Summary
هذا الإجراء يوضح كيفية عزل من مخ الفأر الكبار الميتوكوندريا المرتبطة الأغشية ER أو MAMs وglycosphingolipid التخصيب microdomain الكسور من MAMs والاستعدادات الميتوكوندريا.
Abstract
عضيات داخل الخلايا هي هياكل ديناميكية للغاية مع اختلاف الشكل والتكوين، التي تخضع لخلية محددة العظة الجوهرية وخارجي. وجنبا إلى جنب في كثير من الأحيان الأغشية في مواقع محددة الاتصال، والتي أصبحت مراكز لتبادل جزيئات إشارة، مكونات غشاء 1،2،3،4. وmicrodomains غشاء بين العضيات التي تتشكل بين الشبكة الإندوبلازمية (ER) والميتوكوندريا في افتتاح كا IP3 حساسة 2 + قناة معروفة والأغشية المرتبطة-ER أو الميتوكوندريا MAMs 4،5،6. تم تكوين البروتين / والدهون خصائص البيوكيميائية من هذه المواقع الاتصال غشاء درس على نطاق واسع ولا سيما فيما يتعلق بدورها في تنظيم الكالسيوم داخل الخلايا 2 + 4،5،6. وER بمثابة المخزن الأساسي من الكالسيوم داخل الخلايا 2 +، وبهذه الصفة ينظم عدد لا يحصى من العمليات الخلوية المصب من الكالسيوم 2 + إشارات، بما فيuding بعد متعدية للطي البروتين والبروتين maturation7. الميتوكوندريا، من ناحية أخرى، والحفاظ على التوازن الكالسيوم + 2، من خلال التخزين المؤقت عصاري خلوي الكالسيوم تركيز + 2 وبالتالي منع بدء مسارات أفكارك المصب من الكالسيوم 2 + 4،8 عدم الاتزان. الطبيعة الديناميكية للMAMs يجعلها مثالية لمواقع تشريح الآليات الخلوية الأساسية، بما في ذلك إشارات الكالسيوم + 2 وتنظيم الكالسيوم الميتوكوندريا 2 + تركيز الدهون الحيوي، والنقل، والطاقة والأيض الخلوي بقاء 4،9،10،11،12. وقد وصفت عدة بروتوكولات لتنقية هذه microdomains من أنسجة الكبد والخلايا المستزرعة 13،14.
اتخاذ أساليب المنشورة سابقا في الحسبان، تكيفنا بروتوكول لعزل الميتوكوندريا وMAMs من مخ الفأر الكبار. لهذا الإجراء واضاف لدينا خطوة اضافية تنقية، وهما X100 تريتون استخراج، والتي هنابلس عزل جزء المخصب glycosphingolipid (GEM) microdomain من MAMs. هذه الاستعدادات GEM مشاركة العديد من مكونات البروتين مع الدهون والطوافات caveolae، والمستمدة من غشاء البلازما أو الأغشية داخل الخلايا الأخرى، واقترح أن تعمل على تجميع نقاط لتجميع البروتينات المستقبلة للبروتين والبروتين التفاعلات 4،15.
Protocol
ويهدف البروتوكول التالي لعزل وتنقية والأحجار الكريمة MAMs من مخ الفأر
الحلول المطلوبة لعزل MAMs، الميتوكوندريا والأحجار الكريمة
تجزئة للحصول على إعداد الميتوكوندريا الخام:
الحل: 0.32 M السكروز، 1 ملم NaHCO 3، 1 ملم MgCl 2، 0.5 مم CaCl 2 + مثبطات الأنزيم البروتيني (إضافة جديدة، حسب الحاجة)
الحل B: 0.32 M السكروز، 1 ملم 3 + NaHCO مثبطات الأنزيم البروتيني (إضافة جديدة، حسب الحاجة)
MAMs العزل:
متوسطة العزلة: 250 ملم المانيتول، 5 ملي درجة الحموضة HEPES 7.4، 0.5 مم EGTA، 0.1٪ BSA
التدرج العازلة: 225 المانيتول مم، 25 مم درجة الحموضة HEPES 7.5، 1 ملم EGTA، 0.1٪ BSA (تركيز النهائي)
الأحجار الكريمة العزل:
محتوى "استخراج GEM> الاحتياطي: 25 مم HEPES 7.5 درجة الحموضة، 0.15 M كلوريد الصوديوم، 1٪ تريتون X-100 + مثبطات الأنزيم البروتيني (إضافة جديدة، حسب الحاجة)الاحتياطي GEM Solubilising: 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.8، 5 ملم EDTA، 1٪ SDS + مثبطات البروتيز (إضافة جديدة، حسب الحاجة).
