उपयोग 4sU लेबल कुल शाही सेना में 4sU समावेश का आकलन. कुल शाही सेना के एक घंटे के लिए 4sU 200 माइक्रोन के साथ incubated एनआईएच 3T3 murine fibroblasts या मानव चमड़ी fibroblasts (HFF) से अलग किया गया था. कोई 4sU नकारात्मक नियंत्रण के रूप में एक डिश के लिए जोड़ा गया है. HFF लिए दोनों संपर्क हिचकते (एन = गैर बढ़ कोशिकाओं) और बढ़ कोशिकाओं (वाई) शामिल थे. शाही सेना Trizol अभिकर्मक और बायोटिन HPDP या iodoacetyl बायोटिन करने के बाद संयुग्मित का उपयोग कर अलग किया गया था. प्रत्येक नमूने की एकाग्रता, यह कमजोर पड़ने के 200 एनजी / μl और 5 μl (आरएनए यानी 1 ग्राम), साथ ही तीन बाद 10 गुना dilutions (क्रमशः यानी 100, 10, और 1 एनजी आरएनए) को समायोजित सब थे जीटा झिल्ली के एक टुकड़े पर देखा. बायोटिन लेबल डीएनए oligo के 5 μl dilutions के concentrat पर सकारात्मक नियंत्रण के रूप में झिल्ली पर रखा गयाμl / एनजी नीचे 20 से 20 स्नातकोत्तर / μl (क्रमशः यानी 100-0.1 एनजी) को लेकर आयनों. बायोटिन घनत्व एक streptavidin-हॉर्सरैडिश peroxidase साधना का उपयोग कर जांच की गई थी.

चित्रा 4
4 चित्रा. नव लिखित और कुल शाही सेना के Electrophoretical विश्लेषण. कुल शाही सेना (टी) और नव लिखित आरएनए (एन) 1 घंटा agarose जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा विश्लेषण किया गया था के लिए 500 माइक्रोन 4sU की उपस्थिति और अनुपस्थिति में दोनों सुसंस्कृत murine एनआईएच 3T3 fibroblasts (ए) से तैयार और (इसी क्रम में) है Agilent Bioanalyser (बी) का उपयोग कर. कोई शाही सेना कोशिकाओं के 4sU उपचार के बिना बरामद किया गया था. नव लिखित आरएनए शुद्ध उच्च आणविक भार mRNAs का अधिक से अधिक मात्रा और कुल की तुलना में काफी कम परिपक्व rRNAs शामिल28S, 18s, और 5.8S rRNA बैंड के बीच उल्लेखनीय रूप आरएनए. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 5
चित्रा 5. Spectrophotometric विश्लेषण द्वारा नव लिखित शाही सेना में 4sU समावेश की मात्रा. Murine एनआईएच 3T3 fibroblasts में 4sU 200 माइक्रोन से 1 घंटा निम्नलिखित 2 एक्स 100 ग्राम कुल शाही सेना से शुद्ध नव लिखित आरएनए. नव लिखित आरएनए nuclease मुक्त ग्लाइकोजन के 30 ग्राम जोड़ने के बाद isopropanol / इथेनॉल के साथ उपजी था. एक NanoDrop 1000 स्पेक्ट्रोफोटोमीटर द्वारा प्राप्त नव लिखित आरएनए की Spectrophotometric विश्लेषण से पता चला है. मोटा, अंधेरे ग्रे लाइनों 1 मिमी द्रव स्तंभ पर माप का प्रतिनिधित्व करते हैं, जबकि हल्के भूरे रंग लाइनों 0.1 मिमी से कम माप का प्रतिनिधित्व करते हैं. टी का प्रतिनिधित्व विलुप्त होने के चोटी के अधिकार पर, एक बढ़ाईवह 4sU-अवशेषों को दिखाया गया है शामिल. 4sU 18 के गुणांक विलुप्त होने के आधार पर 4sU का समावेश दरों में अनुमान लगाया जा सकता है.

लेबलिंग [मिनट] की अवधि अनुशंसित 4sU एकाग्रता [माइक्रोन]
120 100 - 200
60 200-500
15 - 30 500 - 1000
<10 500 - 2000

तालिका 1. 4sU सांद्रता की सिफारिश की.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

नव लिखित आरएनए की मेटाबोलिक लेबलिंग काफी रुचि के जैविक सवाल का पता करने के लिए अधिक उपयुक्त टेम्पलेट्स प्रदान करके डीएनए और आरएनए seq तरह उच्च throughput प्रौद्योगिकियों की शक्ति को बढ़ाता है. वर्तमान प्रोटोकॉल व्यापक अनुकूलन कराना पड़ा. यह नव लिखित आरएनए के> 1,000 गुना संवर्धन की अनुमति देता है और अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम प्रदान करता है.

