Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Mitokondri ilişkili ER Membranlar (MAM) ve Glycosphingolipid zenginleştirilmiştir Microdomains (GEM'lerle): Fare Beyin izolasyon

Published: March 4, 2013 doi: 10.3791/50215
* These authors contributed equally

Summary

Bu işlem yetişkin fare beyin mitokondri ilişkili ER membranlar veya MAM ve MAM ve mitokondriyal hazırlıkları glycosphingolipid zenginleştirilmiş microdomain fraksiyonları izole etmek için nasıl göstermektedir.

Abstract

Hücre içi organel ve hücre şekli özel akışı içsel ve dışsal uyaranlara maruz bileşim, değişen yüksek dinamik yapılardır. Onların membranlar genellikle sinyal molekülleri ve membran bileşenlerinin 1,2,3,4 alışverişi için hub haline tanımlanan temas sitelerde, yan yana. Endoplazmik retikulum (ER) ve + kanal mitokondri ilişkili-ER membran veya MAM 4,5,6 olarak bilinir IP3 duyarlı Ca 2 açılışında mitokondri arasında oluşan inter-organel zarı microdomains. Protein / lipit bileşimi ve bu membran temas sitelerin biyokimyasal özellikleri yaygın, özellikle hücre içi Ca 2 + 4,5,6 düzenlenmesinde kendi rolü ile ilgili olarak çalışılmıştır. ER +, ve bu sıfatla Ca 2 mansap hücresel süreçlerin sayısız düzenleyen hücre içi Ca 2 primer deposu olarak hizmet + sinyalizasyon dahiltranslasyon sonrası protein katlanması ve protein maturation7 uding. Mitokondri, diğer taraftan, bu şekilde alt-Ca 2 + balanssızlık 4,8 apoptotik yollarının önlenmesi başlatma sitosolik Ca2 + konsantrasyon tamponlama göre, Ca2 + homeostazını korumak. MAM ve dinamik yapısı onları ideal sitesi Ca 2 + sinyalizasyon ve mitokondrial Ca 2 + konsantrasyonu, lipit biyosentezi ve taşınması, enerji metabolizması ve hücre sağkalımı 4,9,10,11,12 düzenlenmesi de dahil olmak üzere temel hücresel mekanizmaları incelemek için yapar. Birçok protokol karaciğer doku ve kültürlenmiş hücrelerde 13,14 bu microdomains saflaştırılması için tarif edilmiştir.

Dikkate önceden yayınlanmış yöntemleri alırsak, biz yetişkin fare beyin mitokondri ve MAM ve izolasyonu için bir protokol adapte var. Bu prosedür için biz ekstra bir saflaştırma adımı, yani bir Triton X100 ekstraksiyon, eklemiş hangi enables MAM arasında glycosphingolipid zenginleştirilmiş microdomain (GEM) fraksiyonu izolasyonu. Bu GEM hazırlıklar plazma zarı veya diğer intrasellüler membranların elde caveolae ve lipid sallar, birkaç protein bileşenleri paylaştığı ve reseptör proteinlerinin kümeleme için puan toplamak olarak ve protein-protein etkileşimleri 4,15 için çalışması önerilmiştir.

Protocol

Aşağıdaki protokol fare beyin MAM ve GEM'lerle izolasyonu ve saflaştırılması için tasarlanmıştır

Çözümler mitokondri, MAM ve GEM'lerle izolasyonu için gerekli

Fraksiyonlama ham mitokondriyal hazırlığının sağlanması:

Çözelti A: 0.32 M sukroz, 1 mM NaHCO 3, 1 mM MgCl2, 0.5 mM CaCl2 + proteaz inhibitörleri (gerektiği kadar taze ekleyin)

Çözüm B: 0.32 M Sakkaroz, 1 mM NaHCO 3 + proteaz inhibitörleri (gerektiği gibi, taze ekleyin)

MAM İzolasyon:

İzolasyon Orta: 250 mM mannitol, 5 mM HEPES pH 7.4, 0.5 mM EGTA,% 0.1 BSA

Gradyan Tamponu: 225 mM mannitol, 25 mM HEPES, pH 7.5, 1 mM EGTA,% 0.1 BSA (nihai konsantrasyon)

GEM'lerle İzolasyon:

content "> GEM Ekstraksiyon Tamponu: 25 mM HEPES, pH 7.5, 0.15 M NaCl,% 1 Triton X-100 + proteaz inhibitörleri (gerektiği gibi, taze ekleyin)

GEM çözündürücü Tamponu: 50 mM Tris-HCI, pH 8.8, 5 mM EDTA,% 1 SDS + proteaz inhibitörleri (gerekli olduğu gibi, taze ilave ediniz).

