Summary
이 절차는 성인 마우스 뇌 미토콘드리아 - 관련 ER의 멤브레인 또는 MAMs 및 MAMs과 mitochondrial 준비에서 glycosphingolipid 강화 microdomain 분수에서 분리하는 방법을 보여줍니다.
Abstract
세포 세포 소기관은 모양과 셀 별 고유 및 외부 신호를 받게 아르 구성을 변화와 고도의 동적 구조입니다. 그들의 멤브레인은 종종 신호 분자와 막 구성 요소 1,2,3,4의 교환을위한 허브가 정의 연락처 사이트에서 juxtaposed 있습니다. endoplasmic 소포체 (ER)와 + 채널이 미토콘드리아 관련-ER 멤브레인 또는 MAMs 4,5,6로 알려져 있습니다 IP3에 민감한 칼슘 2 개구에서 미토콘드리아 사이에 형성되는 간 organellar 막 microdomains. 단백질 / 지질 조성과 이러한 멤브레인 연락처 사이트의 생화학 특성을 광범위하게 특히 세포 내 칼슘 2 + 4,5,6을 조절에서의 역할과 관련하여 연구되었습니다. ER은 +,이 용량에서 칼슘이 세포의 하류 공정의 무수한을 조절 세포 칼슘 (2)의 기본 저장소 역할을 + 신호, incl포스트 병진 단백질 접힘, 단백질 maturation7을 uding. 미토콘드리아, 다른 한편으로,이를 통해 하류 칼슘 2 + 불균형 4,8의 apoptotic 경로의 개시를 방지 cytosolic 칼슘 2 + 농도를 버퍼링하여 칼슘 2 + 항상성을 유지하고 있습니다. MAMs의 동적 특성은 그들에게 이상적인 사이트는 칼슘 2 + 신호와 mitochondrial 칼슘 2 + 농도, 지질 생합성 및 수송, 에너지 신진 대사와 세포 생존 4,9,10,11,12 규제 등의 기본적인 세포 메커니즘을 해부 할 수 있습니다. 여러 프로토콜은 간 조직 및 배양 세포 13,14에서 이러한 microdomains의 정화에 대한 설명되었습니다.
계정에 이전에 다음 ID로 출판 방법을 복용, 우리는 성인 마우스의 뇌에서 미토콘드리아와 MAMs의 절연을위한 프로토콜을 적응하고 있습니다. 이 절차에 우리는 추가 정화 단계, 즉 트리톤의 X100 추출을 추가하는 전자nables MAMs의 glycosphingolipid 강화 microdomain (GEM) 분수의 고립. 이러한 GEM의 준비가 플라즈마 막 나 다른 세포 세포막에서 유래 caveolae과 지질 보트와 여러 단백질 구성 요소를 공유하고 수용체 단백질의 클러스터링에 대한 포인트를 수집처럼 단백질 단백질 상호 작용 4,15에 대한 작동하도록 제안하고 있습니다.
Protocol
다음 프로토콜은 마우스 뇌에서 MAMs과 보석의 절연 및 정화를위한 것입니다
솔루션은 미토콘드리아, MAMs와 보석의 절연이 필요
분류 원유 mitochondrial 준비를 얻기 위해 :
솔루션 A : 0.32 M의 자당, 1 MM NaHCO 3, 1 MM MgCl 2, 0.5 MM CaCl 2 + 프로테아제 저해제 (필요에 따라, 신선한 추가)
솔루션 B : 0.32 M의 자당, 1 MM NaHCO 3 + 프로테아제 저해제 (필요에 따라, 신선한 추가)
MAMs 절연 :
절연 매체 : 250 MM 마니 톨, 5 밀리미터 HEPES의 산도 7.4, 0.5 MM EGTA, 0.1 % BSA
그라디언트 버퍼 : 225 MM 마니 톨, 25 밀리미터 HEPES의 산도 7.5, 1 ㎜ EGTA, 0.1 % BSA (최종 농도)
보석 절연 :
내용 "> GEM 추출 버퍼 : 25 MM HEPES 산도 7.5, 0.15 M NaCl, 1 % 트리톤 X-100 + 프로테아제 저해제 (필요한 경우, 신선한 추가)GEM Solubilising 버퍼 : 50 MM 트리스 - HCL, pH를 8.8, 5 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 1 % SDS + 프로테아제 저해제 (필요에 따라, 신선한 추가).
1. 첫 번째 단계 Subcellular 분류 : 핵의 제거, Unlysed 세포와 세포 파편
- CO 2 챔버에 마우스를 안락사시켜야.
- 즉시 뇌를 제거 절반, 얼음에서 2 ML 튜브에 넣고 무게.
참고 : 전체 절차를 통해 뇌 절반은 별도의 유지. 다음은 하나의 뇌의 절반의 치료에 적용됩니다.
- 한 ML 차가운 솔루션 A.이 큰 통관 유봉의 15 총 스트로크와 균질화가 포함 된 사전 차가운 두 ML 유리 다운스 호 모지 조직 분쇄기의 장소 반 뇌.
- 얼음에 15 ML 팔콘 튜브에 전송하고 희석10 권 w / V, 예를 들어 0.225 g에 2.25 ML까지 homogenates.
- 4에 10 분에 1,400 XG에서 샘플을 원심 분리기 ° C.
- 조심스럽게 얼음에 표면에 뜨는과 30 ML 둥근 바닥 유리 원심 분리기 튜브로 전송을 제거합니다. 펠렛을 방해하지 않도록하십시오.
- 솔루션 같은 10 권의 펠렛을 Resuspend. 작은 통관 유봉, 한 번에 1 ML의 3-6 뇌졸중과 같은 그라인더에 균질화.
- 4에 10 분 ° C.에 710 XG에 신선한 15 ML 팔콘 튜브와 원심 분리기로 전송 핵 및 세포 파편의 펠렛에있는이 결과.
- 주의 단계 1.6에서 저장 한 표면에 뜨는있는 표면에 뜨는과 수영장을 제거합니다.
2. 두 번째 단계 : 조잡 미토콘드리아 절연
- 4에 10 분에 13,800 XG에서 supernatants을 원심 분리기 ° C.
- 얼음에 울트라 클리어 Beckman의 원심 분리기 튜브를 표면에 뜨는 전송
- Resuspend 펠릿 10 권 솔루션에. 작은 통관 유봉, 한 번에 1 ML의 3-6 뇌졸중과 같은 그라인더에 균질화.
- 단계 2.1로 원심 분리기.
- 단계 2.2-2.4를 반복합니다.
- 그 결과 펠렛은 풍부한 mitochondrial 분수입니다. 풀 supernatants (세포 기질 및 ER), parafilm으로 커버하고 얼음 계속.
- 작은 통관 유봉 6 획으로 펠렛을 Resuspend, 4.8에 ML / g는 신선한 homogeniser에 솔루션 B의 (g는 원래 뇌의 무게라고합니다).
- 유리 파스퇴르 피펫 사용하여, 신중하게 다음과 같이 관의 맨 아래에이어서 추가 더 거품이 형성되지 않습니다 보장 울트라 클리어 Beckman의 원심 분리기 튜브에서 불연속 자당의 그라디언트를 준비 :
Resupended 펠렛 (0.32 M의 자당)
3 ML 850 밀리미터 자당 (1 MM NaHCO 3)
3 ML 1 M의 자당 (1 MM NaHCO 3)
3 ML 1.2 M의 자당 (1 MM NaHCO에서3) - 4 ° C.에서 2 시간에 82,500 XG에 원심 분리기 그라디언트의 끝에서 그 결과 분리는 세 밴드와 펠렛 생산합니다 : - 2) ER, Golgi, 플라즈마 멤브레인 (0.85 M - 1 M 인터페이스) 0.85 M 인터페이스) 1) myelin 및 기타 막 오염 물질을 (0.32 M, 3) synaptosomes (1 M - 1.2 M 인터페이스), 4) 미토콘드리아 원유 (펠렛) 이후 정화 단계에 사용되는
3. 미토콘드리아 - 관련 ER 막의 절연, MAMs
- 갓 추가 단백 분해 효소 억제제를 포함하는 두 ML 절연 매체에 하나의 뇌 절반에서 미토콘드리아 갓 고립 된 원유를 Resuspend.
- 그라데이션 버퍼 8 이분의 일 뇌 당 ML, 그리고 울트라 클리어 Beckman의 원심 분리기 튜브의 장소와 30 % Percoll 기울기를 준비합니다.
* 참고 : D 후 정확한 최종 농도를 달성하기 위해 (1.43 배) 기울기 버퍼가 더 집중하기30 % Percoll을 iluting.
- 준비된 기울기 상단에 레이어 mitochondrial 정지는 천천히 모든 거품을 방지합니다.
- 30 분, 4 ° C.에 95,000 XG에 원심 분리기
- 유리 파스퇴르 피펫으로 FIRST 중공업 비율 (낮은 밴드)를 제거하고 신선한 왕복 아래 유리관에 전송, 얼음.
- 또 다른 유리 파스퇴르 피펫 두 번째는 빛 분수 (위 밴드)를 제거하고 얼음에 별도의 신선한 왕복 아래 유리관에 전송할 수 있습니다.
- 4에 10 분에 6,300 XG에서 10 ML 절연 매체와 원심 분리기와 단계 3.5 수집 된 두 분수 ° C.를 희석
- 단계 3.6에서 얻어진 중공업 비율의 표면에 뜨는 폐기하십시오 다른 10 ML 절연 매체로 펠렛을 resuspend과 단계 3.6로, 다시 원심 분리기. 그 결과 펠렛은 순수 mitochondrial 분율 될 것입니다.
- 빛 Frac에서 표면에 뜨는을 전송기가 얼음에 울트라 클리어 Beckman의 원심 분리기 튜브에 단계 3.6에서 얻은. 펠렛을 폐기하십시오.
- 1 시간, 4 ° C.에 100,000 XG의 튜브와 원심 분리기를 작성 단계 3.8에서 얻어진 표면에 뜨는에 충분한 절연 매체를 추가 그 결과 펠렛은 MAMs 분수됩니다. 조심스럽게 표면에 뜨는을 제거하고 폐기합니다.
참고 :이 단계에서, 여러분은 또한 1 시간, 4 십만 XG에 원심 분리기 수 있습니다 ° C 단계 2.6에서 저장 한 표면에 뜨는. 펠렛은 ER 분수이어야하며 Cytosolic 일부를 표면에 뜨는 것입니다.
4. Glycosphingolipid 강화 Microdomains, 보석 추출
- 얼음에 20 분에 추출 버퍼 500 μl-1 ML에 순수 미토콘드리아 및 / 또는 이맘 분수를 Lyse.
- 4에서 2 분에 15,300 XG에 lysates을 원심 분리기 ° C.
- supernatants (트리톤 X-100 수용성 물질)와 다시 원심 분리기 알약을 수집2 분에 용해 물질을 남아 제거합니다. (트리톤 X-100은 미토콘드리아 추출 및 / 또는 트라이 튼 X-100 추출 MAMs).
- 버퍼 Solubilising에서 알약을 Solubilize. 이 solubilized 자료는 GEM의 분수를 상징하며 추가적인 분석을 위해 사용할 수 있습니다.
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Representative Results
우리가 안전하게 MAMs, 보석 및 마우스의 뇌에서 mitochondrial 분수의 절연 및 정화를 위해 추천 할 수 있습니다이 프로토콜을 사용하여와의 경험을 바탕으로. 명시된 절차는 매우 재현과 일치합니다. 그림 1에서 우리는 Percoll 기울기 (단계 3.4)의 방법으로 순수 미토콘드리아와 MAMs 층의 대표 이미지를 보여줍니다. 이맘 분율은 미토콘드리아 위의 확산과 폭 넓은 대역을 구성하는 동안 포함 된 정의, 우유 밴드, ultracentrifuge 튜브의 하단에있는 미토콘드리아 (미토 P) segregates를 정화. 개별 기울기 밴드의주의 회복 후, 정화 분수는 용해 버퍼에 resuspended 아르 SDS의 polyacrylamide 젤에서 분리 PVDF 막을에 blotted. Blots은 다음 분수와 단백질 성분의 순도를 확인합니다 특정 단백질 마커에 대한 항체의 배터리로 탐색합니다. 그림 2A는 cytos의 분포를 보여줍니다고립 된 MAMs과 mitochondrial 분수에 olic ER과 mitochondrial 표시. 순수 미토콘드리아 준비는 ER과 cytosolic 마커 모두의 결여해야합니다. 이맘 연락처 사이트에서 ER과 mitochondrial 멤브레인 사이의 긴밀한 동격이 정화 준비에 calreticulin (ER 마커)와 탐 - 20 (미토콘드리아 마커)의 존재를 설명합니다. 이 MAMs에게 특정 마커 FACL4와 PACS2,뿐만 아니라 IP3R-1과 GRP75 4와 같은 이러한 도메인 내에서 풍부한 다른 마커를 사용하는 것도 가능합니다. MAMs은 또한 보석을 얻기 위해 트라이 튼 X-100으로 추출 할 수 있습니다. 그림 2B와 같이 지질 보트 및 / 또는 caveolae의 구성 요소가 포함이 microdomains는 caveolin-1 긍정적입니다.
그림 1. mitochondrial - 관련 ER 막 (MAMs)의 레이어링의 사진을 표시하고 순수mitochondrial 분수 (미토-P).
그림 2. A) 서양 blots은 순결과 cytosolic, ER 및 Cytosolic의 mitochondrial 마커 (cyto)의 분포를 확인하는 실행 표시 - ER-, 순수 mitochondrial 분수 (미토-P) -.의 엄만 - 분수 B) 서양 blots MAMs로부터 격리 glycosphingolipid 풍부한 microdomains (보석)와 트리톤 X-100 추출 (트라이 튼 extr. MAMs) 분수를 정화.
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Discussion
세포 멤브레인 간 또는 세포 소기관과 세포의 플라즈마 막 사이의 접촉의 사이트는 기본 세포 프로세스에 동적 신호 플랫폼을 나타냅니다. 생리학 및 병리학 조건 모두에 따라 자신의 기능과 구성의 정확한 특성은 안정적이고 재현 정화 프로토콜이 필요합니다. 여기에 설명 된 방법은 특별히 성인 마우스의 뇌에서 MAMs와 해당 보석의 절연 및 정화를 위해 우리 실험실에서 최적화되었습니다. 이 프로토콜이 성공적으로 어린이 4 neurodegenerative 신진 대사 질환에 neuronal 세포 사망에 이르는 + 불균형을이 microdomains을 지정하고, 칼슘 2의 apoptotic 경로의 하류를 기초 분자 effectors의 식별을 위해 구현되었습니다.
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Disclosures
저자는 모두 신고 할 관심의 충돌이 없습니다.
Acknowledgments
우리는 초기 프로토콜을 속에에 레 사노의 공헌을 인정합니다. Ad'A. 유전 및 유전자 치료에 의자를 부자 어린이 (JFC)의 보석상을 보유하고 있습니다. 이 작품은 NIH 보조금 GM60905, DK52025 및 CA021764, 그리고 미국의 레바논 시리아 관련 자선 단체 (ALSAC)에 의해 부분적으로 재정 지원을했습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Fractionation | |||
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S-5761 | |
| Magnesium Chloride, Hexahydrate | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| Calcium Chloride, Dihydrate | Sigma-Aldrich | C-5080 | |
| MAM | |||
| D-Mannitol | Sigma-Aldrich | M9546-250G | |
| Hepes | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378-250G | |
| BSA, Fraction V, Heat Shock, Lyophilizate | Roche | 03-116-964-001 | |
| Percoll | GE | 17-0891-02 | |
| GEM | |||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284-500 ml | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-3 | |
| Tris Base | Roche | 03-118-142-001 | |
| HCl | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120-500 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Fisher Scientific | BP166-500 | |
| Common | |||
| Protease Inhibitors Tablets, Complete EDTA-free | Roche | 11-873-580-001 | |
| EQUIPMENT | |||
| 2 ml Douce All-Glass Tissue Grinders | Kimble Chase | 885300-0002 | |
| 15 ml Polypropylene Conical Centrifuge Tubes, BD Falcon | BD | 352097 | |
| 30 ml Round-Bottom Glass Centrifuge Tubes | Kimble Chase | 45500-30 | |
| 15 ml Round-Bottom Glass Centrifuge Tubes | Kimble Chase | 45500-15 | |
| Ultracentrifuge tubes, Ultra-Clear, Thinwall, 14x89 mm | Beckman-Coulter | 344059 | |
| Parafilm | Cole-Parmer | PM996 | |
| Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets, 9" | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
References
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