नव लिखित आरएनए केवल 4sU को कोशिकाओं के जोखिम के समय के दौरान वास्तविक समय transcriptional गतिविधि दर्शाती जाएगा के रूप में एक 4sU टैगिंग प्रयोग की प्रयोगात्मक डिजाइन महत्वपूर्ण महत्व का है. एक प्रेरणा का पालन प्रतिलेखन दरों में वास्तविक परिवर्तन पहले ही थम गया है, तो कुल शाही सेना के स्तर में परिवर्तन अभी भी पता लगाने योग्य हो सकता है, भले ही नव लिखित आरएनए का विश्लेषण करते समय, इन याद किया जाएगा. इसलिए, अंतर्निहित जीव विज्ञान की एक अच्छी समझ प्रयोगात्मक स्थापना के साथ ही इष्टतम अवधि ओ परिभाषित करने के लिए महत्वपूर्ण है4sU प्रदर्शन के लिए च समय. नीचे, हम सिफारिशों और सबसे महत्वपूर्ण कदम के लिए आम नुकसान से बचने के लिए तरीके प्रदान करते हैं.

शेयर समाधान और प्लास्टिक के बर्तन की तैयारी

सभी शेयर समाधान nuclease मुफ्त पानी का उपयोग करने के लिए तैयार रहना चाहिए. पानी एजेंटों को कम होता है, विआयनीकृत पानी शुद्ध घर में प्रयोग करने में समस्या हो सकती है. एक मामले में, यह सभी लेबल शाही सेना का पूरा नुकसान में हुई. इसलिए, हम दृढ़ता से nuclease मुक्त, NaCl Tris-सीएल, EDTA, सोडियम साइट्रेट और पानी पूर्व बनाया खरीदने की सलाह देते हैं. हर समय nuclease मुक्त शर्तों सुनिश्चित करें. Dimethylformamide (DMF) कुछ प्लास्टिक सामग्री घुल. हम बायोटिन HPDP शेयर समाधान तैयार करने के लिए 50 मिलीलीटर फाल्कन ट्यूबों को अपने शेयर कांच की बोतल से DMF के हस्तांतरण के लिए 25 मिलीलीटर सेल संस्कृति प्लास्टिक pipettes का उपयोग कर काफी हद तक पूरी परख से नव लिखित आरएनए की पैदावार को कम करने के लिए पर्याप्त था. दिलचस्प है, यह नकारात्मक biotinyl प्रभावित नहीं कियाव्यावहारिक दक्षता (जैसे डॉट धब्बा द्वारा परीक्षण किया), लेकिन मोतियों से बरामद किया जा सकता है कि नव लिखित आरएनए का एक 75 के लिए> 90% नुकसान के परिणामस्वरूप. लेबलिंग की अवधि 60 से 30 मिनट या उससे कम समय के लिए कम हो गया था जब नुकसान सबसे स्पष्ट किया गया था. सबसे अधिक संभावना है, DMF द्वारा प्लास्टिक pipettes से eluted एक पदार्थ आंशिक रूप से streptavidin मोती की कोटिंग को नष्ट कर दिया. इसलिए, DMF के साथ संगत होना करने के लिए नहीं जाना जाता है प्लास्टिक सामग्री के उपयोग हर तरह से बचा जाना चाहिए. एक ही कारण के लिए, सेल स्क्रेपर्स सेल संस्कृति प्लेटों से Trizol नमूने की वसूली बढ़ाने के लिए इस्तेमाल नहीं किया जाना चाहिए. यह DMF या Trizol द्वारा प्लास्टिक से eluted ख्यात पदार्थों जाहिरा तौर पर न तो क्लोरोफॉर्म निकासी न ही isopropanol / इथेनॉल तेज़ी से हटा दिया गया है कि दिलचस्प है ध्यान दें.

सेल संस्कृति

प्लेटों पर सेल घनत्व महत्वपूर्ण महत्व का है. कोशिकाओं (90 थोड़ा भी मिला हुआ हो दिखाई दिया जहां एक प्रयोग में -100%), हम इंटरफेरॉन की 100 यू / एमएल के साथ 30 मिनट के लिए एनआईएच 3T3 murine fibroblasts के इलाज (IFN) α या γ. कम मिला हुआ कोशिकाओं में IFN उपचार की भी 15 मिनट पहले ही एक 5 में हुई - irf1 या socs3 5 की तरह जीन का 8 गुना प्रेरण के लिए. कोशिकाओं थोड़ा होने के साथ भी मिला हुआ माइक्रोएरे विश्लेषण सबसे तेजी से irf1 या socs3 तरह जीन inducible भी लिए IFN-inducible जीन के किसी भी प्रेरण नहीं दिखा था. इसलिए, सेल घनत्व एक महत्वपूर्ण 4sU लेबलिंग प्रयोगों और सभी सेल संस्कृति प्लेटों के लिए कारक ध्यान लेबलिंग शुरू करने से पहले जांच की जानी चाहिए है.

4sU एक photoactivatable ribonucleoside है और 4sU युक्त शाही सेना कुशलतापूर्वक 365 एनएम प्रकाश स्रोत से संपर्क के बाद प्रोटीन को crosslinked है. 4sU इलाज कोशिकाओं से परहेज किया जाना चाहिए अंधेरे और चमकीले प्रकाश के संपर्क में संवर्धित किया जाना चाहिए. Trizol शाही सेना अलगाव से सेलुलर प्रोटीन को हटाने के बाद इस खतरे को काफी हद तक कम हो जाता है.

