Summary
इस प्रक्रिया दिखाता है कि कैसे वयस्क माउस मस्तिष्क mitochondria से जुड़े ईआर झिल्ली या MAMs और glycosphingolipid समृद्ध MAMs और mitochondrial तैयारी से microdomain fractions से अलग करने के लिए.
Abstract
Intracellular organelles अलग आकार और संरचना है, जो सेल विशिष्ट आंतरिक और बाह्य cues के अधीन हैं के साथ अत्यधिक गतिशील संरचनाओं हैं. उनके झिल्ली अक्सर परिभाषित संपर्क साइटों, जो संकेतन अणुओं और झिल्ली 1,2,3,4 घटकों के आदान - प्रदान के लिए केन्द्र बन juxtaposed. अंतर - organellar झिल्ली microdomains कि endoplasmic जालिका (ईआर) और IP3 संवेदनशील 2 Ca + चैनल mitochondria संबद्ध ईआर झिल्ली या 4,5,6 MAMs के रूप में जाना जाता है के उद्घाटन के अवसर पर mitochondria के बीच का गठन कर रहे हैं. रचना / प्रोटीन लिपिड और इन झिल्ली संपर्क साइटों की जैव रासायनिक गुणों को बड़े पैमाने पर किया गया है intracellular 2 4,5,6 + Ca को विनियमित करने में उनकी भूमिका के संबंध में विशेष रूप से अध्ययन किया. ईआर के intracellular Ca 2 प्राथमिक स्टोर के रूप में कार्य करता है, और इस क्षमता में 2 सीए के एक सेलुलर प्रक्रियाओं के असंख्य अनुप्रवाह को नियंत्रित + संकेतन, भंडारबाद translational प्रोटीन तह और maturation7 प्रोटीन uding. Mitochondria, दूसरे हाथ पर, साइटोसोलिक Ca 2 + एकाग्रता buffering जिससे apoptotic रास्ते की दीक्षा 2 Ca + 4,8 असंतुलित होना के बहाव को रोकने के द्वारा Ca 2 + homeostasis, को बनाए रखने. MAMs की गतिशील प्रकृति उन्हें आदर्श साइटों Ca 2 + संकेतन और mitochondrial Ca 2 + एकाग्रता, लिपिड biosynthesis और परिवहन, ऊर्जा चयापचय और सेल अस्तित्व 4,9,10,11,12 के नियमन सहित बुनियादी सेलुलर तंत्र, टुकड़े करना करने के लिए बनाता है. कई प्रोटोकॉल जिगर ऊतक और संवर्धित कोशिकाओं 13,14 से इन microdomains की शुद्धि के लिए वर्णित किया गया है.
खाते में पहले प्रकाशित तरीकों उठाते हुए, हम mitochondria और वयस्क माउस मस्तिष्क से MAMs के अलगाव के लिए एक प्रोटोकॉल अनुकूल है. इस प्रक्रिया के लिए हम एक अतिरिक्त शोधन कदम है, अर्थात् एक ट्राइटन X100 निष्कर्षण जोड़ लिया है, जो ईअलगाव nables glycosphingolipid MAMs की समृद्ध microdomain अंश (मणि) के. ये मणि तैयारी caveolae और लिपिड rafts, प्लाज्मा झिल्ली या अन्य intracellular झिल्ली से व्युत्पन्न के साथ कई प्रोटीन घटकों का हिस्सा है, और रिसेप्टर प्रोटीन के क्लस्टरिंग के लिए अंक सभा के रूप में है और प्रोटीन प्रोटीन 4,15 बातचीत के लिए कार्य करने का प्रस्ताव कर रहे हैं.
Protocol
निम्नलिखित प्रोटोकॉल और MAMs और जवाहरात के अलगाव के शोधन के लिए माउस मस्तिष्क से करना है
समाधान mitochondria MAMs और जवाहरात के अलगाव के लिए आवश्यक
Fractionation के लिए कच्चे तेल mitochondrial तैयारी प्राप्त:
समाधान एक: 0.32 एम सुक्रोज, 1 मिमी 3 NaHCO, 1 मिमी 2 MgCl, 0.5 मिमी CACL 2 + protease inhibitors (ताजा जोड़ने के लिए, के रूप में की जरूरत है)
समाधान बी .32 एम सुक्रोज, 1 मिमी NaHCO 3 + protease inhibitors (ताजा जोड़ने के लिए, के रूप में की जरूरत है):
MAMs अलगाव:
अलगाव मध्यम: 250 मिमी Mannitol, 5 मिमी HEPES 7.4 पीएच, 0.5 मिमी EGTA, 0.1% BSA
ढाल बफर: 225 मिमी Mannitol, 25 मिमी HEPES 7.5 पीएच, 1 मिमी EGTA, 0.1% BSA (अंतिम एकाग्रता)
रत्न अलगाव:
सामग्री "मणि निष्कर्षण बफर: 25 मिमी HEPES 7.5 पीएच, 0.15 एम NaCl, 1% ट्राइटन X-100 + protease inhibitors (ताजा जोड़ने के लिए, के रूप में की जरूरत है)मणि solubilising बफर: 50 Tris - एचसीएल मिमी, 8.8 पीएच, 5 मिमी EDTA, 1% एसडीएस + protease inhibitors (ताजा जोड़ने के लिए, के रूप में की जरूरत है).
1. पहला कदम Subcellular Fractionation: नाभिक की निकालना, Unlysed कोशिकाओं और सेलुलर मलबे
- सीओ 2 के चैम्बर में माउस euthanize.
- तुरंत मस्तिष्क को निकालने के लिए, आधा बर्फ पर 2 मिलीलीटर ट्यूब में जगह और वजन.
नोट: मस्तिष्क halves पूरी प्रक्रिया के दौरान अलग रखें. निम्नलिखित एक एकल मस्तिष्क 1/2 के इलाज के लिए लागू होता है.
- जगह एक पूर्व ठंडा 2 मिलीलीटर कांच Dounce ऊतक युक्त एक बड़ी निकासी मूसल के कुल 15 स्ट्रोक के साथ 1 मिलीलीटर ठंड समाधान ए homogenize चक्की में आधा दिमाग.
- एक 15 मिलीलीटर बाज़ ट्यूब स्थानांतरण, बर्फ पर, और जलमिश्रित10 संस्करणों के लिए w / v, जैसे 0.225 जी 2.25 मिलीलीटर homogenates.
- 4 पर 10 मिनट के लिए 1400 XG पर नमूना अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस
- ध्यान से बर्फ पर तैरनेवाला और 30 मिलीलीटर दौर नीचे कांच अपकेंद्रित्र ट्यूब को हस्तांतरण, हटा दें. सुनिश्चित करें कि गोली परेशान नहीं.
- समाधान का एक ही 10 खंडों में गोली Resuspend ही बनाने की मशीन में एक छोटे से निकासी मूसल, एक समय में 1 मिलीलीटर के 3-6 स्ट्रोक के साथ, homogenize.
- 710 XG में 10 मिनट 4 डिग्री सेल्सियस के लिए एक ताजा 15 मिलीलीटर बाज़ ट्यूब और अपकेंद्रित्र स्थानांतरण नाभिक और सेल मलबे की एक गोली में यह परिणाम है.
- ध्यान से सतह पर तैरनेवाला और 1.6 चरण में बचाया तैरनेवाला के साथ पूल हटा दें.
2. दूसरा चरण: क्रूड Mitochondria अलगाव
- 4 में 10 मिनट के लिए 13,800 XG supernatants अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस
- एक अल्ट्रा स्पष्ट Beckman अपकेंद्रित्र ट्यूब बर्फ पर तैरनेवाला स्थानांतरण
- Resuspend गोली 10 संस्करणों समाधान में ही बनाने की मशीन में एक छोटे से निकासी मूसल, एक समय में 1 मिलीलीटर के 3-6 स्ट्रोक के साथ, homogenize.
- 2.1 कदम के रूप में अपकेंद्रित्र.
- 2.2-2.4 चरणों को दोहराएँ.
- जिसके परिणामस्वरूप गोली एक समृद्ध mitochondrial अंश है. पूल (cytosol और ईआर) supernatants, parafilm साथ कवर और बर्फ पर रख.
- एक छोटे निकासी मूसल के 6 स्ट्रोक के साथ गोली Resuspend में 4.8 मिलीग्राम / छ (छ मूल मस्तिष्क वजन करने के लिए जाना जाता है) समाधान बी एक ताजा homogeniser में.
- कांच पाश्चर pipettes का उपयोग, एक अल्ट्रा स्पष्ट Beckman अपकेंद्रित्र ट्यूब में एक टूटनेवाला सूकरोज ढाल तैयार है, के रूप में निम्नानुसार ट्यूब के नीचे करने के लिए बाद में जोड़ने, ध्यान से, यह सुनिश्चित करने के कोई बुलबुले का गठन कर रहे हैं:
Resupended गोली (0.32 एम सूकरोज)
एमएल 3 850 मिमी सूकरोज (1 3 मिमी NaHCO में)
3 मिलीग्राम 1 एम सूकरोज (1 3 मिमी NaHCO में)
3 मिलीलीटर 1.2 एम सूकरोज (1 मिमी NaHCO में3) - 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए 82,500 XG पर अपकेंद्रित्र ढाल के अंत में जिसके परिणामस्वरूप और जुदाई तीन बैंड और एक गोली का उत्पादन करेगा: -; 2) ईआर, Golgi, प्लाज्मा झिल्ली (0.85 एम - एम 1 इंटरफ़ेस) 0.85 एम इंटरफ़ेस)) 1 myelin और अन्य झिल्ली contaminants (0.32 एम; 3) (एम 1 synaptosomes 1.2 एम इंटरफ़ेस), 4) mitochondria कच्चे तेल (गोली) है कि बाद शोधन कदम के लिए प्रयोग किया जाता है
3. Mitochondria जुड़े ईआर झिल्ली का अलगाव, MAMs
- एक मस्तिष्क के आधे से 2 मिलीलीटर अलगाव हौसले से जोड़ा protease inhibitors युक्त मध्यम में हौसले से पृथक mitochondria कच्चे तेल, Resuspend.
- एक 30% ढाल आधा दिमाग प्रति बफर 8 मिलीग्राम और एक अल्ट्रा स्पष्ट Beckman अपकेंद्रित्र ट्यूब में जगह के साथ Percoll ढाल तैयार.
* नोट: ढाल बफर अधिक ध्यान केंद्रित (1.43 गुना) घ के बाद सही अंतिम एकाग्रता हासिल30% Percoll iluting.
- धीरे धीरे परत तैयार ढाल के शीर्ष पर mitochondrial निलंबन से बचने के लिए किसी भी बुलबुले.
- 30 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस के लिए 95,000 XG पर अपकेंद्रित्र
- भारी भिन्न (कम बैंड) एक गिलास पाश्चर विंदुक के साथ पहले निकालें और एक ताजा गिलास दौर नीचे ट्यूब स्थानांतरण, बर्फ पर.
- लाइट (ऊपरी बैंड) अंश एक गिलास पाश्चर विंदुक के साथ दूसरा निकालें और एक अलग ताजा गिलास दौर नीचे ट्यूब बर्फ पर हस्तांतरण.
- दोनों 3.5 चरण में 10 मिलीलीटर अलगाव मध्यम और अपकेंद्रित्र के साथ 4 पर 10 मिनट के लिए 6300 XG पर एकत्र भागों डिग्री सेल्सियस पतला
- 3.6 चरण में भारी प्राप्त अंश से सतह पर तैरनेवाला त्यागें, एक और 10 मिलीलीटर अलगाव मध्यम के साथ गोली resuspend और फिर 3.6 कदम के रूप में, अपकेंद्रित्र. जिसके परिणामस्वरूप गोली शुद्ध mitochondrial अंश हो जाएगा.
- लाइट Frac से सतह पर तैरनेवाला स्थानांतरणtion 3.6 चरण में एक अल्ट्रा स्पष्ट Beckman अपकेंद्रित्र ट्यूब बर्फ पर प्राप्त की. गोली त्यागें.
- 1 घंटा, 4 डिग्री सेल्सियस के लिए ट्यूब और 100.000 XG अपकेंद्रित्र को भरने के लिए 3.8 चरण में प्राप्त तैरनेवाला पर्याप्त अलगाव मध्यम जोड़ें जिसके परिणामस्वरूप गोली MAMs अंश हो जाएगा. ध्यान हटाने और सतह पर तैरनेवाला त्यागें.
नोट: इस चरण में, आप भी एक घंटा, 4 के लिए 100,000 XG पर अपकेंद्रित्र हो सकता है ° C तैरनेवाला 2.6 कदम पर बचाया. गोली ईआर अंश हो और के साइटोसोलिक अंश तैरनेवाला होगा.
4. Glycosphingolipid समृद्ध Microdomains जवाहरात, के निष्कर्षण
- निष्कर्षण बफर के 500 μl-1 मिलीलीटर में बर्फ पर 20 मिनट के लिए शुद्ध mitochondria और / या MAM fractions lyse.
- 4 में 2 मिनट के लिए +१५३०० XG lysates अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस
- (Triton एक्स 100 घुलनशील पदार्थ) supernatants और फिर से अपकेंद्रित्र छर्रों ले लीजिए2 मिनट के लिए शेष घुलनशील पदार्थ को हटाने के लिए. (ट्राइटन X-100 Mitochondria निकाले और या ट्राइटन X-100 निकाले MAMs /).
- बफर solubilising में छर्रों solubilize. यह solubilized सामग्री मणि fractions का प्रतिनिधित्व करता है और आगे के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
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Representative Results
इस प्रोटोकॉल का उपयोग हम सुरक्षित रूप से यह अलगाव और MAMs, जवाहरात और माउस मस्तिष्क से mitochondrial भिन्न की शुद्धि के लिए सिफारिश कर सकते हैं के साथ हमारे अनुभव के आधार पर. प्रक्रिया के रूप में उल्लिखित अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है और सुसंगत है. चित्रा 1 में हम एक Percoll ढाल (3.4 कदम) पर जिस तरह से शुद्ध mitochondria और MAMs परत के एक प्रतिनिधि छवि दिखाने के लिए. एक परिभाषित, दूधिया युक्त बैंड ultracentrifuge ट्यूब के नीचे mitochondria segregates (Mito-P) शुद्ध, जबकि MAM अंश mitochondria ऊपर एक फैलाना और ब्रॉड बैंड बनाता है. व्यक्तिगत ढाल बैंड के सावधान वसूली के बाद, शुद्ध fractions lysis बफर में resuspended हैं, एसडीएस polyacrylamide जैल पर अलग और PVDF झिल्ली पर blotted. Blots तो विशिष्ट प्रोटीन मार्कर है कि भिन्न और उनके प्रोटीन संरचना की शुद्धता का पता लगाने के लिए एंटीबॉडी के एक बैटरी के साथ जांच कर रहे हैं. 2A चित्रा cytos के वितरण से पता चलता हैपृथक MAMs और mitochondrial fractions में olic, ईआर और mitochondrial मार्करों. शुद्ध mitochondria तैयारी दोनों ईआर और साइटोसोलिक मार्करों से रहित होना चाहिए. MAM संपर्क साइटों में ईआर और mitochondrial झिल्ली के बीच घनिष्ठ समानाधिकरण इन शुद्ध तैयारी में (ईआर मार्कर) calreticulin और टॉम 20 (mitochondria मार्कर) की उपस्थिति बताते हैं. यह भी संभव है MAMs विशिष्ट FACL4 और PACS2 मार्करों, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अन्य इन डोमेन के भीतर समृद्ध IP3R-1 और 4 GRP75 के रूप में मार्कर, का उपयोग. MAMs आगे ट्राइटन X-100 के साथ निकाला जा सकता है करने के लिए जवाहरात प्राप्त. ये microdomains, जो लिपिड rafts और / या caveolae के घटक होते चित्रा 2B में दिखाया caveolin-1 के रूप में सकारात्मक रहे हैं.
चित्रा 1. Mitochondrial जुड़े ईआर झिल्ली (MAMs) के layering की एक तस्वीर दिखाता है और शुद्धmitochondrial भिन्न (मिटो - पी).
चित्रा 2. ए) से पता चलता है पश्चिमी blots शुद्धता और साइटोसोलिक, ईआर और साइटोसोलिक में mitochondrial मार्कर (cyto) के वितरण की जांच चलाने, ईआर, शुद्ध mitochondrial fractions (मिटो - पी) के और mam fractions बी) पश्चिमी blots शुद्ध glycosphingolipid समृद्ध (रत्न) microdomains और ट्राइटन X-100 निकाले fractions (Triton extr MAMs) MAMs से अलग.
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Discussion
intracellular झिल्ली के बीच या organelles और कोशिकाओं के प्लाज्मा झिल्ली के बीच संपर्क की साइटों बुनियादी सेलुलर प्रक्रियाओं के लिए गतिशील संकेत प्लेटफार्मों का प्रतिनिधित्व करते हैं. उनके और दोनों शारीरिक और रोग की शर्तों के तहत समारोह रचना की सटीक लक्षण वर्णन विश्वसनीय और प्रतिलिपि प्रस्तुत शुद्धीकरण प्रोटोकॉल की आवश्यकता है. यहाँ विस्तृत तरीके से विशेष रूप से किया गया है और वयस्क माउस मस्तिष्क से MAMs उनके इसी रत्न के अलगाव और शुद्धीकरण के लिए हमारी प्रयोगशाला द्वारा अनुकूलित. इस प्रोटोकॉल सफलतापूर्वक आणविक effectors कि इन microdomains निर्दिष्ट करने के लिए, और 2 सीए के apoptotic मार्ग अनुप्रवाह आबाद + 4 बच्चों में एक neurodegenerative चयापचय रोग में neuronal सेल, मृत्यु के लिए अग्रणी असंतुलन की पहचान के लिए लागू किया गया है.
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Disclosures
लेखकों की कोई भी ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा है.
Acknowledgments
हम प्रारंभिक प्रोटोकॉल की अवधारणा में Renata सानो के योगदान को स्वीकार करते हैं. Ad'A. आनुवंशिकी और जीन थेरेपी में संपन्न चेयर (JFC) बच्चों के लिए जौहरी को धारण करता है. इस काम के हिस्से में NIH GM60905 अनुदान, और CA021764 DK52025, और अमेरिकी लेबनान सीरिया एसोसिएटेड दान (ALSAC) द्वारा वित्त पोषित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Fractionation | |||
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S-5761 | |
| Magnesium Chloride, Hexahydrate | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| Calcium Chloride, Dihydrate | Sigma-Aldrich | C-5080 | |
| MAM | |||
| D-Mannitol | Sigma-Aldrich | M9546-250G | |
| Hepes | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378-250G | |
| BSA, Fraction V, Heat Shock, Lyophilizate | Roche | 03-116-964-001 | |
| Percoll | GE | 17-0891-02 | |
| GEM | |||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284-500 ml | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-3 | |
| Tris Base | Roche | 03-118-142-001 | |
| HCl | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120-500 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Fisher Scientific | BP166-500 | |
| Common | |||
| Protease Inhibitors Tablets, Complete EDTA-free | Roche | 11-873-580-001 | |
| EQUIPMENT | |||
| 2 ml Douce All-Glass Tissue Grinders | Kimble Chase | 885300-0002 | |
| 15 ml Polypropylene Conical Centrifuge Tubes, BD Falcon | BD | 352097 | |
| 30 ml Round-Bottom Glass Centrifuge Tubes | Kimble Chase | 45500-30 | |
| 15 ml Round-Bottom Glass Centrifuge Tubes | Kimble Chase | 45500-15 | |
| Ultracentrifuge tubes, Ultra-Clear, Thinwall, 14x89 mm | Beckman-Coulter | 344059 | |
| Parafilm | Cole-Parmer | PM996 | |
| Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets, 9" | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
References
- Poburko, D., Kuo, K. H., Dai, J., Lee, C. H., van Breemen, C. Organellar junctions promote targeted Ca2+ signaling in smooth muscle: why two membranes are better than one. Trends Pharmacol. Sci. 25 (1), 8-15 (2004).
- Pani, B., Ong, H. L., Liu, X., Rauser, K., Ambudkar, I. S., Singh, B. B. Lipid rafts determine clustering of STIM1 in endoplasmic reticulum-plasma membrane junctions and regulation of store-operated Ca2+ entry (SOCE. J. Biol. Chem. 283 (25), 17333-17340 (2008).
- Levine, T., Rabouille, C. Endoplasmic reticulum: one continuous network compartmentalized by extrinsic cues. Curr. Opin. Cell Biol. 17 (4), 362-368 (2005).
- Sano, R., Annunziata, I., Patterson, A., Moshiach, S., Gomero, E., Opferman, J., Forte, M., d'Azzo, A. GM1-ganglioside accumulation at the mitochondria-associated ER membranes links ER stress to Ca(2+)-dependent mitochondrial apoptosis. Mol. Cell. 36 (3), 500-511 (2009).
- Raturi, A., Simmen, T. Where the endoplasmic reticulum and the mitochondrion tie the knot: The mitochondria-associated membrane (MAM). Biochim. Biophys. Acta. , (2012).
- Giorgi, C., De Stefani, D., Bononi, A., Rizzuto, R., Pinton, P. Structural and functional link between the mitochondrial network and the endoplasmic reticulum. Int. J. Biochem. Cell Biol. 41 (10), 1817-1827 (2009).
- d'Azzo, A., Tessitore, R. Sano Gangliosides as apoptotic signals in ER stress response. Cell Death Differ. 13, 404-414 (2006).
- Kroemer, G., Galluzzi, L., Brenner, C. Mitochondrial membrane permeabilization in cell death. Physiol. Rev. 87, 99-163 (2007).
- Rizzuto, R., Brini, M., Murgia, M., Pozzan, T. Microdomains with high Ca2+ close to IP3-sensitive channels that are sensed by neighboring mitochondria. Science. 262, 744-747 (1993).
- Lynes, E. M., Bui, M., Yap, M. C., Benson, M. D., Schneider, B., Ellgaard, L., Berthiaume, L. G., Simmen, T. Palmitoylated TMX and calnexin target to the mitochondria-associated membrane. EMBO J. 31 (2), 457-470 (2011).
- Fujimoto, M., Hayashi, T., Su, T. P. The role of cholesterol in the association of endoplasmic reticulum membranes with mitochondria. Biochem. Biophys. Res. Commun. 417 (1), 635-639 (2012).
- Grimm, S. The ER-mitochondria interface: the social network of cell death. Biochim. Biophys. Acta. 1823 (2), 327-334 (2012).
- Vance, J. E. Phospholipid synthesis in a membrane fraction associated with mitochondria. J. Biol. Chem. 265, 7248-7256 (1990).
- Wieckowski, M. R., Giorgi, C., Lebiedzinska, M., Duszynski, J., Pinton, P. Isolation of mitochondria-associated membranes and mitochondria from animal tissues and cells. Nat. Protoc. 4 (11), 1582-1590 (2009).
- Pizzo, P., Viola, A. Lymphocyte lipid rafts: structure and function. Curr. Opin. Immunol. 15 (3), 255-260 (2003).
