Summary
Cette procédure illustre comment isoler du cerveau de souris adulte les membranes des mitochondries associées à l'urgence ou la SMMA et les glycosphingolipides-fractions enrichies en microdomaines de MMA propres et préparations mitochondriales.
Abstract
Organites intracellulaires sont des structures très dynamiques avec plus ou moins de forme et de composition, qui sont soumis à des cellules spécifiques indices intrinsèques et extrinsèques. Leurs membranes sont souvent juxtaposées à des sites de contact définies, qui deviennent des plaques tournantes pour l'échange de molécules de signalisation et des composants membranaires 1,2,3,4. Les microdomaines membranaires inter-organites qui sont formées entre le réticulum endoplasmique (RE) et les mitochondries lors de l'ouverture de l'IP3 Ca 2 sensible à canal + sont connus comme les mitochondries associé-ER membranes ou SMMA 4,5,6. La composition en protéines / lipides et les propriétés biochimiques de ces sites de contact membranaire ont été étudiés en particulier par rapport à leur rôle dans la régulation intracellulaire de Ca 2 + 4,5,6. L'ER sert le magasin principal de la concentration intracellulaire de Ca 2 +, et à ce titre régit une multitude de processus cellulaires en aval de Ca 2 + signalisation, y comprisuding pliage post-traductionnelle de protéine et protéine maturation7. Mitochondries, d'autre part, maintenir l'homéostasie du Ca 2 +, par mise en mémoire tampon Ca 2 + concentration en empêchant ainsi l'ouverture de voies de l'apoptose en aval du Ca 2 + 4,8 balourd. La nature dynamique des MMA rend sites idéaux pour disséquer les mécanismes de base cellulaires, y compris le Ca 2 + signalisation et la réglementation des mitochondriale de Ca 2 + de survie biosynthèse des lipides concentration, et le transport, le métabolisme énergétique cellulaire et 4,9,10,11,12. Plusieurs protocoles ont été décrits pour la purification de ces microdomaines de tissus du foie et des cellules cultivées 13,14.
Les méthodes de prise en compte précédemment publiées, nous avons adapté un protocole pour l'isolement des mitochondries et des MMA propres du cerveau de souris adulte. Pour cette procédure, nous avons ajouté une étape de purification supplémentaire, à savoir une extraction Triton X100, qui enables de l'isolement du glycosphingolipide enrichi microdomaine (GEM) fraction des MMA. Ces préparations GEM partager des composants de plusieurs protéines avec des radeaux lipidiques et cavéoles, dérivées de la membrane plasmique ou d'autres membranes intracellulaires, et sont proposés à fonctionner comme des lieux de rencontre pour le regroupement des protéines réceptrices et des interactions protéine-protéine 4,15.
Protocol
Le protocole suivant est destiné à l'isolation et la purification de MMA propres et de pierres précieuses du cerveau de souris
Solutions nécessaire pour l'isolement des mitochondries, MMA propres et de pierres précieuses
Fractionnement pour obtenir brut préparation mitochondriale:
Solution A: 0,32 M saccharose, 1 mM NaHCO 3, 1 mM de MgCl2, 0,5 mM de CaCl 2 + inhibiteurs de la protéase (ajouter frais, le cas échéant)
Solution B: 0,32 M saccharose, 1 mM NaHCO 3 + inhibiteurs de la protéase (ajouter frais, le cas échéant)
Isolation MMA propres:
Moyen d'isolement: 250 mM, HEPES 5 mM mannitol à pH 7,4, 0,5 mM EGTA, 0,1% de BSA
Tampon gradient: 225 mM, HEPES 25 mM mannitol à pH 7,5, 1 mM EGTA, 0,1% de BSA (concentration finale)
Isolation GEM:
contenu "> GEM tampon d'extraction: 25 mM HEPES pH 7,5, 0,15 M de NaCl, 1% Triton X-100 + inhibiteurs de la protéase (ajouter frais, le cas échéant)Tampon de solubilisation GEM: 50 mM Tris-HCl, pH 8,8, EDTA 5 mM, SDS 1% + Inhibiteurs de la protéase (ajouter frais, au besoin).