<पी वर्ग = "jove_content"> 4sU सेलुलर डीएनए में शामिल नहीं है. यह, हालांकि, कुल शाही सेना अभी भी सेलुलर डीएनए की छोटी मात्रा में होते है कि ध्यान दिया जाना चाहिए. 4sU टैगिंग का उपयोग करते हुए और क्यू आरटी पीसीआर विश्लेषण cytomegalovirus संक्रमण में वायरल जीन अभिव्यक्ति का अध्ययन करने के लिए जब हम concatemeric वायरल जीनोम 19 दूर करने के लिए प्रोटोकॉल में एक DNaseI पचाने कदम शामिल करने के लिए यह आवश्यक हो पाया. डीएनए की उपस्थिति के प्रति संवेदनशील नहीं हैं जो नीचे की ओर प्रोटोकॉल का उपयोग करते हैं तो यह शायद आवश्यक नहीं है.

4sU समावेश दरों और इष्टतम 4sU एकाग्रता

4sU आसानी से अंतर और अतिरिक्त सेलुलर स्तर को सबसे अधिक संभावना एक मिनट 9,16 से भी कम समय के भीतर equilibrating साथ कोशिकाओं द्वारा लिया जाता है. 4sU के तेज और समावेश दरों एकाग्रता पर निर्भर हैं. इसलिए, 4sU एकाग्रता आसानी से लेबलिंग के नियोजित अवधि के अनुसार समायोजित किया जा सकता है. 1 टेबल रिलायंस एनर्जी में 4sU सांद्रता पर सलाह प्रदान करता हैहमारी सर्वश्रेष्ठ व्यक्तिगत अनुभव के आधार पर लेबलिंग की अवधि को समझना. स्तनधारी कोशिकाओं में 4sU लेबलिंग के 1 घंटे के लिए, 200 माइक्रोन 4sU fibroblasts में नव लिखित शाही सेना में 50 से 100 न्यूक्लियोटाइड प्रति के बारे में 4sU अवशेषों में जिसके परिणामस्वरूप सबसे अनुप्रयोगों के लिए पर्याप्त होगा.

साल के अंतिम दो में, हम fibroblasts, endothelial कोशिकाओं, उपकला कोशिकाओं, अस्थि मज्जा स्ट्रोमा कोशिकाओं, मैक्रोफेज और टी कोशिकाओं सहित मानव और murine मूल के सेल प्रकार की एक व्यापक श्रृंखला के लिए 4sU टैगिंग आवेदन किया है. इसके अलावा, ड्रोसोफिला और xenopus से कोशिकाओं को सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया. इन प्रयोगों के सभी में, 4sU समावेश विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के लिए 4sU एकाग्रता में न्यूनतम समायोजन की आवश्यकता होती है अत्यधिक कुशल हो पाया था. नए प्रकार की कोशिकाओं के लिए विधि की स्थापना, हम 4sU-सांद्रता (जैसे 50 से 1600 माइक्रोन से लेकर) में वृद्धि के साथ लेबल की कोशिकाओं के लिए सलाह देते हैं और नव लिखित शुद्ध के संबंध का विश्लेषण होगा अनुसंधानलागू 4sU-सांद्रता को एनए (चित्रा देख 2A / बी). शुद्ध नव लिखित आरएनए की राशि एक पठार में प्रवेश करती है, जिस पर 4sU एकाग्रता से चुना जाना चाहिए.

अत्यधिक मिला हुआ, संपर्क हिचकते कोशिकाओं का इस्तेमाल कर रहे हैं जहां मामलों में, हम कुशल 4sU समावेश सुनिश्चित करने के लिए थोड़ा अधिक 4sU सांद्रता (जैसे 500 के बजाय 200 माइक्रोन) का उपयोग करने की सिफारिश करेंगे. इसके अलावा, बहुत ही कम नव लिखित टेप का कब्जा (<200 NT) के विशेष हित के मामलों में जहां, 4sU एकाग्रता में भी वृद्धि करने की आवश्यकता हो सकती है. इस अस्थानिक प्रभाव या विषाक्तता से बचने के लिए लंबे समय तक लेबलिंग बार (जैसे> 1 घंटा) के साथ नहीं जोड़ा जाना चाहिए. अंत में, हम भी छोटे सेल संस्कृति मीडिया की एक मात्रा का उपयोग कर 4sU समावेश दक्षता कम कर सकते हैं पाया. इसलिए हम क्रमश: 5 मिलीलीटर या 10 सेमी या 15 सेमी पकवान प्रति माध्यम के 10 मिलीलीटर का उपयोग करने की सलाह देते हैं.

