Summary
Denne fremgangsmåde viser, hvordan at isolere fra den voksne musehjerne mitokondrierne-associerede ER membraner eller Mams og glycosphingolipid-berigede microdomain fraktioner fra Mams og mitokondriske præparater.
Abstract
Intracellulære organeller er yderst dynamiske strukturer med varierende form og sammensætning, som underkastes cellespecifikke indre og ydre signaler. Deres membraner er ofte sammenstillet med definerede kontakt sites, der bliver knudepunkter for udveksling af signalmolekyler og membran komponenter 1,2,3,4. De indbyrdes organellar membran mikrodomæner, der dannes mellem det endoplasmatiske reticulum (ER) og mitokondrier ved åbningen af IP3-sensitive Ca2 +-kanal er kendt som mitokondrier associeret-ER membraner eller Mams 4,5,6. Protein / lipid-sammensætning og biokemiske egenskaber af disse membranmaterialer kontaktsteder er blevet omfattende undersøgt særligt med hensyn til deres rolle i regulering af intracellulær Ca2 + 4,5,6. ER fungerer som det primære lager af intracellulære Ca2 +, og i denne egenskab regulerer et utal af cellulære processer nedstrøms af Ca2 +-signalering, including posttranslationel proteinfoldning og protein maturation7. Mitokondrier, på den anden side bibeholdes Ca2 +-homeostase ved buffering cytosolisk Ca2 +-koncentration og derved forhindrer iværksættelsen af apoptotiske veje nedstrøms for Ca2 + ubalance 4,8. Den dynamiske karakter af Mams gør dem ideelle steder at dissekere de grundlæggende cellulære mekanismer, herunder Ca 2 + signalering og regulering af mitokondrie Ca 2 + koncentration, lipidbiosyntese og transport, energi metabolisme og celleoverlevelse 4,9,10,11,12. Adskillige protokoller er blevet beskrevet til oprensning af disse mikrodomæner fra levervæv og dyrkede celler 13,14.
Idet tidligere publicerede metoder i betragtning, har vi tilpasset en protokol til isolering af mitokondrier og Mams fra voksen musehjerne. Til denne procedure har vi tilføjet en ekstra oprensningstrin, nemlig en Triton X100 udvinding, som enables isolationen af de glycosphingolipid beriget microdomain (GEM) fraktion af Mams. Disse GEM præparater deler flere proteinkomponenter med caveolae og lipidklumper, afledt fra plasmamembranen eller andre intracellulære membraner, og foreslås til at fungere som samle point for ophobning af receptorproteiner og for protein-protein interaktioner 4,15.
Protocol
Følgende protokol er beregnet til isolering og oprensning af Mams og perler fra musehjerne
Løsninger der kræves for Isolering af mitokondrier, Mams og perler
Fraktionering til opnåelse af rå mitochondrial præparat:
Opløsning A: 0,32 M saccharose, 1 mM NaHCO3, 1 mM MgCl2, 0,5 mM CaCl2 + proteasehæmmere (tilføj ferske efter behov)
Opløsning B: 0,32 M saccharose, 1 mM NaHCO3 + proteasehæmmere (tilføj ferske efter behov)
Mams Isolation:
Isolation Medium: 250 mM mannitol, 5 mM HEPES pH 7,4, 0,5 mM EGTA, 0,1% BSA
Gradient Buffer: 225 mM mannitol, 25 mM HEPES, pH 7,5, 1 mM EGTA, 0,1% BSA (slutkoncentration)
GEM'er Isolation:
indhold "> GEM Extraction Buffer: 25 mM HEPES pH 7,5, 0,15 M NaCl, 1% Triton X-100 + proteasehæmmere (tilføj ferske, efter behov)GEM solubilisering Buffer: 50 mM Tris-HCI, pH 8,8, 5 mM EDTA, 1% SDS + proteasehæmmere (tilføj ferske, som nødvendigt).
1. First Step subcellulær fraktionering: Fjernelse af kerner, lyserede celler og celleaffald
- Aflive mus i CO 2 kammer.
- Fjern straks hjerne, halvere, placere i 2 ml rør på is og vejes.
Bemærk: Hold hjernehalvdele adskilt under hele proceduren. Følgende gælder for behandlingen af et enkelt hjernehalvdel.
- Sted halvdelen hjerne i en forud kølet 2 ml glas Dounce vævsformaler indeholdende 1 ml kold opløsning A. homogeniseres med 15 samlede slag af en stor frigang støder.
- Overfør til et 15 ml Falcon-rør, på is og fortyndesHomogenaterne op til 10 volumener w / v, f.eks 0,225 g til 2,25 ml.
- Centrifuger prøven ved 1400 x g i 10 minutter ved 4 ° C.