1. Le fractionnement subcellulaire Première étape: suppression des noyaux des cellules, non lysées et les débris cellulaires
- Euthanasier de la souris dans la chambre de CO 2.
- Retirer immédiatement du cerveau, réduire de moitié, placez-le dans tubes de 2 ml sur de la glace et peser.
Remarque: Conservez moitiés du cerveau séparé pendant toute la procédure. Ce qui suit s'applique au traitement d'une moitié du cerveau unique.
- Placer la moitié du cerveau dans un pré-broyeur réfrigéré 2 ml en verre Dounce tissus contenant 1 ml de solution froide A. Homogénéiser avec 15 coups au total d'un pilon jeu important.
- Transférer dans un tube de 15 ml faucon, sur la glace, et diluerhomogénats jusqu'à 10 volumes p / v, par exemple 0,225 g à 2,25 ml.
- Centrifuger l'échantillon à 1400 xg pendant 10 min à 4 ° C.
- Retirez délicatement le surnageant et transférer dans un 30 ml à fond rond tube à centrifuger en verre, sur la glace. Assurez-vous de ne pas perturber le culot.
- Remettre en suspension le culot dans les mêmes 10 volumes de la solution A. Homogénéiser même dans le broyeur, avec 3-6 coups de pilon faible jeu, 1 ml à la fois.
- Transférer dans un nouveau tube Falcon de 15 ml et centrifuger à 710 xg pendant 10 min à 4 ° C. Cela se traduit par une pastille de noyaux et les débris cellulaires.
- Retirez délicatement le surnageant et la piscine avec le surnageant enregistré à l'étape 1.6.
2. Deuxième étape: Isolement brut Mitochondries
- Centrifuger surnageants à 13800 xg pendant 10 min à 4 ° C.
- Transférer le surnageant dans un tube Ultra-Clear Centrifugeuse Beckman, sur la glace
- Resuspendre le culot dans 10 volumes de solution A. Homogénéiser même dans le broyeur, avec 3-6 coups de pilon faible jeu, 1 ml à la fois.
- Centrifugeuse étape 2,1.
- Répétez les étapes 02.02 à 02.04.
- Le culot résultant est une fraction enrichie mitochondrial. Réunir les fractions surnageantes (cytosol et ER), couvrir avec du parafilm et garder sur la glace.
- Remettre en suspension le culot avec 6 coups de pilon faible jeu, dans 4,8 ml / g (g est renvoyé au poids du cerveau d'origine) de la solution B, dans un homogénéisateur frais.
- À l'aide de pipettes Pasteur en verre, préparer un gradient de saccharose discontinu dans un tube ultra-centrifugeuse Beckman dégagé, en ajoutant ensuite à la partie inférieure du tube de la manière suivante, soigneusement, en veillant à pas de bulles sont formées:
Resupended Pellet (0,32 M saccharose)
3 mM Saccharose ml 850 (dans 1 mM NaHCO 3)
3 ml 1 M de saccharose (dans 1 mM NaHCO 3)
3 ml 1,2 M de saccharose (dans 1 mM NaHCO3) - Centrifuger à 82500 g pendant 2 h à 4 ° C. La séparation résulte à la fin de la pente se produire trois bandes et un culot: 1) la myéline et autres contaminants membranaires (0,32 M - 0,85 M d'interface), 2) ER, Golgi, membranes plasmiques (0,85 M - 1 M d'interface); 3) synaptosomes (1 M - 1,2 M d'interface), 4) les mitochondries brut (pastille) qui est utilisé pour les étapes de purification ultérieures
3. Isolement des mitochondries associée à membrane du RE, MMA propres
- Reprendre le brut fraîchement mitochondries isolées à partir de la moitié du cerveau, en 2 Medium Isolation ml contenant des inhibiteurs de protéase fraîchement ajoutés.
- Préparer un gradient de Percoll 30% avec le tampon Gradient 8 ml par demi-cerveau, et placer dans un tube Ultra-Clear Centrifugeuse Beckman.
* Remarque: Assurez-tampon en gradient plus concentrée (1,43 fois) pour obtenir une concentration finale correcte après diluting Percoll à 30%.
- Suspension mitochondriale couche sur le dessus du gradient préparé lentement pour éviter les bulles.
- Centrifuger à 95000 g pendant 30 min, 4 ° C
- Retirez la fraction lourde (bande inférieure) d'abord avec une pipette Pasteur en verre et transférer dans un tube en verre à fond rond de frais, sur glace.
- Retirer la fraction légère (bande supérieure) DEUXIÈME avec une autre pipette Pasteur en verre et transférer dans un tube séparé en verre à fond rond de frais, sur glace.
- Diluer les deux fractions collectées à l'étape 3.5 avec 10 ml d'isolation moyen et centrifuger à 6300 xg pendant 10 min à 4 ° C.
- Jeter le surnageant de la fraction lourde obtenue à l'étape 3.6, remettre en suspension le culot avec un autre moyen d'isolation 10 ml et centrifuger à nouveau, comme à l'étape 3.6. Le culot résultant sera la fraction pure mitochondriale.
- Transférer le surnageant du Frac Lumièretion obtenue à l'étape 3.6 à un tube Ultra-Clear Centrifugeuse Beckman, sur la glace. Jeter le culot.
- Ajouter milieu d'isolement suffisante pour le surnageant obtenu à l'étape 3.8 à remplir le tube et centrifuger à 100.000 xg pendant 1 h à 4 ° C. Le culot résultant sera la fraction la SMMA. Retirez délicatement et jeter le surnageant.
Remarque: A ce stade, vous pouvez également centrifuger à 100.000 xg pendant 1 h à 4 ° C, le surnageant sauvegardé à l'étape 2.6. Le culot sera la fraction ER et le surnageant de la fraction cytosolique.
4. Extraction de glycosphingolipide enrichis en microdomaines GEM
- Lyse pures fractions mitochondries et / ou MAM dans 500 pi-1 ml de tampon d'extraction pendant 20 min sur la glace.
- Centrifuger lysats à 15.300 xg pendant 2 min à 4 ° C.
- Recueillir des surnageants (Triton X-100 matières solubles) et re-centrifuger pelletspendant 2 min pour enlever les matières solubles. (Triton X-100 extrait Mitochondries et / ou Triton X-100 MMA propres extraits).
- Solubiliser granulés à solubiliser tampon. Ce matériau solubilisé représente les fractions GEM et peut être utilisé pour une analyse ultérieure.
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Representative Results
Basé sur notre expérience avec l'utilisation de ce protocole, nous pouvons en toute sécurité le recommande pour l'isolement et la purification de la SMMA, les pierres précieuses et les fractions mitochondriales de cerveau de souris. La procédure décrite est hautement reproductible et cohérente. Dans la figure 1, nous montrons une image représentative de la façon dont la couche mitochondries et MMA propres pure sur un gradient Percoll (étape 3.4). Une définie, bande laiteuse contenant des mitochondries purifiées (Mito-P) sépare à la partie inférieure du tube d'ultracentrifugation, tandis que la fraction MAM constitue une bande diffuse et large-dessus de la mitochondrie. Après la récupération minutieuse des bandes de gradient individuels, les fractions purifiées sont remises en suspension dans un tampon de lyse, séparés sur des gels de polyacrylamide-SDS et transférés sur des membranes de PVDF. Blots sont ensuite sondé avec une batterie d'anticorps de marqueurs protéiques spécifiques qui rendront compte de la pureté des fractions et de leur composition en protéines. Figure 2A montre la répartition de Cytosmarqueurs Olic, ER et mitochondrial de la SMMA isolés et les fractions mitochondriales. Préparations pures mitochondries devrait être dépourvu de ces deux marqueurs ER et cytosoliques. L'apposition étroite entre ER et les membranes mitochondriales aux sites de contact MAM explique la présence de la calréticuline (ER marqueur) et Tom-20 (marqueur de mitochondries) dans ces préparations purifiées. Il est également possible d'utiliser MMA propres marqueurs spécifiques FACL4 et PACS2, ainsi que d'autres marqueurs enrichis dans ces domaines, comme IP3R-1 et Grp75 4. La SMMA peut être encore extraite avec du Triton X-100 pour obtenir les GEM. Ces microdomaines, contenant des composants de radeaux lipidiques et / ou cavéoles sont cavéoline-1 positif comme le montre la figure 2B.