कुल सेलुलर शाही सेना की तैयारी

इस प्रोटोकॉल की सफलता के लिए यह साफ है, RNase मुक्त कुल सेलुलर शाही सेना प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है. 15 सेमी पकवान प्रति 5 मिलीलीटर Trizol का प्रयोग न्युक्लिअसिज़ से मुक्त स्वच्छ आरएनए पैदा करता है. हम Chomczynski एट अल द्वारा संशोधित Trizol प्रोटोकॉल का उपयोग करने की सलाह देते हैं. 20. सबसे पहले, यह बेहतर धोने चरणों के दौरान संभाल करने के लिए आसान कर रहे हैं जो मजबूत छर्रों में बढ़ाया केन्द्रापसारक बल के परिणाम के रूप में शाही सेना की बड़ी मात्रा में (> 100 ग्राम) को अलग करने के लिए अनुकूल है. नियमित रूप से 15 मिलीलीटर प्रयोगशाला फाल्कन ट्यूबों अधिक से अधिक 6000 × छ जीवित नहीं है लेकिन, जैसा कि इस विशेष polypropylene ट्यूब और एडाप्टर के उपयोग की आवश्यकता है. दूसरे, यह डीएनए और ग्लाइकोप्रोटीन से हटाने में सुधार. अंगों या ऊतकों से शाही सेना की तैयारी जब यह विशेष रूप से स्पष्ट हो जाता है. तीसरा, यह अलग किया जा सकता है, जो कुल शाही सेना की अधिकतम राशि की सीमा नहीं है. हम यह भी पाया गया हालांकि स्तंभ आधारित शाही सेना अलगाव तरीकों (जैसे RNeasy) उपयुक्त गुणवत्ता की शाही सेना, मानक कॉलम गिरफ्तारी प्रदान करने के लिएई केवल जिससे सामग्री शुरू करने की मात्रा सीमित कुल शाही सेना के 100 माइक्रोग्राम तक कब्जा करने में सक्षम. अंत में, अवशिष्ट इथेनॉल दूर करने के लिए, एक विंदुक के साथ दो बार शेष इथेनॉल हटाने शाही सेना के सूखने से अब जरूरी नहीं रह जाता है. यह बाद में फिर से भंग करने के लिए मुश्किल हो सकता है जो शाही सेना, पर सूखने का खतरा समाप्त. सिद्धांत रूप में, 4sU टैगिंग चूहों के चार इंजेक्शन द्वारा उदा, vivo में लागू है. हालांकि, हम शाही सेना पवित्रता नव लिखित आरएनए (अप्रकाशित डेटा) की शुद्धि से पहले Pólya टेप की शुद्धि की आवश्यकता होती है एक बड़ी समस्या का प्रतिनिधित्व करता है कि उल्लेख किया.

Biotinylation और अपार बायोटिन को हटाने

बायोटिन HPDP 100% thiol विशिष्ट है और बायोटिन अवशेषों और thiol लेबल शाही सेना नव लिखित अणुओं के बीच एक डाइसल्फ़ाइड बांड रूपों. 4sU लेबल शाही सेना के biotinylation दक्षता डॉट धब्बा विश्लेषण 5 द्वारा निर्धारित के रूप में 30% के बारे में है. बायोटिन HPDP पानी में घुलनशील नहीं हैयह कुशलतापूर्वक क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण द्वारा हटाया जा सकता है. एक भी क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण कदम अपार बायोटिन के विशाल बहुमत को दूर करने के लिए पर्याप्त है कि हम नियमित रूप से पूरी तरह हटाने सुनिश्चित करने के लिए इस चरण को दोहराएँ. क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण चरण 2 मिलीलीटर चरण लॉक जेल भारी ट्यूब (Eppendorf) के दौरान शाही सेना के नुकसान को कम करने के लिए निर्माता के निर्देशों का पालन किया जा सकता है. पहले कदम के टेम्पलेट संस्करणों अक्सर इन ट्यूबों के साथ सीधे संगत होना करने के लिए बहुत अधिक कर रहे हैं के रूप में आम तौर पर हम केवल दूसरे क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण कदम के लिए चरण लॉक ट्यूब का उपयोग करें. अनबाउंड बायोटिन HPDP को हटाने के बाद, शाही सेना isopropanol / इथेनॉल तेज़ी से बरामद किया है. यह वे प्रदान की बफ़र्स में जो फोड़ना डाइसल्फ़ाइड बांड एजेंटों को कम करने होते हैं और नव लिखित आरएनए से बायोटिन हटाने के रूप में इस्तेमाल नहीं किया जाना चाहिए biotinylated आरएनए (QIAGEN से जैसे RNeasy) को ठीक करने के लिए है कि वाणिज्यिक स्तंभ आधारित किट नोट करना महत्वपूर्ण है .

नए का शोधनly लिखित आरएनए

100 μl streptavidin मोती के लिए 100 से अधिक μl biotinylated आरएनए न जोड़ें. कम मात्रा जोड़ना पसंद किया जाता है. हालांकि, आरएनए का एक ही मात्रा सभी नमूनों के लिए जोड़ा जाना चाहिए. आप बस मोती 1x ते की मात्रा जोड़कर streptavidin मोती को जोड़ने जो शाही सेना इनपुट मात्रा (नमूने के बीच) को समायोजित करें. ताजा nuclease मुक्त 100 मिमी डीटीटी बनाने के लिए एक आसान तरीका है एक अति संवेदनशील पैमाने पर रखा एक बाज़ ट्यूब में डीटीटी पाउडर की एक पर्याप्त राशि छानना और फिर 100 मिमी डीटीटी उत्पन्न करने के लिए nuclease मुक्त एच 2 ओ के लिए आवश्यक राशि को जोड़ने के लिए है (1 मिलीग्राम डीटीटी प्रति 64.8 μl पानी).

