Summary
Dieser Vorgang zeigt, wie aus dem erwachsenen Gehirn der Maus die Mitochondrien-assoziierte ER Membranen oder MAMs und den Glykosphingolipid angereicherten Mikrodomänen Fraktionen aus MAMs und mitochondrialen Vorbereitungen zu isolieren.
Abstract
Intrazellulären Organellen sind hochdynamische Strukturen mit unterschiedlicher Form und Zusammensetzung, die Zell-spezifischen intrinsischen und extrinsischen Hinweise ausgesetzt sind. Ihre Membranen werden häufig an definierten Kontaktstellen, die Naben für den Austausch von Signalmolekülen und Membrankomponenten 1,2,3,4 geworden gegenübergestellt. Die miteinander organellären Membranmikrodomänen, die zwischen dem endoplasmatischen Retikulum (ER) und den Mitochondrien bei der Öffnung des IP3-Ca 2 +-Kanal als den Mitochondrien-ER zugehörigen Membranen oder MAMs 4,5,6 bekannt sind ausgebildet sind. Das Protein / Lipid-Zusammensetzung und biochemischen Eigenschaften dieser Membran Kontaktstellen wurden ausgiebig insbesondere in Bezug auf ihre Rolle bei der Regulierung der intrazellulären Ca 2 + 4,5,6 untersucht. Die ER dient als primären Speicher von intrazellulärem Ca 2 +, und reguliert in diesem Rahmen eine Vielzahl von zellulären Prozessen stromabwärts von Ca 2 +-Signalisierung, inkl.uding posttranslationale Proteinfaltung und Protein maturation7. Mitochondrien, auf der anderen Seite aufrechtzuerhalten Ca 2 +-Homöostase durch Puffern zytosolischen Ca 2 +-Konzentration wodurch die Einleitung Apoptosewege stromabwärts von Ca 2 + 4,8 Unwucht. Der dynamische Charakter der MAMs macht sie zu idealen Standorte, um grundlegende zelluläre Mechanismen, einschließlich Ca 2 +-Signalisierung und Regulation der mitochondrialen Ca 2 +-Konzentration, Lipid-Biosynthese und Transport, Energiestoffwechsel und das Überleben der Zelle 4,9,10,11,12 sezieren. Mehrere Protokolle wurden für die Reinigung dieser Mikrodomänen aus Lebergewebe und kultivierten Zellen 13,14 beschrieben.
Unter zuvor publizierten Methoden in Betracht, haben wir ein Protokoll für die Isolierung von Mitochondrien und MAMs vom erwachsenen Mäusehirn angepasst. Um dieses Verfahren haben wir eine zusätzliche Reinigungsstufe, nämlich ein Triton X100 Extraktion hinzugefügt, die enables die Isolierung des Glycosphingolipid angereicherten Mikrodomäne (GEM) Bruchteil der MAMs. Diese Zubereitungen GEM teilen sich mehrere Proteinkomponenten mit Caveolae und Lipidflößen, aus der Plasmamembran oder anderen intrazellulären Membranen abgeleitet und vorgeschlagen, als Sammelpunkte für die Bündelung von Rezeptorproteinen und für Protein-Protein-Wechselwirkungen 4,15 funktionieren.
Protocol
Das folgende Protokoll ist für die Isolierung und Aufreinigung von MAMs und Edelsteine aus Maushirn bestimmt
Lösungen für die Isolierung von Mitochondrien, MAMs und Edelsteine benötigt
Fraktionierung, um rohes mitochondrialen Präparation zu erhalten:
Lösung A: 0,32 M Saccharose, 1 mM NaHCO 3, 1 mM MgCl 2, 0,5 mM CaCl 2 + Protease-Inhibitoren (add frisch, je nach Bedarf)
Lösung B: 0,32 M Saccharose, 1 mM NaHCO 3 + Protease-Inhibitoren (add frisch, je nach Bedarf)
MAMs Isolation:
Isolierung Medium: 250 mM Mannit, 5 mM HEPES, pH 7,4, 0,5 mM EGTA, 0,1% BSA
Gradient Puffer: 225 mM Mannitol, 25 mM HEPES pH 7.5, 1 mM EGTA, 0,1% BSA (Endkonzentration)
GEMs Isolation:
Inhalt "> GEM Extraction Buffer: 25 mM HEPES pH 7,5, 0,15 M NaCl, 1% Triton X-100 + Protease-Inhibitoren (add frisch, je nach Bedarf)GEM solubilisierende Puffer: 50 mM Tris-HCl, pH 8,8, 5 mM EDTA, 1% SDS + Protease-Inhibitoren (add frisch, je nach Bedarf).
Ein. First Step subzelluläre Fraktionierung: Entfernen der Kerne, lysierten Zellen und Zelltrümmer
- Einschläfern Maus in CO 2-Kammer.
- Umgehend entfernen Gehirn, halbieren, legen in 2 ml Röhrchen auf Eis und wiegen.
Hinweis: Bewahren Sie Gehirnhälften separaten während des gesamten Verfahrens. Das gilt für die Behandlung von einem einzigen Gehirn Hälfte.
- Die Hälfte Gehirn in einer vorgekühlten 2 ml Glas Dounce Gewebe Mahlwerk mit 1 ml kaltem Lösung A. mit insgesamt 15 Schlägen eines großen Freiraum Pistill homogenisiert.
- Transfer zu einem 15 ml Falcon-Röhrchen auf Eis und verdünnterHomogenate bis zu 10 Volumina w / v, z. B. 0,225 g bis 2,25 ml.
- Zentrifuge Proben bei 1.400 xg für 10 min bei 4 ° C.
- Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und Transfer zu einem 30 ml-Rundkolben aus Glas Zentrifugenröhrchen auf Eis. Achten Sie darauf, um das Pellet zu stören.
- Resuspendieren des Pellets in der gleichen 10 Volumen Lösung A. Homogenisieren in derselben Schleifmaschine, mit 3-6 Striche eines kleinen Zwischenraum Pistill, 1 ml auf einmal.
- Übertragen zu einem frischen 15 ml Falcon-Röhrchen und Zentrifuge bei 710 × g für 10 min bei 4 ° C. Dies führt zu einem Pellet von Kerne und Zelltrümmer.
- Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und Pool mit dem Überstand in Schritt 1,6 gespeichert.
2. Zweiter Schritt: Crude Mitochondrien Isolation
- Zentrifuge Überstände bei 13.800 × g für 10 min bei 4 ° C.
- Überstand in ein Ultra-Clear Beckman Zentrifugenröhrchen auf Eis
- Pellet in 10 Volumen Lösung A. Homogenisieren in derselben Schleifmaschine, mit 3-6 Striche eines kleinen Zwischenraum Pistill, 1 ml auf einmal.
- Zentrifuge nach Schritt 2.1.
- Wiederholen Sie die Schritte 2,2-2,4.
- Das resultierende Pellet ist eine angereicherte mitochondrialen Fraktion. Pool die Überstände (Cytosol und ER), mit Parafilm abdecken und auf Eis.
- Das Pellet mit 6 Striche eines kleinen Zwischenraum Pistill in 4,8 ml / g (g wird auf die ursprüngliche Gehirngewicht bezeichnet) der Lösung B, in einer frischen Homogenisator.
- Verwendung von Glas Pasteurpipetten, bereiten einen diskontinuierlichen Sucrosegradienten in einem Ultra-Clear Beckman Zentrifuge Rohr, das Hinzufügen anschließend dem Boden des Röhrchens wie folgt, sorgfältig sichergestellt keine Blasen gebildet werden:
Resupended Pellet (0,32 M Saccharose)
3 ml 850 mM Saccharose (in 1 mM NaHCO 3)
3 ml 1 M Saccharose (in 1 mM NaHCO 3)
3 ml 1,2 M Sucrose (in 1 mM NaHCO3) - Zentrifugieren bei 82.500 × g für 2 Stunden bei 4 ° C. Die resultierende Trennung am Ende des Gradienten wird erzeugen drei Bands und ein Pellet: 1) Myelin und anderen Kontaminanten Membran (0,32 M - 0,85 M-Schnittstelle), 2) ER, Golgi, Plasmamembranen (0,85 M - 1 M-Schnittstelle); 3) Synaptosomen (1 M - 1,2 M-Schnittstelle), 4) Rohprodukt Mitochondrien (Pellet), das für die nachfolgenden Reinigungsstufen verwendet
3. Isolierung von Mitochondrien-assoziierte ER Membran, MAMs
- Resuspendieren des frisch isolierten rohen Mitochondrien von einer Gehirnhälfte, in 2 ml Isolation Medium mit frisch hinzugefügten Protease-Inhibitoren.