1. İlk Adım Subselüler Fraksiyonlama: Çekirdeğin çıkarılması, Unlysed Hücreler ve Hücresel Enkaz

  1. CO 2 odasında fare Euthanize.
  2. Derhal, beyin kaldırmak yarıya, buz üzerinde 2 ml tüpler yerleştirin ve tartın.

Not: tüm prosedür boyunca beyin yarıları ayrı tutun. Aşağıda tek beyin yarı tedavisi için de geçerlidir.

  1. 1 ml soğuk Çözüm A. büyük bir boşluk havaneli 15 toplam vuruş ile homojen içeren önceden soğutulmuş 2 ml cam Dounce doku öğütücü koyun yarım beyin.
  2. Buz üzerinde, 15 ml şahin tüp aktarın ve seyreltik10 hacim w / v, örneğin, 0.225 g 2,25 ml kadar homojenat.
  3. 4. 10 dakika için 1400 x g'de santrifüje örnek ° C.
  4. Dikkatli bir şekilde buz üzerinde, süpernatanın ve bir 30 mL yuvarlak tabanlı cam santrifüj tüpüne transferi çıkarın. Pelet rahatsız değil emin olun.
  5. Çözüm aynı 10 cilt halinde pelletini tekrar. A küçük bir açıklık havaneli, bir defada 1 ml 3-6 vuruş ile, aynı değirmeni homojenize edilir.
  6. 4. 10 dakika ° C için 710 xg'de taze 15 ml şahin tüp ve santrifüj transfer Çekirdekler ve hücre artıkları bir tablet elde edilir.
  7. Dikkatlice adım 1.6 kaydedilen süpernatant ile süpernatant ve havuz çıkarın.

2. İkinci Adım: Ham Mitokondri İzolasyon

  1. 4, 10 dakika için 13,800 x g'de santrifüjleyin süpernatan ° C.
  2. Buz üzerinde, bir Ultra-Clear Beckman Santrifüj Tüpü supernatant aktarın
  3. Süspanse pelet 10 ciltlik Çözüm A. Bir küçük açıklık havaneli, bir defada 1 ml 3-6 vuruş ile, aynı değirmeni homojenize edilir.
  4. Adım 2.1 olarak santrifüjleyin.
  5. Adımları 2.2-2.4 tekrarlayın.
  6. Çıkan pelet zenginleştirilmiş bir mitokondrial fraksiyonu olduğunu. Havuz süpernatantlar (sitoplazmada ve ER), parafilm ile kapak ve buz üzerinde tutmak.
  7. Küçük bir açıklık havaneli 6 vuruş ile pelet yeniden süspanse edin, 4.8 ml / g taze bir homojenleştiricinin içinde, çözelti B (g özgün beyin ağırlığı ifade edilir).
  8. Cam Pasteur pipet kullanarak, dikkatli bir biçimde, aşağıdaki gibi tüpün altına sonradan ekleme hiçbir baloncuklar oluşur sağlanması, bir Ultra-Sil Beckman santrifüj tüpünde bir süreksiz Sakaroz Gradyan hazırlanması:
    Resupended Pelet (0.32 M sukroz)
    3 ml 850 mM sukroz (1 mM NaHCO 3)
    3 ml 1 M sukroz (1 mM NaHCO 3)
    3 ml 1.2 M Sakkaroz (1 mM NaHCO içinde3)
  9. 4 ° C'de 2 saat süreyle 82,500 x g'de santrifüjleyin Degrade sonunda çıkan ayrılık üç bant ve pelet üretecek: -; 2) ER, golgi, plazma membranları (0.85 M - 1 M arayüz) 0.85 M arabirimi) 1) miyelin ve diğer membran kirleticiler (0,32 M; 3) sinaptozomlar (1 M - 1.2 M arayüzü), 4) mitokondri ham (pelet) müteakip arıtma aşamaları için kullanılan

3. Mitokondri ilişkili ER Membran izolasyonu, MAM

  1. Taze eklenmiş proteaz inhibitörleri içeren 2 ml İzolasyonu Ortamda bir beyin yarısından itibaren mitokondri taze izole ham süspanse edin.
  2. Degrade Arabellek 8 yarım beyin ml başına ve Ultra-Clear Beckman Santrifüj Tüpü yer ile% 30 Percoll degrade hazırlayın.

* Not: d sonra doğru final konsantrasyon elde etmek için (1.43 kat) degrade tampon daha konsantre olun% 30 Percoll iluting.

  1. Hazırlanan degrade üstüne Katman mitokondriyal süspansiyon YAVAŞÇA kabarcıkları önlemek için.
  2. 30 dak, 4 ° C ve 95.000 x g'de santrifüje
    1. Bir cam Pasteur pipeti ile İLK Ağır Fraksiyonu (alt bant) çıkarın ve yeni bir yuvarlak tabanlı cam tüp aktarmak, buz üzerinde.
    2. Başka bir cam Pasteur pipeti ile İKİNCİ Işık Fraksiyonu (üst bant) çıkarın ve buz üzerinde, ayrı bir taze yuvarlak alt cam tüp transfer.
  3. 4. 10 dakika için 6300 x g 10 ml izolasyon Orta ve santrifüj ile adım 3,5 toplanmış ve her iki fraksiyonu ° C. seyreltilir
  4. , Adım 3.6 'de elde edilen ağır fraksiyondan süpernatan atın başka bir 10 ml izolasyon Orta ile pelet tekrar süspansiyon ve adım 3.6 gibi, yeniden santrifüjlenir. Sonuçta elde edilen topak kesir saf mitokondriyal olacaktır.
  5. Işık Frac gelen supernatant aktarıntion buz üzerinde, bir Ultra-Clear Beckman Santrifüj Tüpü adım 3.6 elde. Pelet atın.
  6. 1 saat, 4 ° C 100.000 xg'de tüp ve santrifüj doldurmak için adım 3.8 'de elde edilen süpernatant yeterli İzolasyon Orta Ekle Sonuçta elde edilen topak kesir MAM olacaktır. Dikkatlice süpernatant kaldırmak ve atın.

Not: Bu aşamada, aynı zamanda 1 saat, 4 100,000 xg'de santrifüj ° C ile adım 2.6 olarak kaydedilir süpernatant. Topak kesir ER olması ve sitosolik kısmını süpernatant olacaktır.

4. Glycosphingolipid-zenginleştirilmiş Microdomains, GEM'lerle çıkarımı

  1. Buz üzerinde 20 dakika süreyle Ekstraksiyon tampon 500 ul-1 ml saf mitokondri ve / veya MAM kesirler Lyse.
  2. 4 de 2 dakika için 15,300 x g'de santrifüjleyin lizatları ° C.
  3. Süpernatantlar (Triton X-100 çözünür malzeme) ve yeniden santrifüj granül Collect2 dakika için çözünür malzeme kalan çıkarmak için kullanılır. (Triton X-100 Mitokondri ekstre edilmiş ve / veya Triton X-100 ekstre MAM).
  4. Tampon solubilising yılında pelet çözünür. Bu Çözelti halindeki materyale GEM fraksiyonlar temsil eder ve daha fazla analiz için de kullanılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Biz güvenle MAM, GEM'lerle ve fare beyin mitokondriyal kesirler izolasyonu ve saflaştırılması için tavsiye ederim bu protokolü kullanarak bizim deneyimlerine dayanarak. Özetlenen prosedür yüksek oranda tekrarlanabilir ve tutarlıdır. Şekil 1'de bir Percoll degrade (adım 3.4) üzerine bir şekilde saf mitokondri ve MAM tabakasının temsilcisi görüntüsünü gösterebilir. MAM fraksiyonu mitokondri üzerinde yaygın ve geniş bant yukarı yapar iken içeren tanımlanmış, sütlü bandı, ultrasantrifüjdeki tüpün dibinde mitokondri (Mito-P) segregatlar saflaştırılmış. Bireysel gradyan gruplarından dikkatli kurtarma sonra, saflaştırılmış fraksiyonlar, bir lizis tampon içinde tekrar süspanse edilir SDS-poliakrilamid jelleri üzerinde ayrılmış ve PVDF membran üzerine kurutulur. Cıvata sonra fraksiyonlar ve bunların protein kompozisyon saflığı tespit edecek spesifik protein belirteçler için antikorların bir batarya ile sondajlanan edilir. Şekil 2A cytos dağılımını gösteririzole MAM ve mitokondriyal fraksiyonda, Olic ER ve mitokondriyal işaretleri. Saf mitokondri preparatlar ER ve sitosolik marker, her iki yoksun olması gerekir. MAM temas siteleri ER ve mitokondrial zarlar arasındaki yakın apozisyon bu saflaştırılmış preparatlar calreticulin (ER belirteci) ve Tom-20 (mitokondri işaretleyici) varlığını açıklar. Bu, MAM spesifik belirteçler FACL4 ve PACS2 yanı sıra, bu gibi IP3R-1 GRP75 ve 4 olarak bu alan içinde zenginleştirilmiş diğer belirteçler, kullanmak da mümkündür. MAM ayrıca GEM'lerle elde etmek için Triton X-100 ile elde edilebilir. Şekil 2B'de gösterildiği gibi, lipid sallar ve / veya caveolae bileşenleri içeren bu microdomains, Caveolin-1 pozitif vardır.