4sU टैगिंग के विकास के दौरान हम विभिन्न आपूर्तिकर्ताओं से streptavidin मोती का परीक्षण किया. उनमें से एक नंबर पृष्ठभूमि की बड़ी मात्रा में उत्पन्न. इसलिए, हम दृढ़ता से अब तक, हम ऊतक ग से unlabeled शाही सेना के ले ओवर के साथ किसी भी समस्याओं का अनुभव नहीं है, Miltenyi streptavidin मोती के रूप में उपयोग करने की अनुशंसाulture के व्युत्पन्न शाही सेना के नमूने. इस तरह, लेबल शाही सेना के रूप में छोटे रूप में 150 एनजी विशेष रूप से streptavidin मोतियों की 100 μl का उपयोग कर 150 ग्राम biotinylated आरएनए (पानी की 100 μl में) से शुद्ध किया जा सकता है. मोती के साथ आपूर्ति संतुलन बफर के साथ मोती का संतुलन प्रदर्शन किया जा सकता है और थोड़ा कब्जा दरों में 13 वृद्धि कर सकते हैं.

गुणवत्ता नियंत्रण

हम उच्च throughput विश्लेषण के लिए यह subjecting से पहले नव लिखित आरएनए पर क्यू आरटी पीसीआर नियंत्रण प्रदर्शन करने की सलाह देते हैं. यह विभिन्न दिया प्रयोगात्मक सेटिंग में विनियमित किया जाना जाता है कई संदर्भ जीन की मात्रा का ठहराव शामिल हो सकते हैं. 4sU टैगिंग शाही सेना क्षय दरों का अध्ययन करने के लिए कार्यरत है जहां मामलों में, हम एक अल्पकालिक प्रतिलेख (जैसे Myc, FOS) और कुल और नव लिखित दोनों शाही सेना में एक लंबे समय रहते एक (जैसे GAPDH) यों के लिए सिफारिश करेंगे. नव लिखित / कुल शाही सेना के अनुपात (- से 10 गुना ~ 5) काफी अधिक होना चाहिएअल्पकालिक टेप के लिए. शाही सेना के एक संदर्भ जीन का आधा जीवन पर आधारित है, आरएनए आधा जीवन निर्धारित किया जा सकता है. सभी तीन शाही सेना भिन्न (कुल शाही सेना, नव लिखित आरएनए और unlabeled पूर्व मौजूदा आरएनए) चार या अधिक जीन, अलग आरएनए सबसेट को सामान्य बनाने के लिए विश्लेषण कर रहे हैं के रूप में 7 वर्णित निर्धारित किया जा सकता रेखीय प्रतिगमन विश्लेषण और गुणवत्ता नियंत्रण के स्कोर से किया जा सकता है , 21.

क्यू आरटी पीसीआर विश्लेषण के लिए, हम 20 μl सीडीएनए संश्लेषण मिश्रण में लेबल शाही सेना के 2.5 μl का उपयोग करने की सलाह देते हैं. क्यू आरटी पीसीआर परिणाम का इष्टतम तुलना के लिए पहली बार उपयोग करने से पहले 5 μl की aliquots में सीडीएनए फ्रीज. बस का उपयोग करने से पहले पिघलना ट्यूबों, एच 2 ओ के 45 μl और क्यू आरटी पीसीआर विश्लेषण करने dilutions की विषय 5 μl जोड़ें. यह काफी अलग पीसीआर रन के बीच तुलनात्मकता को बढ़ाता है.

नव लिखित शाही सेना के नमूने लिए उनमें subjecting से पहले Agilent के Bioanalyser उपयोग कर आरएनए गिरावट के संकेत के लिए जाँच की जानी चाहिएउच्च throughput विश्लेषण (डीएनए या शाही सेना सेक). यह, हालांकि, अतिरिक्त बैंड कभी कभी Agilent Bioanalyser द्वारा मनाया जाता है कि ध्यान दिया जाना चाहिए. इस के जैविक महत्व स्पष्ट नहीं हुआ है. नव लिखित आरएनए काफी कम ribosomal शाही सेना शामिल हैं, इन नमूनों कभी कभी Agilent Bioanalyser गुणवत्ता नियंत्रण असफल. यह स्वीकार्य गुणवत्ता के दृश्य आरएनए गिरावट के नमूने की वजह से नहीं है, तो आम तौर पर उच्च throughput विश्लेषण के अधीन किया जाना ठीक हैं.

डाउन स्ट्रीम विश्लेषण के साथ नव लिखित आरएनए की संगतता

नव लिखित आरएनए कुल शाही सेना की तुलना में काफी अधिक है mRNA शामिल हैं. इस 4sU टैगिंग की अवधि को छोटा किया जाता है जब वृद्धि हुई है जो नव लिखित शाही सेना में intronic दृश्यों की बड़ी मात्रा की वजह से है. इस प्रारंभिक सामग्री की बड़ी मात्रा की आवश्यकता के रूप में इसलिए, हम नियमित रूप से नव लिखित शाही सेना के नमूने से rRNAs की कमी नहीं शुरू करते हैं, जबकि प्रदान करता हैगैर rRNA में आईएनजी बल्कि छोटे (~ दुगना) लाभ पढ़ता है. अंत में, यह अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के लिए सीडीएनए पुस्तकालयों की तैयारी जब नव लिखित आरएनए में मौजूद unspliced, उच्च आणविक भार टेप का बड़ा प्रतिशत अतिरिक्त विखंडन की आवश्यकता हो सकती है कि ध्यान दिया जाना बना रहता है. आकार विखंडन कदम के परिणाम इसलिए गुणवत्ता सावधानी से नियंत्रित किया जाना चाहिए.