Figure 1. Affiche une image de la stratification de la membrane mitochondriale associée ER (SMMA) et le purfractions mitochondriales (mito-p).
Figure 2. A) montre western blots mer afin de vérifier la pureté et la distribution des cytosolique, ER et des marqueurs mitochondriaux dans cytosolique (cyto) -, ER-, pures fractions mitochondriales (mito-p) -. Et MAM-fractions B) Western blot de l' purifiée glycosphingolipides microdomaines enrichis (GEM) et Triton X-100 (extraits Triton extr. SMMA) fractions isolées de la SMMA.
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Discussion
Les sites de contact entre les membranes intracellulaires ou organites entre la membrane plasmique des cellules plates-formes représentent dynamiques de signalisation pour les processus cellulaires de base. La caractérisation précise de leur fonction et la composition dans les deux conditions physiologiques et pathologiques nécessite des protocoles de purification fiables et reproductibles. Les méthodes décrites ici ont été spécifiquement optimisés par notre laboratoire pour l'isolement et la purification des MMA et de leurs gemmes correspondantes du cerveau de souris adulte. Ce protocole a été appliqué avec succès pour l'identification des effecteurs moléculaires qui spécifient ces microdomaines, et sous-tendent l'aval de la voie apoptotique de Ca 2 + déséquilibre conduisant à la mort des cellules neuronales dans une maladie neurodégénérative métabolique chez les enfants 4.
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Disclosures
Aucun des auteurs n'a de conflit d'intérêt à déclarer.
Acknowledgments
Nous reconnaissons la contribution de Renata Sano à concevoir le protocole initial. Ad'A. détient les bijoutiers pour les enfants (JFC) de la chaire de génétique et thérapie génique. Ce travail a été financé en partie par des subventions du NIH GM60905, DK52025 et CA021764, et les américains libanais syriens Associated Charities (ALSAC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Fractionation | |||
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S-5761 | |
| Magnesium Chloride, Hexahydrate | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| Calcium Chloride, Dihydrate | Sigma-Aldrich | C-5080 | |
| MAM | |||
| D-Mannitol | Sigma-Aldrich | M9546-250G | |
| Hepes | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378-250G | |
| BSA, Fraction V, Heat Shock, Lyophilizate | Roche | 03-116-964-001 | |
| Percoll | GE | 17-0891-02 | |
| GEM | |||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284-500 ml | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-3 | |
| Tris Base | Roche | 03-118-142-001 | |
| HCl | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120-500 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Fisher Scientific | BP166-500 | |
| Common | |||
| Protease Inhibitors Tablets, Complete EDTA-free | Roche | 11-873-580-001 | |
| EQUIPMENT | |||
| 2 ml Douce All-Glass Tissue Grinders | Kimble Chase | 885300-0002 | |
| 15 ml Polypropylene Conical Centrifuge Tubes, BD Falcon | BD | 352097 | |
| 30 ml Round-Bottom Glass Centrifuge Tubes | Kimble Chase | 45500-30 | |
| 15 ml Round-Bottom Glass Centrifuge Tubes | Kimble Chase | 45500-15 | |
| Ultracentrifuge tubes, Ultra-Clear, Thinwall, 14x89 mm | Beckman-Coulter | 344059 | |
| Parafilm | Cole-Parmer | PM996 | |
| Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets, 9" | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
References
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