Şekil 1
Şekil 1. Mitokondriyal ilişkili ER membran (MAM) ve katmanlama bir resim gösterir ve safmitokondriyal fraksiyonları (mito-p).

Şekil 2,
Şekil 2. A) batı blot saflık ve sitozolik, ER ve Sitozolik mitokondriyal belirteçleri (sito) dağılımını kontrol etmek için çalıştırın gösterir - ER-, saf mitokondriyal fraksiyonları (mito-p) -. Ve MAM-kesirler B) Western blot MAM izole glycosphingolipid zenginleştirilmiş microdomains (GEM'lerle) ve Triton X-100 ekstre (Triton extr. MAM) fraksiyonlar saflaştınldı.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Intrasellüler membranlar arasında veya organel ve hücre plazma zarı arasındaki temas siteleri temel hücresel süreçler için dinamik sinyal platformlarda temsil etmektedir. Fizyolojik ve patolojik koşullarda hem altında işlev ve kompozisyon doğru karakterizasyonu güvenilir ve tekrarlanabilir arıtma protokolü gerektirir. Burada ayrıntılı yöntemler özellikle erişkin fare beyin MAM ve bunlara karşılık gelen GEM'lerle izolasyonu ve saflaştırılması için laboratuvar tarafından optimize edilmiştir. Bu protokol başarıyla çocuklarda 4 nörodejeneratif bir metabolik hastalığı nöronal hücre ölümüne yol açan + dengesizlik bu microdomains belirtin ve Ca 2 apoptotik yolak aşağı altında yatan moleküler etkileyiciler tespiti için uygulamaya konmuştur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların hiçbiri bildirmek için herhangi bir çıkar çatışması var.