आरएनए आधा रहते मापन के लिए डेटा सामान्यीकरण

आरएनए आधा जीवन मापन के लिए प्रयोगात्मक डेटा मानक के अनुसार करने के लिए मानक दृष्टिकोण शाही सेना एक अच्छी तरह से विशेषता घर रखने के जीन का आधा जीवन या मंझला आरएनए पिछले प्रयोगों में निर्धारित एक दिया सेल प्रकार में आधा जीवन के लिए सभी डेटा मानक के अनुसार है. स्तनधारी कोशिकाओं में, बाद 5 से 10 घंटे 6,7 की रेंज में है. इस दृष्टिकोण भी 4sU आधारित मापन के लिए काफी अच्छी तरह से काम करता है जबकि मंझला आरएनए आधा जीवन मा जाना जाता है या अगर यह नहीं है तो, सामान्य बनाने के लिए अन्य साधनों की आवश्यकता होती हैवाई भी तोड़े बाहर एक शाही सेना क्षय मार्ग के द्वारा जैसे, अध्ययन के तहत सेलुलर तंत्र में परिवर्तन से प्रभावित हो. 4sU टैगिंग सभी तीन शाही सेना भिन्न, यानी कुल सेलुलर शाही सेना, नव लिखित आरएनए, और unlabeled पूर्व मौजूदा शाही सेना के विश्लेषण के आधार पर मंझला आरएनए आधा जीवन का आकलन करने का एक अनूठा तरीका प्रदान करता है. कुल सेलुलर शाही सेना के एक सरल रेखीय प्रतिगमन मॉडल एक दूसरे से तीन शाही सेना अंशों को सामान्य और मंझला आरएनए आधा जीवन 7,16 निर्धारित करने के लिए नियोजित किया जा सकता है बाद के दो शाही सेना अंशों में विभाजित किया जाता है. एक सॉफ्टवेयर पैकेज इन विश्लेषण 22 प्रदर्शन करने के लिए ऑनलाइन उपलब्ध है.

कम uridine सामग्री के साथ टेप की अक्षम कब्जा कृत्रिम रूप से कम नव लिखित / कुल शाही सेना अनुपात और लंबे समय तक शाही सेना आधा जीवन में जिसके परिणामस्वरूप आरएनए आधा जीवन माप प्रभावित कर सकता है. इस समस्या की हद uridi खिलाफ आरएनए आधा जीवन या लॉग (नव लिखित / कुल शाही सेना अनुपात) की साजिश रचने के द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता हैसभी टेप 7,15 के पूर्वोत्तर सामग्री. यह भी विभिन्न नमूनों या परिस्थितियों के बीच 4sU-समावेश दरों में अंतर का आकलन करने के लिए एक अच्छी गुणवत्ता नियंत्रण प्रदान करता है. Uridine सामग्री के लिए एक महत्वपूर्ण संबंध को मनाया जाता है, ऐसे मामलों में जहां यह bioinformatic 15 का मतलब द्वारा ठीक किया जा सकता है. हालांकि, यह नव लिखित शाही सेना में परिपक्व टेप के योगदान को आसानी से बहुत बड़ा है और इस प्रकार और अधिक uridine अमीर व्यापारियों से भेदभाव नहीं किया जा सकता है कि ध्यान दिया जाना चाहिए. एक दिया प्रतिलेख के प्रसंस्करण कैनेटीक्स (जो वे आम तौर पर नहीं कर रहे हैं) बस (अक्षम कब्जा) कम uridine सामग्री के लिए संशोधन निहायत आरएनए आधा जीवन को विकृत कर सकते हैं जाना जाता है जब तक. जैसे, हम हाल ही में 9 अत्यधिक अक्षम होने का सबसे अधिक मानव snoRNAs के प्रसंस्करण पाया. हम नहीं बल्कि छोटे से कम uridine सामग्री (70-300 NT) के लिए नव लिखित / कुल शाही सेना के अनुपात को सही किया था snoRNAs, यह बहुत कम snoRNA आधा लिव के परिणामस्वरूप होता है100% से अधिक कई नव लिखित / कुल शाही सेना के अनुपात के साथ तों (<5 मिनट). इसलिए, हम आम तौर पर शाही सेना आधा जीवन मापने जब कम uridine सामग्री के लिए सही करने की सिफारिश नहीं है.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.

Acknowledgments

हम पांडुलिपि के सावधान पढ़ने के लिए Amie रेगन को धन्यवाद देना चाहूंगा. इस काम एलडी और CCF को DFG अनुदान FR2938/1-1 को NGFN प्लस अनुदान # 01GS0801, एमआरसी फैलोशिप अनुदान G1002523 और NHSBT अनुदान WP11-05 के द्वारा समर्थित किया गया

