Summary
Deze procedure laat zien hoe u te isoleren van de volwassen hersenen van muizen de mitochondriën-geassocieerde ER membranen of Mams en de glycosfingolipiden verrijkte microdomain fracties uit Mams en mitochondriale preparaten.
Abstract
Intracellulaire organellen zijn zeer dynamische structuren met verschillende vorm en samenstelling, die onderworpen zijn aan celspecifieke intrinsieke en extrinsieke signalen. De membranen zijn vaak naast elkaar op gedefinieerde contact sites die worden hubs voor de uitwisseling van signaalmoleculen en membranen 1,2,3,4. De inter-organellen membraan microdomeinen die gevormd tussen het endoplasmatisch reticulum (ER) en de mitochondriën in de opening van de IP3-gevoelige Ca 2 + kanaal staan bekend als de mitochondria bijbehorende ER-membranen of 4,5,6 eigen MTM. Het eiwit / lipiden en biochemische eigenschappen van deze membraan contactplaatsen zijn uitgebreid bestudeerd met name wat betreft hun rol bij het reguleren van intracellulaire Ca2 + 4,5,6. De ER dient als de primaire opslag van intracellulaire Ca 2 +, en in die hoedanigheid regelt een groot aantal cellulaire processen stroomafwaarts van Ca 2 + signalering, inclUding post-translationele vouwing van eiwitten en eiwit maturation7. Mitochondria, anderzijds, behouden Ca2 + homeostase, door buffering cytosolische Ca2 + concentratie waardoor ze de inleiding van apoptotische routes stroomafwaarts van Ca 2 + 4,8 onbalans. Het dynamische karakter van de eigen MTM maakt ze ideaal sites te ontleden elementaire cellulaire mechanismen, met inbegrip van Ca 2 + signalisatie en regulatie van mitochondriale Ca 2 + concentratie, lipide biosynthese en het transport-, energie-metabolisme en celoverleving 4,9,10,11,12. Verschillende protocollen zijn beschreven voor de zuivering van deze microdomeinen van leverweefsel en gekweekte cellen 13,14.
Eerder gepubliceerde werkwijzen waarbij rekening hebben we een aangepast protocol voor de isolatie van mitochondria en eigen MTM van de volwassen muizenhersenen. Deze procedure hebben we een extra zuiveringsstap, namelijk een Triton X100 extractie, dat enables het isolement van de glycosfingolipiden verrijkte microdomain (GEM) fractie van de eigen MTM. Deze preparaten GEM delen verschillende eiwitcomponenten met caveolae en lipide rafts, afkomstig van het plasmamembraan of andere intracellulaire membranen en voorgesteld om als verzamelen punten voor de clustering van receptor eiwitten en eiwit-eiwit interacties 4,15.
Protocol
Het volgende protocol is bedoeld voor de isolatie en zuivering van Mams en parels van muizenhersenen
Oplossingen die nodig zijn voor Isolatie van mitochondriën, Mams en GEM
Fractionering van ruwe mitochondriale preparaat te verkrijgen:
Oplossing A: 0,32 M sucrose, 1 mM NaHCO 3, 1 mM MgCl2, 0,5 mM CaCl2 + proteaseremmers (vers toevoegen indien nodig)
Oplossing B: 0,32 M sucrose, 1 mM NaHCO 3 + proteaseremmers (vers toevoegen indien nodig)
Eigen MTM Isolatie:
Isolatie Medium: 250 mM Mannitol, 5 mM HEPES pH 7,4, 0,5 mM EGTA, 0,1% BSA
Gradient Buffer: 225 mM Mannitol, 25 mM HEPES pH 7,5, 1 mM EGTA, 0,1% BSA (eindconcentratie)
GEM Isolatie:
content "> GEM extractiebuffer: 25 mM HEPES pH 7,5, 0,15 M NaCl, 1% Triton X-100 + proteaseremmers (vers toevoegen indien nodig)GEM oplosbaar Buffer: 50 mM Tris-HCl, pH 8,8, 5 mM EDTA, 1% SDS + proteaseremmers (voeg verse, indien nodig).
1. Eerste stap subcellulaire fractionering: Verwijdering van Kernen, niet-gelyseerde cellen en cellulaire puin
- Euthanaseren muis in CO 2 kamer.
- Verwijder onmiddellijk hersenen, te halveren, te plaatsen in 2 ml buisjes op ijs en weeg.
Opmerking: Bewaar hersenhelften gescheiden gedurende de gehele procedure. Geldt voor de behandeling van een hersenhelft.
- Place half hersenen in een voorgekoeld 2 ml glazen Dounce weefsel molen met 1 ml koude oplossing A. gehomogeniseerd met 15 slagen van een totale grote ruimte stamper.
- Naar een 15 ml falcon-buis, op ijs en verdundhomogenaten tot 10 volumes w / v, bijvoorbeeld 0,225 tot 2,25 g ml.
- Centrifugeer monster bij 1400 g gedurende 10 min bij 4 ° C.
- Verwijder het supernatant overgebracht in een 30 ml rondbodem glazen centrifugebuis, op ijs. Zorg ervoor dat u de pellet te verstoren.
- Resuspendeer de pellet in dezelfde 10 volumedelen oplossing A. Homogeniseer in dezelfde molen, met 3-6 slagen van een kleine speling stamper, 1 ml per keer.
- Naar een vers 15 ml falcon-buis en centrifugeer bij 710 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Dit resulteert in een pellet van kernen en celafval.
- Verwijder voorzichtig het supernatant en het zwembad met de bovenstaande vloeistof opgeslagen in stap 1.6.
2. Tweede stap: Ruwe Mitochondria Isolatie
- Centrifugeer supernatanten bij 13.800 xg gedurende 10 min bij 4 ° C.
- Overdracht supernatant aan een Ultra-Clear Beckman Centrifuge Tube, op ijs
- Hersuspendeer pellet in 10 volumes oplossing A. Homogeniseer in dezelfde molen, met 3-6 slagen van een kleine speling stamper, 1 ml per keer.
- Centrifuge als stap 2.1.
- Herhaal de stappen 2,2-2.4.
- De resulterende pellet is een verrijkte mitochondriale fractie. De supernatants (cytosol en ER), dek af met parafilm en blijf op ijs.
- Resuspendeer de pellet met 6 slagen van een kleine speling stamper, in 4,8 ml / g (g wordt verwezen naar de oorspronkelijke hersengewicht) oplossing B, in een nieuwe homogenisator.
- Gebruik van glazen Pasteur pipetten, stelt een discontinue sucrosegradiënt in een Ultra-Clear Beckman centrifugebuis toevoegen vervolgens naar de bodem van de buis als volgt zorgvuldig, zodat er geen bellen gevormd:
Resupended Pellet (0,32 M sucrose)
3 ml 850 mM Sucrose (in 1 mM NaHCO 3)
3 ml 1 M Sucrose (in 1 mM NaHCO 3)
3 ml 1,2 M Sucrose (in 1 mM NaHCO3) - Centrifugeer bij 82.500 xg gedurende 2 uur bij 4 ° C. De resulterende scheiding aan het einde van de gradiënt produceert drie banden en een pellet: 1) myeline en andere membraan verontreinigingen (0,32 M - 0,85 M interface), 2) ER, Golgi, plasmamembranen (0,85 M - 1 M interface); 3) synaptosomen (1 M - 1,2 M interface); 4) mitochondria ruwe (pellet) die wordt gebruikt voor de daaropvolgende zuiveringsstappen
3. Isolatie van mitochondriën-geassocieerde ER membraan, eigen MTM
- Resuspendeer de vers geïsoleerde ruwe mitochondriën van de ene hersenhelft, in 2 ml isolatiemedium voorzien van vers toegevoegde protease remmers.
- Bereid een 30% Percoll verloop met Gradient Buffer 8 ml per half hersenen, en plaats in een Ultra-Clear Beckman centrifugebuis.
* Opmerking: Zorg gradiëntbuffer meer geconcentreerd (1,43 keer) om de juiste uiteindelijke concentratie na d te bereikeniluting Percoll tot 30%.
- Layer mitochondriale schorsing op de top van bereide gradiënt LANGZAAM om luchtbelletjes te voorkomen.
- Centrifugeer bij 95.000 xg gedurende 30 min, 4 ° C.
- Verwijder de zware fractie (onderste band) eerst met een glazen Pasteur pipet en over te dragen aan een nieuwe ronde bodem glazen buis, op ijs.
- Verwijder de lichte fractie (bovenste band) TWEEDE met een ander glas Pasteur pipet en over te dragen aan een aparte nieuwe ronde bodem glazen buis, op ijs.
- Verdun beide fracties in stap 3.5 met 10 ml isolatiemedium en centrifugeer bij 6300 g gedurende 10 min bij 4 ° C.
- Verwijder het supernatant van de zware fractie verkregen in stap 3.6, resuspendeer de pellet met nog eens 10 ml isolatiemedium en centrifugeer weer als punt 3.6. De resulterende pellet wordt het pure mitochondriale fractie zijn.
- Decanteer het supernatans van het Licht Fractie verkregen in stap 3.6 tot een Ultra-Clear Beckman Centrifuge Tube, op ijs. Gooi de pellet.
- Voeg voldoende isolatiemedium de supernatant verkregen in stap 3.8 de buis en centrifugeer bij 100.000 xg gedurende 1 uur vullen, 4 ° C. De resulterende pellet wordt de eigen MTM fractie zijn. Verwijder voorzichtig en gooi het supernatant.
Let op: Bij deze stap, kunt u ook bij 100.000 xg gecentrifugeerd gedurende 1 uur, 4 ° C het supernatant opgeslagen bij stap 2.6. De pellet wordt het ER fractie zijn en de cytosolische fractie supernatant.
4. Extractie van glycosfingolipiden-verrijkt microdomeinen, GEM
- Lyse pure mitochondria en / of MAM fracties in 500 ul-1 ml extractiebuffer gedurende 20 minuten op ijs.
- Centrifugeer lysaten bij 15.300 xg gedurende 2 min bij 4 ° C.
- Verzamel supernatanten (Triton X-100 oplosbaar materiaal) en re-centrifuge pelletsgedurende 2 minuten om de nog oplosbaar materiaal. (Triton X-100 geëxtraheerd Mitochondria en / of Triton X-100 geëxtraheerd eigen MTM).
- Oplosbaar pellets in het oplosbaar maken Buffer. Dit oplosbaar materiaal vertegenwoordigt de GEM fracties en kan worden gebruikt voor verdere analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Op basis van onze ervaring met het gebruik van dit protocol kunnen we veilig het aanraden voor de isolatie en zuivering van Mams, edelstenen en mitochondriale fracties van hersenen van muizen. De procedure als aangegeven is zeer reproduceerbaar en consistent. In figuur 1 tonen we een representatief beeld van de manier waarop pure mitochondria en eigen MTM laag op een Percoll gradiënt (stap 3.4). Een gedefinieerde, melkachtig band die gezuiverde mitochondria (Mito-P) scheidt onderaan de ultracentrifuge buis, terwijl de MAM fractie vormt een diffuse en brede band boven de mitochondria. Na zorgvuldige herstel van de individuele gradient banden worden de gezuiverde fracties opnieuw gesuspendeerd in een lysis buffer, gescheiden op SDS polyacrylamide gels en geblot op PVDF-membranen. Blots worden dan geprobed met een batterij van antilichamen tegen specifieke markers eiwit dat de zuiverheid van de fracties en hun eiwitsamenstelling zal worden bepaald. Figuur 2A toont de verdeling van CytosOlic, ER en mitochondriale markers in de geïsoleerde Mams en mitochondriale fracties. Pure mitochondriën voorbereidingen moeten verstoken van zowel ER en cytosolische markers. De nauwe appositie tussen ER en membranen bij de MAM contactplaatsen verklaart de aanwezigheid van calreticulin (ER marker) en Tom-20 (mitochondriën marker) in deze gezuiverde preparaten. Het is ook mogelijk om eigen MTM specifieke markers FACL4 en PACS2, en andere markers verrijkt in deze domeinen, zoals IP3R-1 en GRP75 4. De eigen MTM kan verder worden geëxtraheerd met Triton X-100 aan de GEM verkrijgen. Deze microdomeinen, welke componenten van lipide rafts en / of caveolae bevatten zijn caveoline-1 positieve zoals getoond in figuur 2B.
Figuur 1. Toont een beeld van de gelaagdheid van de mitochondriale membraan-geassocieerde ER (eigen MTM) en puremitochondriale fracties (mito-p).
Figuur 2. A) Toont western blots uitgevoerd om de zuiverheid en de verdeling van de cytosolische, ER en mitochondriale markers in Cytosolic (cyto) check -, ER-, pure mitochondriale fracties (mito-p) -. En MAM-fracties B) Western blots van de gezuiverd glycosfingolipiden verrijkt microdomeinen (GEM) en Triton X-100 geëxtraheerd (Triton extr. eigen MTM) fracties geïsoleerd uit eigen MTM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De sites van contact tussen intracellulaire membranen of tussen organellen en het plasmamembraan van cellen vertegenwoordigen dynamische signalering platforms voor basale cellulaire processen. De nauwkeurige karakterisering van hun functie en de samenstelling zowel onder fysiologische en pathologische condities vereist betrouwbare en reproduceerbare zuivering protocollen. De hier beschreven methoden zijn specifiek geoptimaliseerd door ons laboratorium voor de isolatie en zuivering van de Mams en hun overeenkomstige parels uit de volwassen muizenhersenen. Dit protocol is met succes toegepast voor de identificatie van de moleculaire effectoren deze microdomeinen geven en grondslag liggen aan de apoptotische route stroomafwaarts van Ca 2 + onbalans leiden tot neuronale celdood in neurodegeneratieve een stofwisselingsziekte bij kinderen 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen van de auteurs hebben belangenconflicten te verklaren.
Acknowledgments
Wij erkennen de bijdrage van Renata Sano in het concipiëren van het eerste protocol. Ad'A. houdt de Juweliers For Children (JFC) leerstoel in de genetica en gentherapie. Dit werk werd deels gefinancierd door NIH subsidie GM60905, DK52025 en CA021764, en de Amerikaanse Libanese Syrische Associated Charities (ALSAC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Fractionation | |||
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S-5761 | |
| Magnesium Chloride, Hexahydrate | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| Calcium Chloride, Dihydrate | Sigma-Aldrich | C-5080 | |
| MAM | |||
| D-Mannitol | Sigma-Aldrich | M9546-250G | |
| Hepes | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378-250G | |
| BSA, Fraction V, Heat Shock, Lyophilizate | Roche | 03-116-964-001 | |
| Percoll | GE | 17-0891-02 | |
| GEM | |||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284-500 ml | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-3 | |
| Tris Base | Roche | 03-118-142-001 | |
| HCl | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120-500 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Fisher Scientific | BP166-500 | |
| Common | |||
| Protease Inhibitors Tablets, Complete EDTA-free | Roche | 11-873-580-001 | |
| EQUIPMENT | |||
| 2 ml Douce All-Glass Tissue Grinders | Kimble Chase | 885300-0002 | |
| 15 ml Polypropylene Conical Centrifuge Tubes, BD Falcon | BD | 352097 | |
| 30 ml Round-Bottom Glass Centrifuge Tubes | Kimble Chase | 45500-30 | |
| 15 ml Round-Bottom Glass Centrifuge Tubes | Kimble Chase | 45500-15 | |
| Ultracentrifuge tubes, Ultra-Clear, Thinwall, 14x89 mm | Beckman-Coulter | 344059 | |
| Parafilm | Cole-Parmer | PM996 | |
| Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets, 9" | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
References
- Poburko, D., Kuo, K. H., Dai, J., Lee, C. H., van Breemen, C. Organellar junctions promote targeted Ca2+ signaling in smooth muscle: why two membranes are better than one. Trends Pharmacol. Sci. 25 (1), 8-15 (2004).
- Pani, B., Ong, H. L., Liu, X., Rauser, K., Ambudkar, I. S., Singh, B. B. Lipid rafts determine clustering of STIM1 in endoplasmic reticulum-plasma membrane junctions and regulation of store-operated Ca2+ entry (SOCE. J. Biol. Chem. 283 (25), 17333-17340 (2008).
- Levine, T., Rabouille, C. Endoplasmic reticulum: one continuous network compartmentalized by extrinsic cues. Curr. Opin. Cell Biol. 17 (4), 362-368 (2005).
- Sano, R., Annunziata, I., Patterson, A., Moshiach, S., Gomero, E., Opferman, J., Forte, M., d'Azzo, A. GM1-ganglioside accumulation at the mitochondria-associated ER membranes links ER stress to Ca(2+)-dependent mitochondrial apoptosis. Mol. Cell. 36 (3), 500-511 (2009).
- Raturi, A., Simmen, T. Where the endoplasmic reticulum and the mitochondrion tie the knot: The mitochondria-associated membrane (MAM). Biochim. Biophys. Acta. , (2012).
- Giorgi, C., De Stefani, D., Bononi, A., Rizzuto, R., Pinton, P. Structural and functional link between the mitochondrial network and the endoplasmic reticulum. Int. J. Biochem. Cell Biol. 41 (10), 1817-1827 (2009).
- d'Azzo, A., Tessitore, R. Sano Gangliosides as apoptotic signals in ER stress response. Cell Death Differ. 13, 404-414 (2006).
- Kroemer, G., Galluzzi, L., Brenner, C. Mitochondrial membrane permeabilization in cell death. Physiol. Rev. 87, 99-163 (2007).
- Rizzuto, R., Brini, M., Murgia, M., Pozzan, T. Microdomains with high Ca2+ close to IP3-sensitive channels that are sensed by neighboring mitochondria. Science. 262, 744-747 (1993).
- Lynes, E. M., Bui, M., Yap, M. C., Benson, M. D., Schneider, B., Ellgaard, L., Berthiaume, L. G., Simmen, T. Palmitoylated TMX and calnexin target to the mitochondria-associated membrane. EMBO J. 31 (2), 457-470 (2011).
- Fujimoto, M., Hayashi, T., Su, T. P. The role of cholesterol in the association of endoplasmic reticulum membranes with mitochondria. Biochem. Biophys. Res. Commun. 417 (1), 635-639 (2012).
- Grimm, S. The ER-mitochondria interface: the social network of cell death. Biochim. Biophys. Acta. 1823 (2), 327-334 (2012).
- Vance, J. E. Phospholipid synthesis in a membrane fraction associated with mitochondria. J. Biol. Chem. 265, 7248-7256 (1990).
- Wieckowski, M. R., Giorgi, C., Lebiedzinska, M., Duszynski, J., Pinton, P. Isolation of mitochondria-associated membranes and mitochondria from animal tissues and cells. Nat. Protoc. 4 (11), 1582-1590 (2009).
- Pizzo, P., Viola, A. Lymphocyte lipid rafts: structure and function. Curr. Opin. Immunol. 15 (3), 255-260 (2003).
