Summary
Este procedimento ilustra como isolar a partir do cérebro do rato adulto membranas mitocôndrias associadas ER ou mams e as fracções enriquecidas glicoesfingolipídeos-microdomínio de MAMs e preparações mitocondriais.
Abstract
Organelas intracelulares são estruturas altamente dinâmicas com diferentes forma e composição, que estão sujeitos a células específicas sinais intrínsecos e extrínsecos. As membranas são freqüentemente justapostas em locais de contato definidas, que se tornam centros de troca de moléculas de sinalização e componentes de membrana 1,2,3,4. As inter-organellar microdomínios de membrana que são formados entre o retículo endoplasmático (ER) e das mitocôndrias durante a abertura do IP3-sensitive Ca 2 + canal são conhecidos como as mitocôndrias associado-ER membranas ou mams 4,5,6. A composição de proteína / lípido e propriedades bioquímicas dos sítios de contacto de membrana têm sido extensivamente estudadas em particular em relação ao seu papel na regulação da Ca 2 + intracelular 4,5,6. O ER serve como o armazenamento primário do Ca 2 + intracelular, e, nessa qualidade regula uma variedade de processos celulares a jusante de sinalização de Ca 2 +, including pós-traducional de dobragem de proteína e proteína maturation7. As mitocôndrias, por outro lado, manter a homeostase de Ca2 +, por tamponação citosólica concentração de Ca2 + que impede a abertura de vias apoptóticas jusante de Ca 2 + 4,8 desequilíbrio. A natureza dinâmica das MAMs torna locais ideais para dissecar mecanismos básicos celulares, incluindo Ca 2 + de sinalização e regulação da mitocondrial Ca 2 + sobrevivência concentração biossíntese de lipídios e transporte, metabolismo energético celular e 4,9,10,11,12. Vários protocolos têm sido descritas para a purificação dessas microdomínios de tecido do fígado e células de cultura 13,14.
Tomando métodos anteriormente publicados em consideração, nós adaptamos um protocolo para o isolamento de mitocôndrias e MAMs a partir do cérebro de rato adulto. Para este procedimento, nós adicionamos uma etapa de purificação extra, ou seja, uma extração de Triton X100, que enables o isolamento da fracção microdomínio enriquecido glicosfingolípidos (GEM) dos MAMs. Estas preparações GEM partes componentes de proteínas com várias cavéolas e lipídico jangadas, derivadas a partir da membrana plasmática ou outras membranas intracelulares, e são propostos para funcionar como pontos de recolha para a agregação de proteínas receptoras e de interacções proteína-proteína 4,15.
Protocol
O protocolo que se segue destina-se ao isolamento e purificação de MAMs e gemas de cérebro de rato
Soluções necessárias para o isolamento de mitocôndrias, MAMs e pedras preciosas
O fracionamento de obter preparação mitocondrial crua:
Solução A: 0,32 M de sacarose, 1 mM de NaHCO 3, 1 mM de MgCl2, 0,5 mM de CaCl 2 + inibidores de protease (adicionar fresco, conforme necessário)
Solução B: 0,32 M de sacarose, 1 mM de NaHCO 3 Inibidores da Protease + (adicionar fresco, conforme necessário)
Isolamento MAMs:
Meio de isolamento: 250 mM de manitol, 5 mM de HEPES pH 7,4, 0,5 mM de EGTA, 0,1% BSA
Gradiente de tampão: 225 mM de manitol, 25 mM HEPES pH 7,5, 1 mM de EGTA, 0,1% BSA (concentração final)
Isolamento GEMs:
conteúdo "> Tampão de Extracção GEM: 25 mM HEPES pH 7,5, 0,15 M NaCl, 1% Triton X-100 Os inibidores de protease + (adicionar fresco, conforme necessário)Tampão GEM solubilizante: 50 mM Tris-HCl, pH 8,8, EDTA 5 mM, SDS a 1% + inibidores da protease (adicionar fresco, conforme necessário).