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-thiouridine Carbosynth T4509 Prepare 50 mM stock in sterile H2O, store at -20 °C in aliquots of 50-500 μl, discard unused reagent, do not refreeze.
Trizol Invitrogen 15596026 (100 ml), 15596018 (200 ml) WARNING - CORROSIVE and HAZARDOUS TO HEALTH! Ensure immediate access to Phenol antidote (PEG-Methanol); Store at 4 °C.
Chloroform Sigma 372978 WARNING - HAZARDOUS TO HEALTH
Isopropanol Sigma 650447
Sodium citrate, nuclease-free Sigma C8532 Prepare 1.6 M stock solution using nuclease-free water.
5M nuclease-free NaCl Sigma 71386 Stock solution
Nuclease-free H2O Sigma W4502 Make 1 ml aliquots in nuclease-free tubes.
RNA precipitation buffer 1.2 M NaCl, 0.8 M sodium citrate in nuclease free water. Prepare in advance under strictly nuclease-free conditions. Store at room temperature in 50 ml falcon tubes.
Ethanol Sigma 459844 Use with nuclease-free water to prepare 80% ethanol, store at -20 °C.
1 M nuclease-free Tris Cl, pH 7.5 Lonza 51237 Stock solution
500 mM nuclease-free EDTA, pH 8.0 Invitrogen 15575-020 Stock solution
10x Biotinylation Buffer (BB) 100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA in nuclease-free water, make aliquots of 1 ml.
Dimethylformamide (DMF) Sigma D4551
EZ-Link biotin-HPDP Pierce 21341 Prepare 1 mg/ml stock solution by dissolving 50 mg biotin-HPDP in 50 ml DMF. Gentle warming enhances solubilisation. Store at 4 °C in aliquots of 1 ml.
Phase Lock Gel Heavy tubes 2.0 ml Eppendorf 0032 005.152 Optional for the chloroform extraction step.
Zeta membrane BIORAD 162-0153
10x Dot blot binding buffer 100 mM NaOH, 10 mM EDTA
Biotin-oligo 5'-biotin, 25 nucleotides, any sequence
Sodium dodecyl sulphate Fisher BPE9738 For 100 ml 20% stock solution, add 20 g SDS to 80 ml PBS pH 7-8 and adjust volume to 100 ml. Keep all high-percentage SDS solutions above 20 °C. Warm the solutions slightly should SDS precipitate.
EZ-Link Iodoacetyl-LC-Biotin Pierce 21333 Prepare 1 mg/ml stock solution by dissolving 50 mg iodoacetyl-biotin in 50 ml DMF. Gentle warming enhances solubilisation. Store at 4 °C in aliquots of 1 ml. Generates irreversible, thiol-specific biotinylation.
Phosphate buffer saline Gibco 10010-015
Dot blot blocking buffer Mix 20 ml 20% SDS with 20 ml 1 x PBS pH 7-8 and add EDTA to the final concentration of 1 mM.
Streptavidin-horseradish peroxidase Vector Laboratories SA5004 Store at -20 °C. Mix 10 ml 20% SDS with 10 ml 1 x PBS. Add 20 μl Streptavidin-HRP before use.
ECL reagent GE Healthcare RNP2109 Use following the manufacturer's instructions.
Super RX, X-RA Film, 18x24 cm Fujifilm 47410 19236
μMacs Streptavidin Kit Miltenyi 130-074-101 Store the beads at 4 °C.
Tween 20 Sigma P1379
Washing buffer 100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA, 1 M NaCl, 0.1% Tween 20 in nuclease-free H2O.
Dithiothreitol (DTT) Sigma 43817 Prepare as 100 mM DTT in nuclease-free H2O, always prepare fresh before use.
RNeasy MinElute Kit Qiagen 74204 Store columns at 4 °C, remaining components of the kit at room temperature.
1.5 ml screw-top polypropylene tubes Sarstedt 72.692.005 Compatible with Dimethylformamide
2.0 ml screw-top polypropylene tubes Sarstedt 72.694.005 Compatible with Dimethylformamide
15 ml tubes BD Falcon 352096 Compatible with Dimethylformamide
50 ml tubes BD Falcon 352070 Compatible with Dimethylformamide
All solutions/reagents should be stored at room temperature unless otherwise specified.
Equipment
UV/VIS spectrophotometer Thermo Scientific NanoDrop 1000 Or equivalent. Use low volume (1-2 μl) for measurements of low RNA concentrations to avoid excessive sample loss.
Polypropylene 15 ml centrifuge tubes VWR International 525-0153 In contrast to standard 15 ml tubes, these tolerate up to 15,000 × g
High-speed centrifuge Beckman Coulter Avanti J-25 Or equivalent equipment capable of reaching 13,000×g
High-speed rotor Beckman Coulter JLA-16250 Or equivalent equipment capable of reaching 13,000×g
Adaptors for 15 ml tubes Laborgeräte Beranek 356964 Or equivalent equipment capable of reaching 13,000×g
Refrigerated table-top centrifuge Eppendorf 5430 R Or equivalent.
Thermomixer Eppendorf Thermomixer compact Or equivalent.
Magnetic stand Miltenyi Biotec 130-042-109 One stand holds 8 μMacs columns.
Waterbath Grant SUB Aqua 5 Or equivalent.
Ultra-fine scale A&D GR-202 Or equivalent.
E-Gel iBase Power System Invitrogen G6400UK For RNA gels; or equivalent.
E-Gel EX 1% agarose precast gels Invitrogen G4020-01 For RNA gels; or equivalent.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brown, P. O., Botstein, D. Exploring the new world of the genome with DNA microarrays. Nature Genetics. 21, 33-37 (1999).