- Bereiten Sie eine 30% Percoll Gradienten mit Gradient Puffer 8 ml pro halbe Gehirn, und in einem Ultra-Clear Beckman Zentrifuge Tube.
* Hinweis: Achten Gradientenpuffer konzentrierter (1,43 mal), um die korrekte Endkonzentration nach d zu erreicheniluting Percoll und 30%.
- Layer mitochondriale Suspension auf der vorbereiteten Gradienten langsam zu vermeiden Blasen.
- Zentrifugieren bei 95.000 × g für 30 min, 4 ° C.
- Entfernen Sie die schwere Fraktion (unteres Band) FIRST mit einem Glas Pasteur Pipette und Transfer zu einem frischen Rundkolben Glasrohr, auf Eis.
- Entfernen Sie die leichte Fraktion (oberes Band) SECOND mit einem anderen Glas Pasteur Pipette und Transfer zu einem separaten frischen Rundkolben Glasrohr, auf Eis.
- Verdünnte beide Fraktionen in Schritt 3.5 mit 10 ml Isolationsmedium und Zentrifuge gesammelt bei 6.300 xg für 10 min bei 4 ° C.
- Verwerfen des Überstands aus der schweren Fraktion in Schritt 3,6 erhalten wird, das Pellet mit weiteren 10 ml Isolationsmedium und zentrifugieren, wie in Schritt 3.6. Das resultierende Pellet wird die reine mitochondriale Fraktion sein.
- Den Überstand aus dem Licht Fraction in Schritt 3,6 bis einem Ultra-Clear Beckman Zentrifugenröhrchen erhalten, auf Eis. Entsorgen Sie die Pellets.
- Hinzufügen ausreichender Isolation Medium zu dem Überstand in Schritt erhaltenen 3,8, um das Rohr und Zentrifuge bei 100.000 × g für 1 Stunde, 4 ° C zu füllen Das resultierende Pellet wird die MAMs Bruch sein. Entfernen Sie vorsichtig und den Überstand verwerfen.
Hinweis: Bei diesem Schritt können Sie auch bei 100.000 xg zentrifugieren für 1 Stunde, 4 ° C wird der Überstand in Schritt 2,6 gespeichert. Das Pellet wird der ER-Fraktion sein, und der Überstand der cytosolischen Fraktion.
4. Extraktion von Glycosphingolipid angereichert Mikrodomänen, GEMs
- Lyse pure Mitochondrien und / oder MAM Fraktionen in 500 ul-1 ml Extraktionspuffer für 20 min auf Eis.
- Zentrifuge Lysaten bei 15.300 × g für 2 Minuten bei 4 ° C.
- Sammle Überstände (Triton X-100 löslichen Material) und re-Zentrifuge Pelletsfür 2 min zu entfernen verbleibende lösliche Material. (Triton X-100 extrahiert Mitochondrien und / oder Triton X-100 extrahiert MAMs).
- Solubilisierung Pellets in Lösungsvermittler Buffer. Diese solubilisierten Materials stellt die GEM Fraktionen und können zur weiteren Analyse verwendet werden.
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Representative Results
Basierend auf unserer Erfahrung mit der Verwendung dieses Protokoll können wir sicher empfehlen es für die Isolierung und Reinigung von MAMs, Edelsteine und mitochondriale Fraktionen aus Mäusehirn. Das Verfahren wie oben in hohem Maße reproduzierbar und konsistent. In Abbildung 1 zeigen wir ein repräsentatives Bild des Weges pure Mitochondrien und MAMs Schicht auf einem Percoll-Gradienten (Schritt 3,4). Eine definierte, milchige Band enthaltenden gereinigten Mitochondrien (Mito-P) segregiert am unteren Rohr der Ultrazentrifuge, während die MAM Fraktion bildet ein diffuser und breitbandig über der Mitochondrien. Nach sorgfältiger Rückgewinnung der einzelnen Gradienten Banden werden die gereinigten Fraktionen in einem Lysepuffer resuspendiert, auf SDS-Polyacrylamidgelen aufgetrennt und auf PVDF-Membranen. Blots werden dann sondiert mit einer Batterie von Antikörpern zur spezifischen Proteinmarker, die die Reinheit der Fraktionen und ihre Proteinzusammensetzung ermitteln wird. 2A zeigt die Verteilung der CytosOlic, ER und Mitochondrien Marker in den isolierten MAMs und mitochondriale Fraktionen. Reine Mitochondrien Präparate sollten frei von beiden ER und cytosolischen Marker. Die enge Apposition zwischen ER und Mitochondrien-Membranen bei der MAM Kontaktstellen erklärt das Vorhandensein von Calreticulin (ER Marker) und Tom-20 (Mitochondrien Marker) in diesen gereinigten Präparaten. Es ist auch möglich, spezifische Marker MAMs FACL4 und PACS2 sowie anderen Markern innerhalb dieser Domänen angereichert, wie IP3R-1 und Grp75 4. Die MAMs kann weiter mit Triton X-100 extrahiert werden, um die Edelsteine zu erhalten. Diese Mikrodomänen, die Bestandteile von Lipidflößen und / oder enthalten, sind Caveolae Caveolin-1-positiven wie in 2B gezeigt.
Abbildung 1. Zeigt ein Bild von der Schichtung des mitochondrialen-assoziierte ER-Membran (MAMs) und die reinemitochondriale Fraktionen (mito-p).
Abbildung 2. A) zeigt Westernblots ausführen, um die Reinheit und die Verteilung der cytosolischen, ER und Mitochondrien Marker in Cytosolic (Cyto) zu überprüfen -, ER-, reine mitochondriale Fraktionen (mito-p) -. Und MAM-Fraktionen B) Western-Blots der gereinigt Glykosphingolipid angereichert Mikrodomänen (GEM) und Triton X-100 extrahiert (Triton extr. MAMs) Fraktionen aus MAMs isoliert.
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Discussion
Die Stellen des Kontakts zwischen intrazellulären Membranen oder zwischen Organellen und der Plasmamembran von Zellen repräsentieren dynamischen Signalisierung Plattformen für grundlegende zelluläre Prozesse. Die genaue Charakterisierung ihrer Funktion und Zusammensetzung sowohl unter physiologischen und pathologischen Bedingungen erfordert zuverlässige und reproduzierbare Reinigung Protokolle. Die Verfahren detailliert hier wurden speziell von unserem Labor zur Isolierung und Aufreinigung der MAMs und ihre entsprechenden GEMs vom erwachsenen Mäusehirn optimiert. Dieses Protokoll wurde erfolgreich zur Identifizierung der molekularen Effektoren, die diese angeben Mikrodomänen und liegen den apoptotischen Weg stromabwärts von Ca 2 +-Ungleichgewicht führt zu neuronalen Zelltod in einer neurodegenerativen Erkrankung bei Kindern metabolischen 4 umgesetzt.
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Disclosures
Keiner der Autoren keine Interessenkonflikte zu erklären.
Acknowledgments
Wir erkennen den Beitrag von Renata Sano in der Konzeption des ersten Protokolls. Ad'A. hält die Jewelers Für Kinder (JFC) Stiftungsprofessur für Genetik und Gentherapie. Diese Arbeit wurde zum Teil durch NIH Zuschüsse GM60905, DK52025 und CA021764, und den amerikanischen libanesischen syrischen Assoziierte Charities (ALSAC) finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Fractionation | |||
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S-5761 | |
| Magnesium Chloride, Hexahydrate | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| Calcium Chloride, Dihydrate | Sigma-Aldrich | C-5080 | |
| MAM | |||
| D-Mannitol | Sigma-Aldrich | M9546-250G | |
| Hepes | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378-250G | |
| BSA, Fraction V, Heat Shock, Lyophilizate | Roche | 03-116-964-001 | |
| Percoll | GE | 17-0891-02 | |
| GEM | |||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284-500 ml | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-3 | |
| Tris Base | Roche | 03-118-142-001 | |
| HCl | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120-500 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Fisher Scientific | BP166-500 | |
| Common | |||
| Protease Inhibitors Tablets, Complete EDTA-free | Roche | 11-873-580-001 | |
| EQUIPMENT | |||
| 2 ml Douce All-Glass Tissue Grinders | Kimble Chase | 885300-0002 | |
| 15 ml Polypropylene Conical Centrifuge Tubes, BD Falcon | BD | 352097 | |
| 30 ml Round-Bottom Glass Centrifuge Tubes | Kimble Chase | 45500-30 | |
| 15 ml Round-Bottom Glass Centrifuge Tubes | Kimble Chase | 45500-15 | |
| Ultracentrifuge tubes, Ultra-Clear, Thinwall, 14x89 mm | Beckman-Coulter | 344059 | |
| Parafilm | Cole-Parmer | PM996 | |
| Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets, 9" | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
References
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