1. أول خطوة تجزئة التحت خلوية: إزالة النواة، خلايا Unlysed والحطام الخلوية
- الموت ببطء الماوس في الدائرة 2 CO.
- على الفور إزالة الدماغ، النصف، ضع في أنابيب 2 مل على الجليد والوزن.
ملاحظة: حافظ على نصفين الدماغ منفصلة في جميع أنحاء الإجراء بأكمله. ما يلي ينطبق على معاملة نصف الدماغ واحد.
- مكان النصف في الدماغ ما قبل المبردة الزجاج 2 مل طاحونة الأنسجة Dounce يحتوي على 1 مل A. الحل الباردة التجانس مع 15 السكتات الدماغية الإجمالية لإزالة مدقة كبيرة.
- نقل إلى أنبوب 15 مل الصقر، على الجليد، وتمييعالخليط يصل إلى 10 مجلدا ث / ت، على سبيل المثال G 0،225 إلى 2.25 مل.
- أجهزة الطرد المركزي في 1400 XG عينة لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية.
- إزالة بعناية طاف ونقل إلى 30 مل ذهابا وأسفل الزجاج أنبوب الطرد المركزي، على الجليد. تأكد من عدم تعكير صفو بيليه.
- إعادة تعليق بيليه في مجلدات 10 من نفس الحل. التجانس في طاحونة نفسه، مع 3-6 من السكتات الدماغية إزالة مدقة صغيرة، 1 مل في كل مرة.
- نقل إلى أنبوب جديد 15 مل فالكون وأجهزة الطرد المركزي في 710 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية. وهذا يؤدي إلى بيليه نواة الخلية والحطام.
- إزالة بعناية طاف مع حمام وطاف بحفظه في الخطوة 1.6.
2. الخطوة الثانية: عزل الميتوكوندريا الخام
- أجهزة الطرد المركزي في 13800 XG supernatants لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية.
- نقل طاف إلى أنبوب الطرد المركزي فائقة الوضوح بيكمان، على الجليد
- إعادة تعليق بيليه في الحل حجم 10 A. التجانس في طاحونة نفسه، مع 3-6 من السكتات الدماغية إزالة مدقة صغيرة، 1 مل في كل مرة.
- أجهزة الطرد المركزي كخطوة 2.1.
- كرر الخطوات 2،2-2،4.
- بيليه هو جزء مما أثرى الميتوكوندريا. بركة supernatants (العصارة الخلوية وER)، مع تغطية parafilm والحفاظ على الجليد.
- إعادة تعليق بيليه مع 6 ضربات لإزالة مدقة صغيرة، في 4.8 مل / ز (ز يشار إلى الوزن الأصلي الدماغ) من B الحل، في homogeniser الطازجة.
- ماصات باستور باستخدام الزجاج، وإعداد التدرج السكروز متقطع في أنبوب الطرد المركزي فائقة الوضوح بيكمان، مضيفا في وقت لاحق إلى أسفل الأنبوب على النحو التالي، بعناية، وضمان تتشكل الفقاعات لا:
Resupended بيليه (0.32 M السكروز)
3 مل السكروز ملي 850 (ملم في NaHCO 1 3)
3 مل السكروز M 1 (في ملي NaHCO 1 3)
3 مل السكروز M 1.2 (في NaHCO مم 13) - الطرد المركزي في 82500 XG لمدة 2 ساعة في C. ° 4 وفصل الناتجة في نهاية التدرج إنتاج ثلاثة نطاقات وبيليه ج: 1) المايلين والملوثات الأخرى غشاء (0.32 M - 0.85 M واجهة)، 2) ER، جولجي، الأغشية البلازما (0.85 M - 1 M واجهة)؛ 3) synaptosomes (1 M - 1.2 M واجهة)؛ 4) الخام الميتوكوندريا (بيليه) الذي يستخدم لتنقية الخطوات اللاحقة
3. عزل غشاء الميتوكوندريا ER-المرتبطة بها، MAMs
- إعادة تعليق النفط الخام طازجة معزولة الميتوكوندريا من نصف الدماغ واحدة، في 2 مل تحتوي على عزل متوسطة مثبطات الأنزيم البروتيني وأضاف طازجة.