  2. Mortazavi, A., Williams, B. A., Mccue, K., Schaeffer, L., Wold, B. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nature Methods. 5, 621-628 (2008).
  3. Nagalakshmi, U., Wang, Z., et al. The transcriptional landscape of the yeast genome defined by RNA sequencing. Science. 320, 1344-1349 (2008).
  4. Wilhelm, B. T., Marguerat, S., et al. Dynamic repertoire of a eukaryotic transcriptome surveyed at single-nucleotide resolution. Nature. 453, 1239-U1239 (2008).
  5. Dölken, L., Ruzsics, Z., et al. High-resolution gene expression profiling for simultaneous kinetic parameter analysis of RNA synthesis and decay. RNA. 14, 1959-1972 (2008).
  6. Yang, E., van Nimwegen, E., et al. Decay rates of human mRNAs: correlation with functional characteristics and sequence attributes. Genome Res. 13, 1863-1872 (2003).
  7. Friedel, C. C., Dölken, L., Ruzsics, Z., Koszinowski, U. H., Zimmer, R. Conserved principles of mammalian transcriptional regulation revealed by RNA half-life. Nucleic Acids Res. 37, e115 (2009).
  8. Nilsen, T. W., Graveley, B. R. Expansion of the eukaryotic proteome by alternative splicing. Nature. 463, 457-463 (2010).
  9. Windhager, L., Bonfert, T., et al. Ultra short and progressive 4sU-tagging reveals key characteristics of RNA processing at nucleotide resolution. Genome Res. , (2012).
  10. Melvin, W. T., Milne, H. B., Slater, A. A., Allen, H. J., Keir, H. M. Incorporation of 6-thioguanosine and 4-thiouridine into RNA. Application to isolation of newly synthesised RNA by affinity chromatography. Eur. J Biochem. 92, 373-379 (1978).
  11. Cleary, M. D., Meiering, C. D., Jan, E., Guymon, R., Boothroyd, J. C. Biosynthetic labeling of RNA with uracil phosphoribosyltransferase allows cell-specific microarray analysis of mRNA synthesis and decay. Nature Biotechnology. 23, 232-237 (2005).
  12. Kenzelmann, M., Maertens, S., et al. Microarray analysis of newly synthesized RNA in cells and animals. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 6164-6169 (2007).
  13. Schwanhäusser, B., Busse, D., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473, 337-342 (2011).
  14. Rabani, M., Levin, J. Z., et al. Metabolic labeling of RNA uncovers principles of RNA production and degradation dynamics in mammalian cells. Nat. Biotechnol. , (2011).
  15. Miller, M. R., Robinson, K. J., Cleary, M. D., Doe, C. Q. TU-tagging: cell type-specific RNA isolation from intact complex tissues. Nat. Methods. 6, 439-441 (2009).
  16. Miller, C., Schwalb, B., et al. Dynamic transcriptome analysis measures rates of mRNA synthesis and decay in yeast. Mol. Syst. Biol. 7, 458 (2011).
  17. Weintz, G., Olsen, J. V., et al. The phosphoproteome of toll-like receptor-activated macrophages. Mol. Syst. Biol. 6, 371 (2010).
  18. Lipsett, M. N. The isolation of 4-thiouridylic acid from the soluble ribonucleic acid of Escherichia coli. Journal of Biological Chemistry. 240, 3975-3978 (1965).
  19. Marcinowski, L., Liedschreiber, M., et al. Real-time Transcriptional Profiling of Cellular and Viral Gene Expression during Lytic Cytomegalovirus Infection. PLoS Pathog. 8, e1002908 (2012).
  20. Chomczynski, P., Mackey, K. Short technical reports. Modification of the TRI reagent procedure for isolation of RNA from polysaccharide- and proteoglycan-rich sources. Biotechniques. 19, 942-945 (1995).
  21. Friedel, C. C., Dölken, L. Metabolic tagging and purification of nascent RNA: implications for transcriptomics. Mol. Biosyst. 5, 1271-1278 (2009).
  22. Friedel, C. C., Kaufmann, S., Dölken, L., Zimmer, R. HALO - A Java framework for precise transcript half-life determination. Bioinformatics. , (2010).

Tags

जेनेटिक्स अंक 78 सेलुलर जीवविज्ञान आण्विक जीव विज्ञान सूक्ष्म जीव विज्ञान जैव रसायन Eukaryota खोजी तकनीक जैविक परिघटना जीन अभिव्यक्ति की रूपरेखा शाही सेना संश्लेषण आरएनए प्रसंस्करण आरएनए क्षय 4 thiouridine 4sU टैगिंग माइक्रोएरे विश्लेषण आरएनए seq शाही सेना डीएनए पीसीआर अनुक्रमण
सेल संस्कृति में शाही सेना संश्लेषण, प्रसंस्करण और क्षय के उच्च संकल्प जीन एक्सप्रेशन प्रोफाइलिंग के लिए नव लिखित आरएनए की मेटाबोलिक लेबल
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rädle, B., Rutkowski, A. J.,… More

Rädle, B., Rutkowski, A. J., Ruzsics, Z., Friedel, C. C., Koszinowski, U. H., Dölken, L. Metabolic Labeling of Newly Transcribed RNA for High Resolution Gene Expression Profiling of RNA Synthesis, Processing and Decay in Cell Culture. J. Vis. Exp. (78), e50195, doi:10.3791/50195 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter