Summary
此过程说明了如何分离从成年小鼠的大脑相关的线粒体的ER膜或MAMS和糖脂富集的微区部分从MAMS和线粒体的准备工作。
Abstract
细胞内细胞器是高度动态的结构具有不同的形状和组合物，该组合物进行特定小区内在的和外在的线索。他们的膜通常定义的接触点，成为中心的交流信号分子和膜元件1,2,3,4并列。间细胞器的膜微区之间形成的内质网（ER）和线粒体在开幕式的IP3敏感的Ca 2 +通道被称为线粒体相关联的的ER膜或MAMS 4,5,6。蛋白质/脂质组成，这些膜接触位点的生化特性已被广泛研究，特别是在关系到他们的作用，调节细胞内Ca 2 + 4,5,6。的ER作为主存储区中细胞内Ca 2 +，和在这容量调节下游无数细胞过程的Ca 2 +信号，包括UDING翻译后的蛋白质折叠和蛋白maturation7。线粒体中，在另一方面，保持Ca 2 +的稳态，通过缓冲胞质Ca 2 +浓度，从而防止细胞凋亡途径的起始下游的Ca 2 +的不平衡4,8。的MAMS的动态特性使得他们的理想地点解剖的基本的蜂窝机制，包括Ca 2 +信号和调节线粒体Ca 2 +浓度，脂质的合成和运输，能量代谢和细胞的存活4,9,10,11,12。已经描述了几种协议用 于纯化这些微区的从肝组织和培养的细胞13,14。
考虑到先前公布的方法，我们已经适应了从成年小鼠的大脑中的线粒体和MAMS隔离的协议。在这个过程中，我们增加了一个额外的纯化步骤，即的Triton X100抽取的，其中Enables糖脂丰富的微区的部分（“创业板”）的MAMS的隔离。这些创业板制剂共享几个蛋白质组分与小窝和脂筏，来自质膜或其他细胞内的膜，以及，提出充当收集聚类受体蛋白质点和用于蛋白质-蛋白质相互作用4,15。
Protocol
该协议的目的是MAMS和宝石鼠脑的分离和纯化
解决方案需要分离线粒体，MAMS和宝石的
分馏，得到粗线粒体准备：
溶液A：0.32 M蔗糖，1毫摩尔的NaHCO 3，1毫摩尔的MgCl 2，0.5mM的CaCl 2的 +蛋白酶抑制剂（添加新鲜的，根据需要）
溶液B：0.32 M蔗糖，1毫摩尔的NaHCO 3 +蛋白酶抑制剂（添加新鲜的，根据需要）
MAMS隔离：
隔离媒介：250mM的甘露糖醇，5mM的HEPES pH为7.4，为0.5mM EGTA，0.1％BSA的
梯度缓冲液：225 mM的甘露糖醇，pH为7.5的25mM HEPES，1mM的EGTA，0.1％BSA的（最终浓度）
宝石隔离：
内容“> 创业板提取缓冲液：25毫米HEPES pH值7.5，0.15 M氯化钠，1％的Triton X-100 +蛋白酶抑制剂（添加新鲜，）创业板增溶缓冲液：50 mM Tris-盐酸，pH值8.8，5 mM的EDTA，1％SDS +蛋白酶抑制剂（添加新鲜的，需要的话）。
1。第一步亚细胞分离：去除的核，Unlysed细胞和细胞碎片
- CO 2室安乐死鼠标。
- 立即移除大脑，减少一半，将在2毫升管上的冰和权衡。
注意：在整个过程中，保持大脑半独立。以下内容适用于一个单一的半脑的治疗。
- 将一半大脑在预先冷冻的2毫升玻璃DOUNCE组织研磨机含有1ml冷的溶液A与一个大的间隙杵15总笔画均质。
- 转移到15 ml的Falcon管中，在冰面上，并稀释匀浆高达10体积w / v的， 例如 0.225克至2.25毫升。
- 离心样品在1400×g离心10分钟，在4℃下
- 小心除去上清液，转移至30毫升圆底玻璃离心管中，在冰上。确保不扰乱颗粒。
- 将沉淀重悬于相同的10倍体积的解决方案。与3-6笔划一个小间隙杵，1毫升的时间在相同的研磨机，均质。
- 转移到一个新的15毫升的猎鹰管和离心710×g离心10分钟，在4°C。这会导致在颗粒的细胞核和细胞碎片 。
- 小心除去上清液和游泳池与保存在步骤1.6中的上清液。
2。第二步：原油线粒体隔离
- 离心上清液在13,800 xg离心10分钟，在4℃下
- 将上清转移到一个超清晰的贝克曼离心管中，在冰
- 沉淀重悬在10体积解。与3-6笔划一个小间隙杵，1毫升的时间在相同的研磨机，均质。
- 离心步骤2.1。
- 重复步骤2.2-2.4。
- 由此产生的沉淀是一个丰富的线粒体组分。池上清液（细胞质和ER），用封口膜覆盖，并保持在冰上。
- 与6冲程一个小间隙杵重悬沉淀，在4.8毫升/克（g被称为原始的脑重量）的溶液B，在一个新的均化器。
- 使用玻璃巴氏吸管，准备蔗糖密度梯度超清晰贝克曼离心管，后来加入如下的试管底部，仔细，确保没有气泡形成：
Resupended颗粒（0.32 M蔗糖）
3毫升850 mM的蔗糖（在1mM的NaHCO 3）
3毫升1M的蔗糖（在1mM的NaHCO 3）
3毫升1.2M的蔗糖（在1mM的NaHCO3） - 在4℃下82,500 xg下离心2小时的渐变的结束时将得到的分离会产生三个频带和颗粒：1）的髓鞘和其他的膜污染物（0.32 M - 0.85 M接口），2）ER，高尔基体，血浆膜（0.85 M - 1 M接口）; 3）的突触体（1 M - 1.2 M接口）; 4）粗线粒体（粒料），用于随后的纯化步骤
3。线粒体相关的ER膜分离，MAMS
- 重悬新鲜分离的原油从一个脑线粒体一半，在2毫升分离培养基中新加入的蛋白酶抑制剂。
- 准备30％的的Percoll梯度 ， 梯度缓冲液8毫升，每半脑，和在超清晰贝克曼离心管的地方。
* 注意：请比较集中的梯度缓冲（1.43倍），以实现正确的最终浓度在Diluting珀可至30％。
- 在准备的梯度层线粒体悬浮液缓慢，以免任何气泡。
- 离心30分钟，4℃，95,000 xg离心
- FIRST用玻璃巴斯德吸管移除重馏分（低级频带），并转移到新鲜的圆底玻璃管，在冰上。
- 删除第二，另一个玻璃巴斯德吸管轻馏分（上带），并转移到一个单独的新鲜圆底玻璃管，在冰上。
- 稀释两个馏分收集在步骤3.5，用10毫升分离培养基和离心机在6300×g离心10分钟，在4℃下
- 从步骤3.6中的重质馏分弃上清，将沉淀重悬于另外10毫升分离培养基，并再次离心，3.6的步骤。将得到的沉淀将纯的线粒体组分 。
- 将上清转移来自光压裂TION获得步骤3.6超清晰贝克曼离心管中，在冰上。弃沉淀。
- 加入足够的隔离中等至步骤3.8中得到的上清液，以填补在100,000 xg离心1小时，4℃下的管和离心将所得的沉淀将是的MAMS馏分 。小心地取出，弃上清。
注意：到了这一步，你也可以在10万XG离心1小时，4°C保存在步骤2.6上清。颗粒将是ER的部分 ，取上清液胞浆部分 。
4。提取的鞘糖脂富集微区，宝石
- 在500μl的1毫升提取缓冲液中的20分钟，在冰上裂解纯线粒体和/或MAM馏分。
- 离心裂解物在15,300×g离心2分钟，在4℃下
- 收集上清活性剂（Triton X-100的可溶性材料）和再离心微丸2分钟以除去残留的可溶性物质。活性剂（Triton X-100的提取线粒体和/或Triton X-100提取MAMS）。
- 增溶缓冲液溶解的颗粒。这种溶解的材料代表创业板部分，并且可用于进一步的分析。
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Representative Results
根据我们的经验，使用这个协议，我们可以放心地推荐它从小鼠脑的MAMS，宝石和线粒体组分的分离和纯化。所概述的过程是高度重复性和一致性。在图1中，我们显示的途纯的线粒体和MAMS层上的Percoll梯度（3.4）的代表图像。纯化阿义，含乳白色频带的线粒体（三刀-P），在超离心管的底部偏析，当MAM馏分拼成一个以上的线粒体的漫反射和宽频带。仔细回收个别梯度带后，再悬浮在纯化的馏分的裂解缓冲液，SDS聚丙烯酰胺凝胶上分离，并印迹到PVDF膜上。然后将印迹会确定的组分及它们的蛋白质组合物的纯度为特定蛋白标记的抗体与一个电池的探测， 图2A示出的分布cytos奥利奇，ER和线粒体标记中分离出来的MAMS和线粒体组分。纯线粒体的准备应该是缺乏ER和胞质标记。 ER和线粒体膜在MAM接触站点之间的密切同位语解释了这些纯化的准备工作中存在的钙网蛋白（ER标志物）和汤姆 - 20（线粒体标记）。另外，也可以使用MAMS的特异性标记FACL4和PACS2，以及富集这些域中的其他标志物，如IP3R-1和GRP75 4的 。 MAMS可以进一步提取与Triton X-100获得的宝石。这些微区，其中包含的元件的脂筏和/或小窝小窝-1阳性的，如在图2B中示出。
图1显示的图片的分层线粒体相关的ER膜（MAMS）和纯线粒体的分数（线粒体-P）。
图2。 A）显示Western印迹法执行检查产品的纯度和细胞内，ER在细胞内的线粒体标记（细胞质）的分布- ER-，纯线粒体组分（美图-P） - MAM-组分B）Western印迹纯化的糖脂丰富的微区（GEMS）和Triton X-100提取（海卫抽。，MAMS）馏分分离出MAMS。
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Discussion
