Summary
Эта процедура показывает, как можно изолировать от мозга взрослого человека мышью митохондрий связанных ER мембран или MAMS и гликосфинголипид обогащенного микродоменной фракций из MAMS и митохондриальных препаратов.
Abstract
Внутриклеточных органелл очень динамических структур с различной формой и составом, которые подвергаются клетки конкретных внутренних и внешних сигналов. Их мембраны часто сопоставляется в определенные контакты сайтов, которые становятся центрами для обмена сигнальными молекулами и мембранных компонентов 1,2,3,4. Между органелл мембраны микродоменов, которые образуются между эндоплазматической сети (ER) и митохондрий на открытии IP3 чувствительные Са 2 + каналов известны как митохондрии, связанный-ER мембран или MAMS 4,5,6. Белка / липидного состава и биохимических свойств этих сайтов мембранных контактов были тщательно изучены особенности в отношении их роль в регуляции внутриклеточного Ca 2 + 4,5,6. ER служит в качестве основного магазина внутриклеточного Ca 2 +, и в этом качестве регулирует множество клеточных процессов вниз по течению от Ca 2 + сигнализации, в т.ч.uding посттрансляционных складывающиеся белка и maturation7. Митохондрии, с другой стороны, поддерживать Ca 2 + гомеостаз, путем буферизации цитозольной концентрации Са 2 + предотвращая тем самым начало апоптоза вниз по течению от Ca 2 + 4,8 дисбаланса. Динамичный характер MAMS делает их идеальными сайтов препарировать основных клеточных механизмов, в том числе Ca 2 + сигнализация и регулирование митохондриальных концентрации Са 2 +, биосинтез липидов и транспорта, энергетического метаболизма и выживания клеток 4,9,10,11,12. Несколько протоколов были описаны для очистки этих микродоменов из ткани печени и культивируемых клеток 13,14.
Принимая ранее опубликованных методов во внимание, мы адаптировали протокол для выделения митохондрий и MAMS от взрослого мозга мыши. Для этой процедуры мы добавили дополнительный этап очистки, а именно добыча Triton X100, который электроннойnables изоляции гликосфинголипид обогащенного микродоменной (GEM) доля MAMS. Эти GEM препараты имеют ряд белковых компонентов с кавеол и липидного плоты, полученных от плазматической мембраны или других внутриклеточных мембран, и предложил работать как сборные пункты для кластеризации рецепторных белков и белок-белковых взаимодействий 4,15.
Protocol
Следующий протокол предназначен для выделения и очистки MAMS и драгоценных камней из мозга мыши
Решения необходимы для изоляции митохондрий, MAMS и драгоценных камней
Фракционирования для получения сырого митохондриальной подготовки:
Решение: 0,32 М сахарозы, 1 мМ NaHCO 3, 1 мМ MgCl 2, 0,5 мМ CaCl 2 + Ингибиторы протеазы (добавить свежие, по мере необходимости)
Раствор Б: 0,32 М сахарозы, 1 мМ NaHCO 3 + Ингибиторы протеазы (добавить свежие, по мере необходимости)
MAMS изоляции:
Изоляция среднего: 250 мм маннитол, 5 мМ HEPES рН 7,4, 0,5 мМ EGTA, 0,1% BSA
Градиент буфер: 225 мМ маннит, 25 мМ HEPES рН 7,5, 1 мМ EGTA, 0,1% BSA (конечная концентрация)
ГЭУ изоляции:
Содержание "> GEM буфере для экстракции: 25 мм HEPES рН 7,5, 0,15 М NaCl, 1% Triton X-100 + Ингибиторы протеазы (добавить свежие, по мере необходимости)GEM солюбилизирующий буфер: 50 мМ Трис-HCl, рН 8,8, 5 мМ ЭДТА, 1% SDS + Ингибиторы протеазы (добавить свежий, по мере необходимости).
1. Первый шаг субклеточных Фракционирование: удаление ядра, Unlysed клеток и клеточных мусора
- Усыпить мыши в CO 2 камеры.
- Немедленно снять головной мозг, вдвое, поместить в 2 мл пробирок на льду и взвесить.
Примечание: Следует мозга половины отдельной течение всей процедуры. Следующая информация относится к лечению одного 1/2 мозга.
- Место 1/2 мозга в предварительно охлажденный 2 мл стекло Dounce ткани мясорубку, содержащий 1 мл холодной A. Решение однородный с 15 всего ударов большой пестик оформления.
- Трансфер в 15 мл трубки сокола, на льду, и разбавитьгомогенатах до 10 объемов в / о, например, 0,225 г до 2,25 мл.