- إعداد التدرج Percoll 30٪ مع التدرج 8 مل العازلة لكل نصف الدماغ، ووضعت في أنبوب الطرد المركزي فائقة الوضوح بيكمان.
* ملاحظة: جعل التدرج العازلة أكثر تركيزا (1.43 مرة) لتحقيق تركيز النهائي الصحيحة بعد دiluting Percoll إلى 30٪.
- التعليق طبقة الميتوكوندريا على رأس المعدة الانحدار ببطء لتجنب أي فقاعات.
- الطرد المركزي في 95000 XG لمدة 30 دقيقة، 4 ° C.
- إزالة جزء الثقيلة (أقل الفرقة) FIRST مع ماصة باستور الزجاج ونقل إلى أنبوب زجاجي الطازجة جولة القاع، على الجليد.
- إزالة جزء الخفيفة (الشريط العلوي) الثاني مع ماصة باستور الزجاج آخر ونقل إلى أنبوب زجاجي منفصل الطازجة جولة القاع، على الجليد.
- تمييع كل من الكسور التي تم جمعها في الخطوة 3.5 مع 10 مل متوسطة العزل والطرد المركزي في 6300 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية.
- تجاهل طاف من الكسر الثقيلة التي تم الحصول عليها في الخطوة 3.6، إعادة تعليق بيليه مع وسيلة أخرى مل عزل 10 و أجهزة الطرد المركزي مرة أخرى، كخطوة 3.6. سوف يكون الناتج بيليه الكسر نقية الميتوكوندريا.
- نقل طاف من جزء مخلفات الخفيفةنشوئها حصلت عليه في الخطوة 3.6 إلى أنبوب الطرد المركزي فائقة الوضوح بيكمان، على الجليد. تجاهل بيليه.
- إضافة إلى عزل كافية متوسطة طاف حصلت عليه في الخطوة 3.8 إلى ملء الأنبوب وأجهزة الطرد المركزي في XG 100،000 ل1 ساعة، 4 ° C. سوف يكون الناتج بيليه الكسر MAMs. إزالة بعناية وتجاهل طاف.
ملاحظة: في هذه الخطوة، قد أجهزة الطرد المركزي كما في 100،000 x ج لمدة 1 ساعة، 4 ° C طاف حفظ في الخطوة 2.6. سوف يكون بيليه الكسر ER وطاف الكسر عصاري خلوي.
4. استخراج Glycosphingolipid-المخصب الأحجار الكريمة، Microdomains
- ليز نقية الكسور الميتوكوندريا و / أو MAM في مل-1 ميكرولتر 500 من استخراج الاحتياطي لمدة 20 دقيقة على الجليد.
- أجهزة الطرد المركزي في 15300 XG لست] لمدة 2 دقيقة على 4 درجات مئوية.
- جمع supernatants (تريتون X-100 المواد القابلة للذوبان) والكريات إعادة الطرد المركزيلمدة 2 دقيقة لإزالة المواد المتبقية القابلة للذوبان. (تريتون X استخراج-100 الميتوكوندريا و / أو تريتون X-100 MAMs استخراج).