- Forsigtigt supernatanten fjernes, og overføres til en 30 ml rundbundet glas centrifugeglas på is. Sørg for ikke at forstyrre pellet.
- Pellet resuspenderes i de samme 10 volumener af opløsning A. Homogeniseres i samme mølle, med 3-6 slag af en lille frigang pistil, 1 ml ad gangen.
- Opløsningen overføres til en frisk 15 ml Falcon-rør og centrifugeres ved 710 x g i 10 minutter ved 4 ° C. Dette resulterer i en pellet af kerner og celledebris.
- Fjern forsigtigt supernatanten og pool med supernatanten gemt i trin 1,6.
2. Andet trin: Rå Mitokondrier Isolation
- Centrifuger supernatanter ved 13.800 x g i 10 minutter ved 4 ° C.
- Overfør supernatanten til en Ultra-Clear Beckman centrifugeglas på is
- Resuspender pellet i 10 volumener Opløsning A. Homogeniseres i samme mølle, med 3-6 slag af en lille frigang pistil, 1 ml ad gangen.
- Der centrifugeres som trin 2.1.
- Gentage trin 2,2-2,4.
- Den resulterende pellet er en beriget mitochondrial fraktion. Supernatanterne (cytosol og ER), dække med parafilm og opbevar på is.
- Pelleten resuspenderes med 6 slag af en lille frigang pistil, i 4,8 ml / g (g henvises til den oprindelige hjerne vægt) af opløsning B, i en ny homogenisator.
- Anvendelse af glas Pasteur-pipetter, en diskontinuerlig saccharosegradient forberede sig på en Ultra-Clear Beckman Centrifuge Tube, efterfølgende at tilsætte til bunden af røret således, omhyggeligt og sikre ingen bobler dannes:
Resupended Pellet (0,32 M saccharose)
3 ml 850 mM saccharose (i 1 mM NaHCO3)
3 ml 1 M Saccharose (i 1 mM NaHCO3)
3 ml 1,2 M saccharose (i 1 mM NaHCO3) - Centrifuger ved 82.500 x g i 2 timer ved 4 ° C. Den resulterende separation ved afslutningen af gradienten vil producere tre bånd og en pellet: 1) myelin og andre membran kontaminanter (0,32 M - 0,85 M grænseflade), 2) ER, Golgi, plasmamembraner (0,85 M - 1 M grænseflade); 3) synaptosomer (1 M - 1,2 M grænseflade), 4) rå mitokondrier (pellet), som anvendes til de efterfølgende rensningstrin
3. Isolering af mitokondrier-associeret ER-membranen, Mams
- Resuspender frisk isolerede rå mitokondrier fra en hjernehalvdel, i 2 ml isoleringsmedium indeholdende frisk tilsatte proteaseinhibitorer.
- Forbered en 30% Percoll gradient med Gradient Buffer 8 ml pr halv hjerne, og placer i en Ultra-Clear Beckman centrifugeglas.
* Bemærk: Sørg gradient buffer mere koncentreret (1,43 gange) for at opnå korrekt slutkoncentration efter diluting Percoll til 30%.
- Lag mitochondrial suspension ovenpå forberedt gradient langsomt for at undgå eventuelle bobler.
- Centrifuger ved 95.000 xg i 30 minutter, 4 ° C.
- Fjern den tunge fraktion (nedre bånd) først med en glas Pasteur-pipette og overføres til en ny rundbundet glasrør på is.
- Fjern den lette fraktion (øvre bånd) ANDET med en anden glas Pasteur pipette og overføres til en særskilt frisk rundbundet glasrør, på is.
- Fortynd begge fraktioner indsamlet i trin 3,5 med 10 ml isoleringsmedium og der centrifugeres ved 6300 x g i 10 minutter ved 4 ° C.
- Supernatanten kasseres, fra den tunge fraktion opnået i trin 3.6, pellet resuspenderes med en anden 10 ml isoleringsmedium og centrifuger igen, som trin 3.6. Den resulterende pellet vil være det rene mitochondrial fraktion.
- Overfør supernatanten fra Light Fraction opnået i trin 3,6 til en Ultra-Clear Beckman centrifugeglas, på is. Kasseres pellet.
- Der tilsættes så Isolation Medium til supernatanten opnået i trin 3.8 til fylde røret og centrifugeres ved 100.000 x g i 1 time, 4 ° C. Den resulterende pellet bliver Mams fraktion. Fjern forsigtigt og kassér supernatanten.
Bemærk: På dette trin, kan du også centrifugeres ved 100.000 xg i 1 time, 4 ° C supernatanten gemte i trin 2.6. Pelleten bliver ER-fraktion og supernatant den cytosoliske fraktion.
4. Udvinding af glycosphingolipid-beriget mikrodomæner, GEM'er
- Lyse rene mitochondrier og / eller MAM fraktioner i 500 pi-1 ml ekstraktionspuffer i 20 minutter på is.
- Centrifuger lysater ved 15.300 x g i 2 minutter ved 4 ° C.
- Opsaml supernatanter (Triton X-100 opløselige materiale) og re-centrifugeres pelletsi 2 minutter til fjernelse af resterende opløseligt materiale. (Triton X-100 ekstraheredes Mitokondrier og / eller Triton X-100 ekstraherede Mams).
- Solubilisere pellets i solubiliserende puffer. Dette opløseliggjorte materiale repræsenterer GEM fraktioner og kan bruges til yderligere analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Baseret på vores erfaringer med at bruge denne protokol vi kan roligt anbefale det til isolering og oprensning af Mams, ædelstene og mitokondrie fraktioner fra musehjerne. Fremgangsmåden beskrevet er særdeles reproducerbar og konsistent. I figur 1 viser vi et repræsentativt billede af den måde rent mitokondrier og Mams lag på en Percoll-gradient (trin 3.4). En defineret, mælkeagtig bånd indeholdende oprenset mitokondrier (Mito-P) segregerer i bunden af ultracentrifugerør, mens MAM fraktion udgør en diffus og bredt bånd over mitokondrier. Efter omhyggelig udvinding af de individuelle gradient bånd, er de oprensede fraktioner resuspenderet i en lysepuffer, separeret på SDS-polyacrylamidgeler og blottet på PVDF-membraner. Blots derefter probet med et batteri af antistoffer for specifikke proteinmarkører som vil forvisse renheden af fraktionerne og deres proteinsammensætning. Figur 2A viser fordelingen af cytosOLIC, ER og mitokondriel markører i de isolerede Mams og mitochondriale fraktioner. Rene mitokondrier præparater bør være blottet for både ER og cytosoliske markører. Den tætte apposition mellem ER og mitochondriemembraner på MAM kontakt sites forklarer tilstedeværelsen af calreticulin (ER markør) og Tom-20 (mitokondrier markør) i disse oprensede præparater. Det er også muligt at anvende Mams specifikke markører FACL4 og PACS2, såvel som andre markører beriget inden for disse områder, såsom IP3R-1 og GRP75 4. De Mams kan yderligere ekstraheret med Triton X-100 til opnåelse af perler. Disse mikrodomæner, der indeholder komponenter af lipidklumper og / eller caveolae er caveolin-1 positive som vist i figur 2B.
Fig. 1. Viser et billede af lagdeling af mitokondrie-associerede ER-membranen (Mams) og det renemitokondriske fraktioner (Mito-p).
Figur 2. A) viser Western blots løber at kontrollere renheden og fordelingen af cytosoliske, ER og mitokondrie markører i cytosolisk (cyto) -, ER-, rene mitokondriske fraktioner (Mito-p) -. Og MAM-fraktioner B) Western blots af oprenset glycosphingolipid berigede mikrodomæner (GEM'er) og Triton X-100 udvundet (Triton Udvinding. Mams) fraktioner isoleret fra Mams.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Stederne for kontakt mellem intracellulære membraner eller mellem organeller og plasmamembran celler repræsenterer dynamiske signalering platforme for grundlæggende cellulære processer. Den nøjagtige karakterisering af deres funktion og sammensætning under både fysiologiske og patologiske tilstande kræver pålidelige og reproducerbare oprensningsprotokoller. Fremgangsmåderne beskrevet her, er blevet specifikt optimeret ved vores laboratorium til isolering og oprensning af Mams og tilsvarende perler fra voksen musehjerne. Denne protokol er blevet gennemført med succes til identifikation af de molekylære effektorer, der angiver disse mikrodomæner, og ligger til grund for apoptosecyklus nedstrøms for Ca 2 + ubalance, der fører til neuronal celledød i en neurodegenerativ metabolisk sygdom hos børn 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen af forfatterne har nogen interessekonflikter at erklære.
Acknowledgments
Vi anerkender det bidrag, Renata Sano i udformningen den oprindelige protokol. Ad'A. holder Jewelers for børn (JFC) Begavet Chair i Genetik og genterapi. Dette arbejde blev finansieret delvist af NIH tilskud GM60905, DK52025 og CA021764, og de amerikanske libanesiske syriske associerede Charities (ALSAC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Fractionation | |||
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S-5761 | |
| Magnesium Chloride, Hexahydrate | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| Calcium Chloride, Dihydrate | Sigma-Aldrich | C-5080 | |
| MAM | |||
| D-Mannitol | Sigma-Aldrich | M9546-250G | |
| Hepes | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378-250G | |
| BSA, Fraction V, Heat Shock, Lyophilizate | Roche | 03-116-964-001 | |
| Percoll | GE | 17-0891-02 | |
| GEM | |||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284-500 ml | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-3 | |
| Tris Base | Roche | 03-118-142-001 | |
| HCl | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120-500 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Fisher Scientific | BP166-500 | |
| Common | |||
| Protease Inhibitors Tablets, Complete EDTA-free | Roche | 11-873-580-001 | |
| EQUIPMENT | |||
| 2 ml Douce All-Glass Tissue Grinders | Kimble Chase | 885300-0002 | |
| 15 ml Polypropylene Conical Centrifuge Tubes, BD Falcon | BD | 352097 | |
| 30 ml Round-Bottom Glass Centrifuge Tubes | Kimble Chase | 45500-30 | |
| 15 ml Round-Bottom Glass Centrifuge Tubes | Kimble Chase | 45500-15 | |
| Ultracentrifuge tubes, Ultra-Clear, Thinwall, 14x89 mm | Beckman-Coulter | 344059 | |
| Parafilm | Cole-Parmer | PM996 | |
| Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets, 9" | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
References
- Poburko, D., Kuo, K. H., Dai, J., Lee, C. H., van Breemen, C. Organellar junctions promote targeted Ca2+ signaling in smooth muscle: why two membranes are better than one. Trends Pharmacol. Sci. 25 (1), 8-15 (2004).
- Pani, B., Ong, H. L., Liu, X., Rauser, K., Ambudkar, I. S., Singh, B. B. Lipid rafts determine clustering of STIM1 in endoplasmic reticulum-plasma membrane junctions and regulation of store-operated Ca2+ entry (SOCE. J. Biol. Chem. 283 (25), 17333-17340 (2008).
- Levine, T., Rabouille, C. Endoplasmic reticulum: one continuous network compartmentalized by extrinsic cues. Curr. Opin. Cell Biol. 17 (4), 362-368 (2005).
- Sano, R., Annunziata, I., Patterson, A., Moshiach, S., Gomero, E., Opferman, J., Forte, M., d'Azzo, A. GM1-ganglioside accumulation at the mitochondria-associated ER membranes links ER stress to Ca(2+)-dependent mitochondrial apoptosis. Mol. Cell. 36 (3), 500-511 (2009).
- Raturi, A., Simmen, T. Where the endoplasmic reticulum and the mitochondrion tie the knot: The mitochondria-associated membrane (MAM). Biochim. Biophys. Acta. , (2012).
- Giorgi, C., De Stefani, D., Bononi, A., Rizzuto, R., Pinton, P. Structural and functional link between the mitochondrial network and the endoplasmic reticulum. Int. J. Biochem. Cell Biol. 41 (10), 1817-1827 (2009).
- d'Azzo, A., Tessitore, R. Sano Gangliosides as apoptotic signals in ER stress response. Cell Death Differ. 13, 404-414 (2006).
- Kroemer, G., Galluzzi, L., Brenner, C. Mitochondrial membrane permeabilization in cell death. Physiol. Rev. 87, 99-163 (2007).
- Rizzuto, R., Brini, M., Murgia, M., Pozzan, T. Microdomains with high Ca2+ close to IP3-sensitive channels that are sensed by neighboring mitochondria. Science. 262, 744-747 (1993).
- Lynes, E. M., Bui, M., Yap, M. C., Benson, M. D., Schneider, B., Ellgaard, L., Berthiaume, L. G., Simmen, T. Palmitoylated TMX and calnexin target to the mitochondria-associated membrane. EMBO J. 31 (2), 457-470 (2011).
- Fujimoto, M., Hayashi, T., Su, T. P. The role of cholesterol in the association of endoplasmic reticulum membranes with mitochondria. Biochem. Biophys. Res. Commun. 417 (1), 635-639 (2012).
- Grimm, S. The ER-mitochondria interface: the social network of cell death. Biochim. Biophys. Acta. 1823 (2), 327-334 (2012).
- Vance, J. E. Phospholipid synthesis in a membrane fraction associated with mitochondria. J. Biol. Chem. 265, 7248-7256 (1990).
- Wieckowski, M. R., Giorgi, C., Lebiedzinska, M., Duszynski, J., Pinton, P. Isolation of mitochondria-associated membranes and mitochondria from animal tissues and cells. Nat. Protoc. 4 (11), 1582-1590 (2009).
- Pizzo, P., Viola, A. Lymphocyte lipid rafts: structure and function. Curr. Opin. Immunol. 15 (3), 255-260 (2003).