- Центрифуга образца при 1400 х г в течение 10 мин при 4 ° C.
- Осторожно удалите супернатант и трансфер в 30 мл с круглым дном трубки центрифуги стекла, на льду. Убедитесь в том, чтобы не потревожить осадок.
- Ресуспендируют осадок в том же 10 томов решений. Однородный в той же мясорубке, с 3-6 ударов небольшой зазор пестиком, 1 мл за один раз.
- Переезд в новый 15 мл Сокол трубки и центрифуги при 710 х г в течение 10 мин при 4 ° C. Это приводит к гранулы ядер и клеточного мусора.
- Осторожно удалите супернатант и бассейн с супернатант сохраненный на шаге 1.6.
2. Шаг второй: Сырая Митохондрии изоляции
- Центрифуга супернатантов на 13800 х г в течение 10 мин при 4 ° C.
- Передача супернатант в Ultra-Clear трубы центрифуги Beckman, на льду
- Ресуспендируют гранул в 10 Решение объемах. Однородный в той же мясорубке, с 3-6 ударов небольшой зазор пестиком, 1 мл за один раз.
- Центрифуга, как шаг 2.1.
- Повторите шаги 2.2-2.4.
- Полученные гранулы является обогащенной фракции митохондрий. Бассейн супернатантов (цитозоль и ER), залить парафином и держать на льду.
- Ресуспендируют гранул с 6 ударов небольшим пестиком оформления, в 4,8 мл / г (г относится к первоначальному весу мозга) раствора В, в свежих гомогенизатора.
- Использование стеклянной пипетки Пастера, подготовить Разрывные градиентные сахарозы в Ultra-Clear трубы центрифуги Beckman, добавив, затем в нижней части трубки, как следует, тщательно, обеспечивая не образуются пузырьки:
Resupended пеллетах (0,32 М сахарозы)
3 мл 850 мм сахарозы (в 1 мМ NaHCO 3)
3 мл 1 М сахарозы (в 1 мМ NaHCO 3)
3 мл 1,2 М сахарозы (в 1 мМ NaHCO3) - Центрифуга на 82500 х г в течение 2 ч при 4 ° C. В результате разделения в конце градиента будет производить три полосы и гранул: 1) миелина и других загрязнений мембран (0,32 М - 0,85 м интерфейсом), 2) ER, Гольджи, плазматических мембран (0,85 M - 1 M-интерфейс); 3) синаптосомах (1 м - 1,2 м интерфейсом), 4) сырой митохондрий (гранулы), который используется для последующих стадий очистки
3. Выделение митохондрий связанных Мембрана ER, MAMS
- Ресуспендируют свежевыделенных сырой митохондрии от одного мозга половины, в 2 мл изолированная среда, содержащая только что добавили ингибиторов протеазы.
- Подготовить 30% Percoll градиент градиент буфера 8 мл на половину мозга, и место в Ultra-Clear трубы центрифуги Beckman.
* Примечание: Сделайте градиент буфера более концентрированные (1,43 раза), чтобы достичь правильной конечной концентрации после того, как гiluting Percoll до 30%.
- Слой митохондриальной подвески на вершине подготовленных градиентов медленно, чтобы избежать пузырей.
- Центрифуга на 95000 х г в течение 30 мин, 4 ° C.
- Снимите тяжелой фракции (нижняя полоса) ПЕРВЫЙ со стеклянной пипетки Пастера и перенести в свежую круглым дном стеклянной трубки, на льду.
- Снимите легкие фракции (верхняя полоса) ВТОРОЙ с другой стекло пипетки Пастера и перенести в отдельную свежие круглым дном стеклянной трубки, на льду.
- Развести обеих фракций, собранных в шаге 3,5 с 10 мл Средний изоляции и центрифуге при 6300 мкг в течение 10 мин при 4 ° C.
- Удалите супернатант из тяжелой фракции, полученной на стадии 3.6, ресуспендируют осадок с еще 10 средних изоляции мл и центрифугируют снова, как шаг 3,6. Полученный осадок будет чистой фракции митохондрий.
- Передача супернатант от света Fracния, полученные в шаге от 3,6 до Ultra-Clear трубы центрифуги Beckman, на льду. Откажитесь от гранул.
- Добавьте достаточное количество средних Изоляция супернатанта, полученного на стадии 3,8 до заполнения трубы и центрифуги при 100000 х г в течение 1 часа, 4 ° C. Полученный осадок будет MAMS фракции. Осторожно снимите и выбросьте супернатант.