- ذوبان الكريات في Solubilising الاحتياطي. هذه المواد solubilized يمثل الكسور GEM، ويمكن استخدامها لمزيد من التحليل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
بناء على خبرتنا في استخدام هذا البروتوكول يمكن أن نوصي بأمان لعزل وتنقية MAMs، والأحجار الكريمة والكسور الميتوكوندريا من مخ الفأر. الإجراء على النحو المبين هو تكرار للغاية ومتسقة. في الشكل 1 نعرض صورة ممثل طبقة نقية طريقة الميتوكوندريا وMAMs على التدرج Percoll (الخطوة 3.4). A محددة، والفرقة حليبي تحتوي على تنقية الميتوكوندريا (ميتو-P) يفصل في الجزء السفلي من الأنبوب نابذة فائقة السرعة، في حين أن نسبة MAM تشكل فرقة واسعة الانتشار فوق الميتوكوندريا. بعد الانتعاش دقيق للعصابات التدرج الفردية، ومعلق على تنقية الكسور في منطقة عازلة تحلل، فصل على المواد الهلامية ونشف بولكرلميد SDS على الأغشية PVDF. ثم يتم البقع وضعوا بطارية من الأجسام المضادة لبروتين علامات محددة من شأنها أن تحقق من نقاء الكسور وتكوينها البروتين. الشكل 2A يوضح توزيع cytosاوليتش، ER والميتوكوندريا علامات في MAMs معزولة والكسور الميتوكوندريا. يجب أن الاستعدادات الميتوكوندريا نقية خالية من كل يكون علامات ER وعصاري خلوي. وبدل وثيقة بين ER والأغشية الميتوكوندريا في مواقع اتصال MAM يفسر وجود calreticulin (ER علامة) وتوم-20 (علامة الميتوكوندريا) في تنقية هذه الاستعدادات. ومن الممكن أيضا استخدام علامات محددة MAMs FACL4 وPACS2، فضلا عن غيرها من علامات المخصب داخل هذه المجالات، مثل IP3R-1 و 4 GRP75. ويمكن للMAMs استخراج مزيد من تريتون X-100 للحصول على الأحجار الكريمة. هذه microdomains، والتي تحتوي على مكونات الطوافات الدهنية و / أو caveolae هي caveolin-1 الإيجابية كما هو موضح في الشكل 2B.
الشكل 1. تظهر صورة من طبقات من غشاء الميتوكوندريا ER المرتبطة (MAMs) ونقية للالميتوكوندريا الكسور (ميتو ع).
الشكل 2. A) يظهر البقع الغربية تشغيل للتأكد من نقاء وتوزيع عصاري خلوي، وعلامات ER الميتوكوندريا في عصاري خلوي (خلوي) -، ER-، الكسور الميتوكوندريا نقية (ميتو ع) - والكسور MAM-B) البقع الغربية لل تنقية glycosphingolipid microdomains المخصب (GEMS) وتريتون X-100 استخراج الكسور (تريتون اضافي. MAMs) معزولة عن MAMs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
مواقع الاتصال بين الخلايا أو الأغشية بين العضيات غشاء البلازما والخلايا تمثل دينامية منصات إشارة للعمليات الخلوية الأساسية. توصيف دقيق لوظيفتها تكوين وتحت كل الظروف الفسيولوجية والمرضية تتطلب بروتوكولات تنقية موثوق بها وقابلة للتكرار. تم الأساليب بالتفصيل هنا على وجه التحديد الأمثل من قبل المختبر لعزل وتنقية والأحجار الكريمة MAMs يناظرها من مخ الفأر الكبار. وقد تم بنجاح تنفيذ هذا البروتوكول لتحديد المستجيبات الجزيئية التي تحدد هذه microdomains، وتكمن وراء المصب مسار أفكارك من الكالسيوم 2 + الخلل مما يؤدي إلى موت الخلايا العصبية في مرض الاعصاب الأيض عند الأطفال 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
أي من الكتاب لديها أي تضارب في المصالح لإعلان.