1. Fracionamento subcelular Primeiro Passo: Remoção de Núcleos, células não lisadas e restos celulares
- Euthanize do mouse em câmara de gás 2.
- Remover imediatamente cérebro, reduzir pela metade, coloque em tubos de 2 ml em gelo e pesar.
Nota: Mantenha as metades do cérebro separado durante todo o procedimento. O seguinte aplica-se ao tratamento de um meio único cérebro.
- Cérebro lugar metade em um 2 ml de pré-refrigerados de vidro moedor de tecido Dounce contendo 1 ml de solução A. frio Misturar com 15 tacadas no total de um pilão grande folga.
- Transferir para um tubo Falcon de 15 ml, em gelo, e diluahomogeneizados até 10 volumes w / v, por exemplo 0,225 g a 2,25 ml.
- Centrifugar a 1.400 xg amostra durante 10 min a 4 ° C.
- Cuidadosamente remover o sobrenadante e transferir para um tubo de centrífuga de 30 ml de fundo redondo de vidro, em gelo. Certifique-se de não perturbar o sedimento.
- Ressuspender o sedimento em 10 volumes dos mesmos de uma solução. Homogeneizar no mesmo moinho, com 3-6 movimentos de um pilão de pequena folga, 1 ml de cada vez.
- Transferir para um tubo de 15 ml fresco falcon e centrifugar a 710 xg durante 10 min a 4 ° C. Isso resulta em um pellet de núcleos e restos celulares.
- Cuidadosamente remover o sobrenadante e piscina com o sobrenadante guardado no passo 1.6.
2. Segunda Etapa: Isolamento mitocôndrias bruto
- Centrifugar os sobrenadantes a 13.800 xg durante 10 min a 4 ° C.
- Transferir o sobrenadante para um tubo de centrífuga Ultra-Clear Beckman, em gelo
- Ressuspender o sedimento em 10 volumes de solução A. Homogeneizar no mesmo moinho, com 3-6 movimentos de um pilão de pequena folga, 1 ml de cada vez.
- Centrifugar o passo 2.1.
- Repita os passos 2,2-2,4.
- O sedimento resultante é uma fracção enriquecida mitocondrial. Piscina os sobrenadantes (citosol e ER), cubra com parafilme e manter em gelo.
- Ressuspender o sedimento com 6 golpes de um pilão de pequena folga, em 4,8 ml / g (g é referida ao peso do cérebro original) de solução B, em um homogeneizador de fresco.
- Utilizando pipetas de Pasteur de vidro, preparar um gradiente de sacarose descontínuo de um tubo de centrífuga Ultra-Clear Beckman, adicionando subsequentemente a parte inferior do tubo, como se segue, com cuidado, assegurando que nenhum bolhas formam-se:
Resupended Pellet (0,32 M de sacarose)
3 ml de sacarose mM 850 (em 1 mM de NaHCO3)
3 ml de sacarose 1 M (em 1 mM de NaHCO3)
3 ml de sacarose 1,2 M (em 1 mM NaHCO3) - Centrifugar a 82.500 xg durante 2 horas a 4 ° C. A separação resultante, no final do gradiente irá produzir três bandas e uma pelota: 1) de mielina e de contaminantes de membrana outros (0,32 M - 0,85 M de interface), 2) ER, Golgi, as membranas plasmáticas (0,85 M - 1 M de interface); 3) sinaptossomas (1 M - 1,2 M de interface), 4) bruto mitocôndrias (pellet), que é utilizada para os passos de purificação subsequentes
3. Isolamento de mitocôndrias associada membrana ER, MAMs
- Ressuspender o bruto fresco mitocôndrias isoladas a partir de uma metade do cérebro, em 2 ml de meio de isolamento contendo inibidores de protease recentemente adicionados.
- Prepare um gradiente de Percoll 30% com Gradiente ml de buffer de 8 por metade do cérebro, e colocar em um tubo de centrífuga Ultra-Clear Beckman.
* Nota: Certifique-tampão gradiente mais concentrado (1,43 vezes) para alcançar a concentração final correta depois diluting Percoll a 30%.
- Suspensão mitocondrial camada em cima do gradiente preparado lentamente para evitar bolhas.
- Centrifugar a 95.000 xg durante 30 min, 4 ° C.
- Remover a fracção pesada (banda inferior) PRIMEIRO com uma pipeta de Pasteur de vidro e transferir para um tubo de vidro de fundo redondo de fresco, em gelo.
- Remova a fracção leve (banda superior) SEGUNDA com outra pipeta de Pasteur de vidro e transferir para um tubo de vidro separado de fundo redondo, fresco, em gelo.
- Diluir ambas as fracções recolhidas no passo 3.5 com 10 ml meio de isolamento e centrifugar a 6300 xg durante 10 min a 4 ° C.
- Descartar o sobrenadante a partir da fracção pesada obtida no passo 3.6, ressuspender o sedimento com um outro meio de isolamento de 10 ml e centrifugar de novo, como no passo 3.6. O sedimento resultante será a fracção pura mitocondrial.
- Transferir o sobrenadante do Frac Luzção obtida no passo 3.6 para um tubo de centrífuga Ultra-Clear Beckman, em gelo. Descartar o sedimento.
- Adicionar meio de isolamento suficientes para o sobrenadante obtido no passo 3.8 para encher o tubo e centrifuga-se a 100.000 xg durante 1 h, 4 ° C. O sedimento resultante será a fracção MAMs. Remova cuidadosamente e elimine o sobrenadante.
Nota: Nesta etapa, você também pode centrifugar a 100.000 xg durante 1 hora, 4 ° C, o sobrenadante salvo no passo 2.6. O sedimento será a fracção sobrenadante ER e a fracção citosólica.
4. Extração de glicoesfingolipídeos enriquecidas microdomínios, Gemas
- Lisar as fracções puras mitocôndrias e / ou MAM em 500 ml-1 ul de tampão de extracção durante 20 minutos em gelo.
- Centrifugar os lisados a 15300 xg durante 2 min a 4 ° C.
- Recolher os sobrenadantes (Triton X-100 o material solúvel) e re-centrifugação de pelotasdurante 2 minutos para remover o restante material solúvel. (Triton X-100 As mitocôndrias extraído e / ou Triton X-100 MAMs extraídos).
- Solubilizar pelotas em solubilizantes Buffer. Este material solubilizado representa as fracções de gema e pode ser usado para análise posterior.
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Representative Results
Com base em nossa experiência com o uso deste protocolo podemos seguramente recomendar para o isolamento e purificação de MAMs, Gemas e frações mitocondriais de cérebro de rato. O processo como descrito é altamente reprodutível e consistente. Na Figura 1 mostra uma imagem representativa da camada de forma pura e mitocôndrias MAMs em um gradiente de Percoll (passo 3.4). Uma banda, definida leitoso contendo purificado mitocôndrias (Mito-P) segrega na parte inferior do tubo de ultracentrífuga, enquanto que a fracção de MAM torna-se uma banda larga difusa, e acima da mitocôndria. Após a recuperação cuidadosa das bandas individuais de gradiente, as fracções purificadas são novamente suspensas num tampão de lise, separadas em géis de SDS-poliacrilamida e transferidas para membranas de PVDF. Blots são então sondadas com uma bateria de anticorpos para marcadores de proteínas específicas que irão averiguar a pureza das fracções de proteína e da sua composição. Figura 2A apresenta a distribuição dos Cytosmarcadores de Olic, ER e mitocondrial nos MAMs isoladas e frações mitocondriais. Preparações puras mitocôndrias deve ser desprovido de ambos os marcadores de ER e citosólica. A justaposição estreita entre ER e membranas mitocondriais nos locais de contacto MAM explica a presença de calreticulina (ER marcador) e Tom-20 (marcador mitocondrial) nessas preparações purificadas. Também é possível a utilização de marcadores específicos MAMs FACL4 e PACS2, assim como outros marcadores enriquecidas nestes domínios, tais como IP3R-1 e GRP75 4. Os MAMs pode ser adicionalmente extraída com Triton X-100 para se obter as gemas. Esses microdomínios, que contêm componentes de jangadas lipídicas e / ou cavéolas são caveolina-1 positivo, como mostrado na Figura 2B.
Figura 1. Mostra uma imagem da estratificação do mitocondrial associada ER membrana (MAMs) eo purofrações mitocondriais (Mito-p).
Figura 2. A) mostra manchas ocidentais correr para verificar a pureza ea distribuição de citosólica, ER e marcadores mitocondriais em citosólico (cito) -, ER, puros frações mitocondriais (Mito-p) -. E MAM-frações B) Western blot da purificado glicoesfingolipídeos microdomínios enriquecidos (Gems) e Triton X-100 (Triton extraídos Extr. MAMs) fracções isoladas de MAMs.
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Discussion
Os locais de contacto entre as membranas intracelulares ou entre organelas e da membrana plasmática de células representam dinâmicas plataformas de sinalização para os processos celulares básicos. A caracterização exata de sua função e composição em ambas as condições fisiológicas e patológicas requer protocolos de purificação confiáveis e reprodutíveis. Os métodos descritos aqui foram especificamente optimizados pelo nosso laboratório para o isolamento e purificação dos MAMs e as suas gemas correspondentes a partir do cérebro do rato adulto. Este protocolo foi aplicado com êxito para a identificação dos efectores moleculares que especificam essas microdomínios, e estão subjacentes a jusante da via de apoptose de Ca 2 + desequilíbrio que leva à morte da célula neuronal na doença neurodegenerativa metabólica em crianças de 4.
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Disclosures
Nenhum dos autores tem quaisquer conflitos de interesse a declarar.
Acknowledgments
Reconhecemos a contribuição de Renata Sano na concepção do protocolo inicial. Ad'A. detém os joalheiros para Crianças (JFC) cadeira dotada de Genética e Terapia Gênica. Este trabalho foi financiado em parte pelo NIH GM60905, DK52025 e CA021764, e os americanos libaneses sírios Charities Associados (ALSAC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Fractionation | |||
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S-5761 | |
| Magnesium Chloride, Hexahydrate | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| Calcium Chloride, Dihydrate | Sigma-Aldrich | C-5080 | |
| MAM | |||
| D-Mannitol | Sigma-Aldrich | M9546-250G | |
| Hepes | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378-250G | |
| BSA, Fraction V, Heat Shock, Lyophilizate | Roche | 03-116-964-001 | |
| Percoll | GE | 17-0891-02 | |
| GEM | |||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284-500 ml | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-3 | |
| Tris Base | Roche | 03-118-142-001 | |
| HCl | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120-500 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Fisher Scientific | BP166-500 | |
| Common | |||
| Protease Inhibitors Tablets, Complete EDTA-free | Roche | 11-873-580-001 | |
| EQUIPMENT | |||
| 2 ml Douce All-Glass Tissue Grinders | Kimble Chase | 885300-0002 | |
| 15 ml Polypropylene Conical Centrifuge Tubes, BD Falcon | BD | 352097 | |
| 30 ml Round-Bottom Glass Centrifuge Tubes | Kimble Chase | 45500-30 | |
| 15 ml Round-Bottom Glass Centrifuge Tubes | Kimble Chase | 45500-15 | |
| Ultracentrifuge tubes, Ultra-Clear, Thinwall, 14x89 mm | Beckman-Coulter | 344059 | |
| Parafilm | Cole-Parmer | PM996 | |
| Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets, 9" | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
References
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