Примечание: На данном этапе, вы также можете центрифуге при 100000 х г в течение 1 часа, 4 ° C супернатант сохранен на шаге 2.6. Осадок будет ER фракции супернатанта и цитозольной фракции.
4. Добыча гликосфинголипид обогащенного микродоменов, драгоценных камней
- Lyse чистой митохондрий и / или MAM фракции в 500 мкл-1 мл экстракционного буфера в течение 20 минут на льду.
- Центрифуга лизатов при 15300 х г в течение 2 мин при 4 ° C.
- Сбор супернатантов (Triton X-100 растворимого материала) и вновь центрифуги гранулв течение 2 минут, чтобы удалить остатки растворимого материала. (Triton X-100 извлечены митохондрий и / или Тритон Х-100 извлечены MAMS).
- Растворения гранул в солюбилизирующего буфера. Этот материал представляет собой растворяются GEM фракции и может быть использована для дальнейшего анализа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Основываясь на нашем опыте с использованием этого протокола мы можем смело рекомендовать его для выделения и очистки MAMS, драгоценных камней и митохондриальной фракции мозга мыши. Процедура, как описано очень воспроизводимые и последовательным. На рисунке 1 мы показываем представитель образа путь чистого митохондрий и MAMS слой градиентом Percoll (шаг 3,4). Определенные, молочно полоса, содержащая очищенные митохондрии (Mito-P) выделяет в нижней части ультрацентрифуге труб, в то время как доля MAM составляют диффузный и широкой полосой над митохондрий. После тщательного восстановления отдельных полос градиента, очищенные фракции суспендируют в буфере для лизиса, разделенных на гелях SDS полиакриламидном и наносят на мембраны PVDF. Кляксы затем исследовали с батареей антител для специфических маркеров белка, который будет выяснить чистоты фракций и их состав белков. Рисунок 2А показывает распределение CytosОлич, ER и митохондриальных маркеров в изолированном MAMS и митохондриальной фракциях. Чистая митохондрий препараты должны быть лишены как ER и цитозольных маркеров. Закрыть приложение между ER и митохондриальных мембран в местах контакта MAM объясняет наличие calreticulin (ER маркер) и Том-20 (митохондрии маркера) в этих очищенных препаратов. Кроме того, можно использовать MAMS специфических маркеров FACL4 и PACS2, а также другие маркеры обогащенный в этих областях, таких как IP3R-1 и GRP75 4. MAMS может быть дополнительно экстрагируют Triton X-100, чтобы получить драгоценные камни. Эти микродоменов, которые содержат компоненты липидного плоты и / или кавеол являются кавеолином-1-инфицированных, как показано на рисунке 2B.
Рисунок 1. Показывает картину наслоения митохондриальной связанных ER мембраны (MAMS) и чистоймитохондриальных фракций (мито-р).
Рисунок 2. А) показывает вестерн-блоттинга запустить для проверки чистоты и распределение цитозольных, ER и митохондриальных маркеров в цитозольного (цито) - ER-, чистая митохондриальной фракции (мито-р) -., И MAM-фракции B) Western блоттинга очищенная гликосфинголипид обогащенный микродоменов (ГЭУ) и Тритон Х-100 извлечены (Triton ех. MAMS) фракций, выделенных из MAMS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Места контакта между внутриклеточных мембран или между органелл и плазматической мембраны клетки представляют динамические сигнализации платформы для основных клеточных процессах. Точную характеристику их функции и состав под обоими физиологических и патологических условиях требует надежных и воспроизводимых протоколы очистки. Методы, описанные здесь были специально оптимизированы нашу лабораторию для выделения и очистки MAMS и соответствующих им драгоценных камней от взрослого мозга мыши. Этот протокол был успешно реализован для идентификации молекулярных эффекторов, которые определяют эти микродоменов, и лежат в основе апоптоза вниз по течению путь Ca 2 + дисбаланс приводит к гибели нейронов клетки в нейродегенеративных метаболических заболеваний у детей 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ни один из авторов есть какие-то конфликты интересов, чтобы объявить.