Acknowledgments
نحن نعترف مساهمة في تصور سانو ريناتا البروتوكول الأولي. Ad'A. يحمل جواهرجية للأطفال (JFC) هبوا الرئيس في علم الوراثة والعلاج الجيني. وقد تم تمويل هذا العمل في جزء من المعاهد الوطنية للصحة منح GM60905، وDK52025 CA021764، والجمعيات الخيرية اللبنانية السورية الأمريكية المرتبطين بها (ALSAC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Fractionation | |||
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S-5761 | |
| Magnesium Chloride, Hexahydrate | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| Calcium Chloride, Dihydrate | Sigma-Aldrich | C-5080 | |
| MAM | |||
| D-Mannitol | Sigma-Aldrich | M9546-250G | |
| Hepes | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378-250G | |
| BSA, Fraction V, Heat Shock, Lyophilizate | Roche | 03-116-964-001 | |
| Percoll | GE | 17-0891-02 | |
| GEM | |||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284-500 ml | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-3 | |
| Tris Base | Roche | 03-118-142-001 | |
| HCl | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120-500 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Fisher Scientific | BP166-500 | |
| Common | |||
| Protease Inhibitors Tablets, Complete EDTA-free | Roche | 11-873-580-001 | |
| EQUIPMENT | |||
| 2 ml Douce All-Glass Tissue Grinders | Kimble Chase | 885300-0002 | |
| 15 ml Polypropylene Conical Centrifuge Tubes, BD Falcon | BD | 352097 | |
| 30 ml Round-Bottom Glass Centrifuge Tubes | Kimble Chase | 45500-30 | |
| 15 ml Round-Bottom Glass Centrifuge Tubes | Kimble Chase | 45500-15 | |
| Ultracentrifuge tubes, Ultra-Clear, Thinwall, 14x89 mm | Beckman-Coulter | 344059 | |
| Parafilm | Cole-Parmer | PM996 | |
| Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets, 9" | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
References
- Poburko, D., Kuo, K. H., Dai, J., Lee, C. H., van Breemen, C. Organellar junctions promote targeted Ca2+ signaling in smooth muscle: why two membranes are better than one. Trends Pharmacol. Sci. 25 (1), 8-15 (2004).
- Pani, B., Ong, H. L., Liu, X., Rauser, K., Ambudkar, I. S., Singh, B. B. Lipid rafts determine clustering of STIM1 in endoplasmic reticulum-plasma membrane junctions and regulation of store-operated Ca2+ entry (SOCE. J. Biol. Chem. 283 (25), 17333-17340 (2008).
- Levine, T., Rabouille, C. Endoplasmic reticulum: one continuous network compartmentalized by extrinsic cues. Curr. Opin. Cell Biol. 17 (4), 362-368 (2005).
- Sano, R., Annunziata, I., Patterson, A., Moshiach, S., Gomero, E., Opferman, J., Forte, M., d'Azzo, A. GM1-ganglioside accumulation at the mitochondria-associated ER membranes links ER stress to Ca(2+)-dependent mitochondrial apoptosis. Mol. Cell. 36 (3), 500-511 (2009).
- Raturi, A., Simmen, T. Where the endoplasmic reticulum and the mitochondrion tie the knot: The mitochondria-associated membrane (MAM). Biochim. Biophys. Acta. , (2012).
- Giorgi, C., De Stefani, D., Bononi, A., Rizzuto, R., Pinton, P. Structural and functional link between the mitochondrial network and the endoplasmic reticulum. Int. J. Biochem. Cell Biol. 41 (10), 1817-1827 (2009).
- d'Azzo, A., Tessitore, R. Sano Gangliosides as apoptotic signals in ER stress response. Cell Death Differ. 13, 404-414 (2006).
- Kroemer, G., Galluzzi, L., Brenner, C. Mitochondrial membrane permeabilization in cell death. Physiol. Rev. 87, 99-163 (2007).
- Rizzuto, R., Brini, M., Murgia, M., Pozzan, T. Microdomains with high Ca2+ close to IP3-sensitive channels that are sensed by neighboring mitochondria. Science. 262, 744-747 (1993).
- Lynes, E. M., Bui, M., Yap, M. C., Benson, M. D., Schneider, B., Ellgaard, L., Berthiaume, L. G., Simmen, T. Palmitoylated TMX and calnexin target to the mitochondria-associated membrane. EMBO J. 31 (2), 457-470 (2011).
- Fujimoto, M., Hayashi, T., Su, T. P. The role of cholesterol in the association of endoplasmic reticulum membranes with mitochondria. Biochem. Biophys. Res. Commun. 417 (1), 635-639 (2012).
- Grimm, S. The ER-mitochondria interface: the social network of cell death. Biochim. Biophys. Acta. 1823 (2), 327-334 (2012).
- Vance, J. E. Phospholipid synthesis in a membrane fraction associated with mitochondria. J. Biol. Chem. 265, 7248-7256 (1990).
- Wieckowski, M. R., Giorgi, C., Lebiedzinska, M., Duszynski, J., Pinton, P. Isolation of mitochondria-associated membranes and mitochondria from animal tissues and cells. Nat. Protoc. 4 (11), 1582-1590 (2009).
- Pizzo, P., Viola, A. Lymphocyte lipid rafts: structure and function. Curr. Opin. Immunol. 15 (3), 255-260 (2003).