细胞内的膜或细胞器和细胞的质膜之间的站点之间的接触代表动态信令平台的基本的细胞过程。他们的生理和病理条件下的功能和组成的准确表征需要可靠和可重复的纯化方法。 MAMS和相应的宝石从成年小鼠的大脑的分离和纯化了专门的优化，通过我们的实验室方法详见这里。该协议已经成功实现了识别指定这些微区的分子效应，和背后的凋亡通路下游的Ca 2 +失衡导致神经细胞死亡的一种神经退化性代谢性疾病的儿童4。
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Disclosures
的作者有没有任何利益冲突的声明。
Acknowledgments
我们做出的贡献的雷纳塔佐野在构思的初步协议。 Ad'A。主席赋予遗传学和基因治疗的儿童（JFC）持有的珠宝商。这部分工作是由美国国立卫生研究院拨款GM60905，DK52025及CA021764，和美国的黎巴嫩叙利亚相关慈善（ALSAC）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Fractionation | |||
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S-5761 | |
| Magnesium Chloride, Hexahydrate | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| Calcium Chloride, Dihydrate | Sigma-Aldrich | C-5080 | |
| MAM | |||
| D-Mannitol | Sigma-Aldrich | M9546-250G | |
| Hepes | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378-250G | |
| BSA, Fraction V, Heat Shock, Lyophilizate | Roche | 03-116-964-001 | |
| Percoll | GE | 17-0891-02 | |
| GEM | |||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284-500 ml | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-3 | |
| Tris Base | Roche | 03-118-142-001 | |
| HCl | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120-500 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Fisher Scientific | BP166-500 | |
| Common | |||
| Protease Inhibitors Tablets, Complete EDTA-free | Roche | 11-873-580-001 | |
| EQUIPMENT | |||
| 2 ml Douce All-Glass Tissue Grinders | Kimble Chase | 885300-0002 | |
| 15 ml Polypropylene Conical Centrifuge Tubes, BD Falcon | BD | 352097 | |
| 30 ml Round-Bottom Glass Centrifuge Tubes | Kimble Chase | 45500-30 | |
| 15 ml Round-Bottom Glass Centrifuge Tubes | Kimble Chase | 45500-15 | |
| Ultracentrifuge tubes, Ultra-Clear, Thinwall, 14x89 mm | Beckman-Coulter | 344059 | |
| Parafilm | Cole-Parmer | PM996 | |
| Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets, 9" | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
References
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