Acknowledgments

Biz ilk protokol tasavvur eden Renata Sano katkısını kabul. Ad'A. Genetik ve Gen Terapisi Sandalye Bahşedilen Çocuklar (JFC) için Kuyumcular tutar. Bu çalışma NIH hibe GM60905, DK52025 ve CA021764 ve Amerikan Lübnan Suriye İlişkili Charities (Alsaç) tarafından finanse edildi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
Fractionation
Sucrose Fisher Scientific S5-500
Sodium Bicarbonate Sigma-Aldrich S-5761
Magnesium Chloride, Hexahydrate Fisher Scientific BP214-500
Calcium Chloride, Dihydrate Sigma-Aldrich C-5080
MAM
D-Mannitol Sigma-Aldrich M9546-250G
Hepes Fisher Scientific BP310-500
EGTA Sigma-Aldrich E4378-250G
BSA, Fraction V, Heat Shock, Lyophilizate Roche 03-116-964-001
Percoll GE 17-0891-02
GEM
Triton X-100 Sigma-Aldrich T9284-500 ml
Sodium Chloride Fisher Scientific S271-3
Tris Base Roche 03-118-142-001
HCl Fisher Scientific A144S-500
EDTA Fisher Scientific BP120-500
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Fisher Scientific BP166-500
Common
Protease Inhibitors Tablets, Complete EDTA-free Roche 11-873-580-001
EQUIPMENT
2 ml Douce All-Glass Tissue Grinders Kimble Chase 885300-0002
15 ml Polypropylene Conical Centrifuge Tubes, BD Falcon BD 352097
30 ml Round-Bottom Glass Centrifuge Tubes Kimble Chase 45500-30
15 ml Round-Bottom Glass Centrifuge Tubes Kimble Chase 45500-15
Ultracentrifuge tubes, Ultra-Clear, Thinwall, 14x89 mm Beckman-Coulter 344059
Parafilm Cole-Parmer PM996
Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets, 9" Fisher Scientific 13-678-20C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Poburko, D., Kuo, K. H., Dai, J., Lee, C. H., van Breemen, C. Organellar junctions promote targeted Ca2+ signaling in smooth muscle: why two membranes are better than one. Trends Pharmacol. Sci. 25 (1), 8-15 (2004).
  2. Pani, B., Ong, H. L., Liu, X., Rauser, K., Ambudkar, I. S., Singh, B. B. Lipid rafts determine clustering of STIM1 in endoplasmic reticulum-plasma membrane junctions and regulation of store-operated Ca2+ entry (SOCE. J. Biol. Chem. 283 (25), 17333-17340 (2008).
  3. Levine, T., Rabouille, C. Endoplasmic reticulum: one continuous network compartmentalized by extrinsic cues. Curr. Opin. Cell Biol. 17 (4), 362-368 (2005).
  4. Sano, R., Annunziata, I., Patterson, A., Moshiach, S., Gomero, E., Opferman, J., Forte, M., d'Azzo, A. GM1-ganglioside accumulation at the mitochondria-associated ER membranes links ER stress to Ca(2+)-dependent mitochondrial apoptosis. Mol. Cell. 36 (3), 500-511 (2009).
  5. Raturi, A., Simmen, T. Where the endoplasmic reticulum and the mitochondrion tie the knot: The mitochondria-associated membrane (MAM). Biochim. Biophys. Acta. , (2012).
  6. Giorgi, C., De Stefani, D., Bononi, A., Rizzuto, R., Pinton, P. Structural and functional link between the mitochondrial network and the endoplasmic reticulum. Int. J. Biochem. Cell Biol. 41 (10), 1817-1827 (2009).
  7. d'Azzo, A., Tessitore, R. Sano Gangliosides as apoptotic signals in ER stress response. Cell Death Differ. 13, 404-414 (2006).
  8. Kroemer, G., Galluzzi, L., Brenner, C. Mitochondrial membrane permeabilization in cell death. Physiol. Rev. 87, 99-163 (2007).
  9. Rizzuto, R., Brini, M., Murgia, M., Pozzan, T. Microdomains with high Ca2+ close to IP3-sensitive channels that are sensed by neighboring mitochondria. Science. 262, 744-747 (1993).
  10. Lynes, E. M., Bui, M., Yap, M. C., Benson, M. D., Schneider, B., Ellgaard, L., Berthiaume, L. G., Simmen, T. Palmitoylated TMX and calnexin target to the mitochondria-associated membrane. EMBO J. 31 (2), 457-470 (2011).
  11. Fujimoto, M., Hayashi, T., Su, T. P. The role of cholesterol in the association of endoplasmic reticulum membranes with mitochondria. Biochem. Biophys. Res. Commun. 417 (1), 635-639 (2012).
  12. Grimm, S. The ER-mitochondria interface: the social network of cell death. Biochim. Biophys. Acta. 1823 (2), 327-334 (2012).
  13. Vance, J. E. Phospholipid synthesis in a membrane fraction associated with mitochondria. J. Biol. Chem. 265, 7248-7256 (1990).
  14. Wieckowski, M. R., Giorgi, C., Lebiedzinska, M., Duszynski, J., Pinton, P. Isolation of mitochondria-associated membranes and mitochondria from animal tissues and cells. Nat. Protoc. 4 (11), 1582-1590 (2009).
  15. Pizzo, P., Viola, A. Lymphocyte lipid rafts: structure and function. Curr. Opin. Immunol. 15 (3), 255-260 (2003).

Tags

Nörobilim Sayı 73 Hücresel Biyoloji Moleküler Biyoloji Biyokimya Mitokondri Membran Mitokondri Microdomains endoplazmik retikulum hücre içi Membranlar Glikosifingolipidler Gangliosides endoplazmik retikulum stres Hücre Biyolojisi Nörobilim MAM GEM'lerle ER membran microdomains subselular fraksiyonasyon lipidler beyin fare izolasyon hayvan modeli
Mitokondri ilişkili ER Membranlar (MAM) ve Glycosphingolipid zenginleştirilmiştir Microdomains (GEM'lerle): Fare Beyin izolasyon
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Annunziata, I., Patterson, A.,More

Annunziata, I., Patterson, A., d'Azzo, A. Mitochondria-associated ER Membranes (MAMs) and Glycosphingolipid Enriched Microdomains (GEMs): Isolation from Mouse Brain. J. Vis. Exp. (73), e50215, doi:10.3791/50215 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter