Summary
この手順では、成体マウスの脳ミトコンドリア関連のER膜またはMAMSとMAMSとミトコンドリア調製物からスフィンゴ糖脂質に富むマイクロドメイン画分から単離する方法を示しています。
Abstract
細胞内小器官は、細胞特異的内因性および外因性の刺激にさらされる形状および組成を変化させると非常にダイナミックな構造です。その膜は、しばしば、シグナル伝達分子や膜成分1,2,3,4の交換のためのハブとなって定義されている接触部位で並置されている。 IP3は敏感なCa 2 +チャネルの開口部には小胞体（ER）とミトコンドリアの間に形成されている間オルガネラ膜マイクロドメインは、ミトコンドリア関連する- ER膜またはMAMS 4,5,6として知られている。タンパク質/脂質組成およびこれらの膜の接触部位の生化学的特性は、広範囲に、特に細胞内Ca 2 + 4,5,6の調節におけるそれらの役割に関連して研究されてきた。 ERは、細胞内Ca 2 +の主な店舗となっており、この容量で下流のCa 2の細胞プロセスの無数+シグナル、税込を調節翻訳後のタンパク質の折りたたみ及びタンパク質maturation7をuding。ミトコンドリアは、その一方で、それによって下流のCa 2 +のアンバランス4,8のアポトーシス経路の開始を防止する細胞内Ca 2 +濃度をバッファリングすることにより、Ca 2 +の恒常性を維持する。 MAMSの動的な性質は、それらの理想的なサイトは、Ca 2 +シグナル伝達とミトコンドリアのCa 2 +濃度、脂質生合成と輸送、エネルギー代謝と細胞生存4,9,10,11,12の調節など、基本的な細胞メカニズムを解剖することができます。いくつかのプロトコルが、肝組織および培養細胞13,14からこれらのマイクロドメインの精製の ために記載されている。
アカウントに以前に公開されている方法を取って、我々は、成体マウスの脳からミトコンドリアとMAMSを単離するためのプロトコルを適応している。この手順に、我々はどの電子すなわち余分な精製工程、トリトンX100の抽出を追加しましたnables MAMSのスフィンゴ糖脂質に富んだマイクロドメイン（GEM）の画分の単離。これらのGEMの製剤は、原形質膜または他の細胞内膜に由来し、カベオラや脂質ラフトといくつかのタンパク質成分を共有しており、受容体タンパク質のクラスタリングのために、タンパク質-タンパク質相互作用4,15の集まるポイントとして機能するように提案されている。
Protocol
以下のプロトコールは、マウスの脳からMAMSや宝石の単離および精製のために意図されている
ミトコンドリア、MAMSや宝石の分離に必要なソリューション
原油ミトコンドリアの準備を取得するための分別：
ソリューション：0.32Mスクロース、1mMのNaHCO 3を 、1mMのMgCl 2、0.5 mMのCaCl 2 +プロテアーゼ阻害剤（必要に応じて、新鮮追加）
B液：0.32Mスクロース、1mMのNaHCO 3を +プロテアーゼ阻害剤（必要に応じて、新鮮追加）
MAMSアイソレーション：
分離培地：250mMのマンニトール、5mMのHEPES緩衝液（pH7.4）、0.5mMのEGTA、0.1％のBSA
勾配バッファ：225 mMのマンニトール、25mMのHEPES緩衝液pH7.5、1mMのEGTA、0.1％のBSA（最終濃度）
GEMSの分離：
コンテンツ"> GEMの抽出バッファー：25mMの HEPES、pH7.5の0.15MのNaCl、1％トリトンX-100 +プロテアーゼ阻害剤（必要に応じて、新鮮追加）GEMの可溶化緩衝液：50mMのトリス-HCl、pH 8.8、5mMのEDTA、1％SDS +プロテアーゼ阻害剤（必要に応じて、新鮮追加）。
1。最初のステップ細胞下分画：核の除去、Unlysed細胞および細胞破片
- CO 2のチャンバー内でマウスを安楽死させる。
- すぐに、脳を除去半減、氷の上に2 mlチューブに置き、重量を量る。
注：手順全体を通して脳の半分を分離します。以下は、単一の脳の半分の治療に適用されます。
- 1ミリリットル冷たい溶液Aが大きいクリアランス乳棒の合計15ストロークでホモジナイズ含む予冷2ミリリットルのガラス製ダウンス組織グラインダーで行わハーフ脳。
- 氷の上で、15mlファルコンチューブに移し、希釈10ボリュームw / vの、 例えば 0.225グラム〜2.25 mlまでホモジネート。
- 4℃で10分のために1400 xgで遠心し
- 上清を慎重に除去し、氷の上に、30 mlの丸底ガラス遠心管に移す。ペレットを乱さないように注意してください。
- ソリューションの同じ10巻でペレットを再懸濁します。小さなクリアランス乳棒、一度に1ミリリットルの3から6ストロークで、同じグラインダーでホモジナイズする。
- 4℃で10分間、710×gでフレッシュ15mlファルコンチューブおよび遠心℃に移す核および細胞破片のペレットでこの結果。
- 慎重にステップ1.6で保存した上清を用いて、上清とプールを削除します。
2。第二ステップ：粗ミトコンドリア単離
- 4℃で10分のために13800×gで遠心分離し、上清を
- 氷の上で、超クリアベックマン遠心チューブに上清を移し、
- ペレットを再懸濁し10倍量のソリューションインチ小さなクリアランス乳棒、一度に1ミリリットルの3から6ストロークで、同じグラインダーでホモジナイズする。
- ステップ2.1のように遠心分離します。
- ステップ2.2から2.4を繰り返します。
- 得られたペレットは、濃縮されたミトコンドリア画分である。プールの上清（細胞質ゾルとER）、パラフィルムでカバーし、氷上で保存する。
- 新鮮なホモジナイザーで、B液の4.8ミリリットル/グラム（gは元脳重量と呼ばれます）で、小さな隙間乳棒の6ストロークでペレットを再懸濁します。
- ガラスパスツールピペットを用いて、超クリアベックマン遠心管に不連続ショ糖密度勾配を作成し、次のようにチューブの底に続いて追加して、慎重に、気泡が形成されない確実：
Resupendedペレット（0.32Mスクロース）
3ミリリットル850 mMスクロース（1ミリメートルのNaHCO 3）
3ミリリットル1 Mスクロース（1ミリメートルのNaHCO 3）
3ミリリットル1.2 Mショ糖（1mMの炭酸水素ナトリウムで3） - 4℃で2時間、82500×gで遠心分離し、グラデーションの終わりに得られた分離は、3つのバンドとペレット生成されます： - 、2）小胞体、ゴルジ体、原形質膜（0.85 M - 1 Mインターフェイス）0.85 Mインターフェイス）1）ミエリン及び他の膜汚染物質を（0.32 M; 3）シナプトソーム（1 - M 1.2 Mインターフェイス）、4）ミトコンドリア原油（ペレット）は、その後の精製工程のために使用される
3。ミトコンドリア関連ER膜の分離、MAMS
- 新たに追加されたプロテアーゼ阻害剤を含む2 mlの分離培地では、1つの脳の半分から新たに単離したミトコンドリア原油を再懸濁します。
- 勾配緩衝8半脳mlあたり、および超クリアベックマン遠心チューブ内の場所で30％パーコール勾配を準備します 。
* 注：（1.43倍）勾配バッファはもっと集中してくださいdの 後に適切な最終濃度を達成するために30％パーコールをiluting。
- 準備されたグラデーションの上の層ミトコンドリア懸濁液は徐々に任意の気泡を防ぐことができます。
- 30分、4℃で95000×gで遠心分離し、
- ガラスパスツールピペットを持つ最初の重質留分（下部バンド）を削除し、新鮮な丸底ガラス管に移し、氷の上で。
- 別のガラスパスツールピペットを用いて、第二の光フラクション（上部バンド）を取り外して、氷の上で、別々の新鮮な丸底ガラス管に移す。
- 4℃で10分間6300 xgで℃で10 mlの分離培地と遠心分離機でステップ3.5で回収した画分の両方を薄める
- ステップ3.6で得られた重質留分からの上清を捨て、ステップ3.6のように、再び別の10 mlの分離培地と遠心でペレットを再懸濁します。得られたペレットは、 純粋なミトコンドリア画分となります。
- ライトフラクショナルから上清を移するには、氷の上で、超クリアベックマン遠心チューブにステップ3.6で得られた。ペレットを廃棄します。
- 1時間、4℃、100,000×gでチューブと遠心分離機を埋めるために、ステップ3.8で得られた上清に十分な分離培地を追加得られたペレットは、MAMS分数となります。上清を慎重に除去して廃棄します。
注：このステップで、あなたも1時間、4、100,000 xgで遠心あり℃ステップ2.6で保存した上清。ペレットは、ER分数であるとサイトゾル画分を上澄みます。
4。スフィンゴ糖脂質に富むマイクロドメインの抽出、GEMS
- 氷上で20分間のExtraction Bufferを500μl-1mlに純粋なミトコンドリアおよび/またはMAM分画を溶解します。
- 4℃で2分間15300×gでライセートを遠心℃、
- 上清（トリトンX-100可溶性物質）および再遠心ペレットを集める2分間残っている水溶性物質を除去します。 （トリトンX-100ミトコンドリア抽出および/またはTriton X-100抽出MAMS）。
- バッファーを可溶化にペレットを可溶化する。この可溶化された材料は、GEM分数を表し、さらなる分析のために使用することができます。
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Representative Results
このプロトコルを使用しているとの経験に基づいて、我々は安全MAMS、宝石、マウス脳のミトコンドリア画分の単離および精製のためにそれをお勧めすることができます。概説された手順は、非常に再現性があり、一貫性があります。 図1に我々は、パーコール勾配（ステップ3.4）上の方法で純粋なミトコンドリアとMAMS層の代表的なイメージを示しています。 MAMのフラクションはミトコンドリア上びまん性と広い帯域を占める一方で、超遠心チューブの底にミトコンドリア（水戸-P）の偏析し、精製を含む定義された、乳白色のバンド。個々のグラデーション帯を慎重に回収した後、精製した画分を、溶解緩衝液中に再懸濁させ、SDSポリアクリルアミドゲル上で分離し、PVDF膜にブロットした。ブロットを次に分数とそのタンパク質組成物の純度を確かめよう特定のタンパク質マーカーに対する抗体のバッテリーでプローブされます。 図2Aは、CYTOSの分布を示している孤立MAMSとミトコンドリア画分における、オリッチERおよびミトコンドリアマーカー。純粋なミトコンドリアの製剤は、ERおよび細胞質マーカーの両方を欠いている必要があります。 MAMの接触部位におけるERおよびミトコンドリア膜間の緊密な同格は、これらの精製調製物におけるカルレティキュリン（ERマーカー）とTom-20（ミトコンドリアマーカー）の存在を説明しています。 MAMS特異的マーカーFACL4とPACS2、ならびにIP3R-1、GRP75 4など、これらのドメインの中に濃縮された他のマーカーを使用することも可能です。 MAMSはさらに宝石を取得するためにTriton X-100で抽出することができます。 図2Bに示すように、脂質ラフトおよび/ またはカベオラの成分を含んでいて、これらのマイクロドメインは、カベオリン-1陽性である。
図1は、ミトコンドリア関連ER膜（MAMS）と純粋のレイヤーの画像を表示ミトコンドリア画分（水戸市）。
図2。 、ER、純粋なミトコンドリア画分（水戸市） - ） -ウェスタンブロットは、純度およびサイトゾル、小胞体および細胞質のミトコンドリアマーカー（サイトメガロウイルス）の分布を確認するために実行して表示します。とMAM-フラクションのB）のウェスタンブロットMAMSから分離されたスフィンゴ糖脂質ミクロドメイン富む（GEMS）およびTriton X-100抽出（トリトンEXTR。MAMS）画分を精製した。
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Discussion
細胞内膜間または細胞小器官や細胞の細胞膜との間の接触部位は、基本的な細胞プロセスのためのダイナミックシグナリングプラットフォームを表します。生理学的および病理学の両方の条件下でその機能と組成の正確な特性評価には信頼性と再現性の高い精製プロトコルを必要とします。ここで詳述した方法は、特に成体マウスの脳からMAMSとそれらに対応する宝石の単離および精製のための私達の研究室によって最適化されています。このプロトコルは正常にこれらのマイクロドメインを指定して、Ca 2 +のアポトーシス経路の下流の根底+不均衡は子供4の神経変性代謝性疾患における神経細胞死に至る分子エフェクターの同定のために実装されています。
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Disclosures
執筆者はいずれも宣言する利益相反はありません。
Acknowledgments
我々は最初のプロトコルを妊娠中レナータ佐野の貢献を認める。 Ad'A。遺伝学と遺伝子治療に寄附チルドレン（JFC）のために宝石を保持しています。この作品は、NIHの助成金GM60905、DK52025とCA021764、アメリカレバノンシリア関連慈善団体（ALSAC）によって部分的に資金を供給された。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Fractionation | |||
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S-5761 | |
| Magnesium Chloride, Hexahydrate | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| Calcium Chloride, Dihydrate | Sigma-Aldrich | C-5080 | |
| MAM | |||
| D-Mannitol | Sigma-Aldrich | M9546-250G | |
| Hepes | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378-250G | |
| BSA, Fraction V, Heat Shock, Lyophilizate | Roche | 03-116-964-001 | |
| Percoll | GE | 17-0891-02 | |
| GEM | |||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284-500 ml | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-3 | |
| Tris Base | Roche | 03-118-142-001 | |
| HCl | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120-500 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Fisher Scientific | BP166-500 | |
| Common | |||
| Protease Inhibitors Tablets, Complete EDTA-free | Roche | 11-873-580-001 | |
| EQUIPMENT | |||
| 2 ml Douce All-Glass Tissue Grinders | Kimble Chase | 885300-0002 | |
| 15 ml Polypropylene Conical Centrifuge Tubes, BD Falcon | BD | 352097 | |
| 30 ml Round-Bottom Glass Centrifuge Tubes | Kimble Chase | 45500-30 | |
| 15 ml Round-Bottom Glass Centrifuge Tubes | Kimble Chase | 45500-15 | |
| Ultracentrifuge tubes, Ultra-Clear, Thinwall, 14x89 mm | Beckman-Coulter | 344059 | |
| Parafilm | Cole-Parmer | PM996 | |
| Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets, 9" | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
References
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