Acknowledgments
Мы признаем вклад Рената Сано с зачатием начального протокола. Ad'A. держит Ювелиры для детей (JFC) Наделенный кафедры генетики и генной терапии. Эта работа была частично финансируется за счет грантов NIH GM60905, DK52025 и CA021764, и американский ливанских сирийских Associated благотворительности (ALSAC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Fractionation | |||
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S-5761 | |
| Magnesium Chloride, Hexahydrate | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| Calcium Chloride, Dihydrate | Sigma-Aldrich | C-5080 | |
| MAM | |||
| D-Mannitol | Sigma-Aldrich | M9546-250G | |
| Hepes | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378-250G | |
| BSA, Fraction V, Heat Shock, Lyophilizate | Roche | 03-116-964-001 | |
| Percoll | GE | 17-0891-02 | |
| GEM | |||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284-500 ml | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-3 | |
| Tris Base | Roche | 03-118-142-001 | |
| HCl | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120-500 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Fisher Scientific | BP166-500 | |
| Common | |||
| Protease Inhibitors Tablets, Complete EDTA-free | Roche | 11-873-580-001 | |
| EQUIPMENT | |||
| 2 ml Douce All-Glass Tissue Grinders | Kimble Chase | 885300-0002 | |
| 15 ml Polypropylene Conical Centrifuge Tubes, BD Falcon | BD | 352097 | |
| 30 ml Round-Bottom Glass Centrifuge Tubes | Kimble Chase | 45500-30 | |
| 15 ml Round-Bottom Glass Centrifuge Tubes | Kimble Chase | 45500-15 | |
| Ultracentrifuge tubes, Ultra-Clear, Thinwall, 14x89 mm | Beckman-Coulter | 344059 | |
| Parafilm | Cole-Parmer | PM996 | |
| Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets, 9" | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
References
- Poburko, D., Kuo, K. H., Dai, J., Lee, C. H., van Breemen, C. Organellar junctions promote targeted Ca2+ signaling in smooth muscle: why two membranes are better than one. Trends Pharmacol. Sci. 25 (1), 8-15 (2004).
- Pani, B., Ong, H. L., Liu, X., Rauser, K., Ambudkar, I. S., Singh, B. B. Lipid rafts determine clustering of STIM1 in endoplasmic reticulum-plasma membrane junctions and regulation of store-operated Ca2+ entry (SOCE. J. Biol. Chem. 283 (25), 17333-17340 (2008).
- Levine, T., Rabouille, C. Endoplasmic reticulum: one continuous network compartmentalized by extrinsic cues. Curr. Opin. Cell Biol. 17 (4), 362-368 (2005).
- Sano, R., Annunziata, I., Patterson, A., Moshiach, S., Gomero, E., Opferman, J., Forte, M., d'Azzo, A. GM1-ganglioside accumulation at the mitochondria-associated ER membranes links ER stress to Ca(2+)-dependent mitochondrial apoptosis. Mol. Cell. 36 (3), 500-511 (2009).
- Raturi, A., Simmen, T. Where the endoplasmic reticulum and the mitochondrion tie the knot: The mitochondria-associated membrane (MAM). Biochim. Biophys. Acta. , (2012).
- Giorgi, C., De Stefani, D., Bononi, A., Rizzuto, R., Pinton, P. Structural and functional link between the mitochondrial network and the endoplasmic reticulum. Int. J. Biochem. Cell Biol. 41 (10), 1817-1827 (2009).
- d'Azzo, A., Tessitore, R. Sano Gangliosides as apoptotic signals in ER stress response. Cell Death Differ. 13, 404-414 (2006).
- Kroemer, G., Galluzzi, L., Brenner, C. Mitochondrial membrane permeabilization in cell death. Physiol. Rev. 87, 99-163 (2007).
- Rizzuto, R., Brini, M., Murgia, M., Pozzan, T. Microdomains with high Ca2+ close to IP3-sensitive channels that are sensed by neighboring mitochondria. Science. 262, 744-747 (1993).
- Lynes, E. M., Bui, M., Yap, M. C., Benson, M. D., Schneider, B., Ellgaard, L., Berthiaume, L. G., Simmen, T. Palmitoylated TMX and calnexin target to the mitochondria-associated membrane. EMBO J. 31 (2), 457-470 (2011).
- Fujimoto, M., Hayashi, T., Su, T. P. The role of cholesterol in the association of endoplasmic reticulum membranes with mitochondria. Biochem. Biophys. Res. Commun. 417 (1), 635-639 (2012).
- Grimm, S. The ER-mitochondria interface: the social network of cell death. Biochim. Biophys. Acta. 1823 (2), 327-334 (2012).
- Vance, J. E. Phospholipid synthesis in a membrane fraction associated with mitochondria. J. Biol. Chem. 265, 7248-7256 (1990).
- Wieckowski, M. R., Giorgi, C., Lebiedzinska, M., Duszynski, J., Pinton, P. Isolation of mitochondria-associated membranes and mitochondria from animal tissues and cells. Nat. Protoc. 4 (11), 1582-1590 (2009).
- Pizzo, P., Viola, A. Lymphocyte lipid rafts: structure and function. Curr. Opin. Immunol. 15 (3), 255-260 (2003).
