Summary
Ağrılı nöropatiler (PN) olarak nosiseptif intraepidermal sinir lifleri (IENFs) değişiklikleri incelemek için, doğrudan nosiseptif IENFs gözlenen üç boyutlu morfolojik değişiklikleri incelemek olabilir protokolleri geliştirmiştir. IENFs üç boyutlu analiz PN İESL morfolojik değişiklikleri değerlendirmek için bir potansiyele sahiptir.
Abstract
Bir deri punch biyopsi sık periferik polinöropati 1,2 tanısında intraepidermal sinir lifi yoğunluğu (IENFD) ölçmek için kullanılır. Şu anda, distal bacak (DL) ve uzunluk bağımlı polinöropatiler 3 değerlendirilmesi için proksimal uyluk (PT) 3 mm biyopsi toplamak için yaygın bir uygulamadır. Ancak, IENFs ve çok yönlü olması nedeniyle, iki boyutlu (2B) görüntüleme analizi yoluyla sinir yapıları üst üste incelemek zordur. Alternatif olarak, üç boyutlu (3D) görüntüleme Bu ikilem için daha iyi bir çözüm sağlayabilir.
Mevcut raporda, ağrılı nöropati (PN) incelemek için 3D görüntüleme uygulamak için yöntemler mevcut. IENFs tespit etmek amacıyla, deri örneklerinde protein gen ürünü, 9.5 (PGP), bir pan nöronal belirteç immunofloresans analizi için işlenir. Şu anda, IENFD caydırmak kullanarak küçük lif nöropati teşhis etmek için standart bir uygulamadıraydınlık mikroskobu 4 kullanarak PGP immünohistokimyasal tarafından mayınlı. Mevcut çalışmada, PGP kullanılarak, toplam IENFD belirlemek için çift immunofloresans analizi uygulandı ve nosiseptif İESL, sinir büyüme faktörü 5 A (Trk A), yüksek afiniteli reseptör tropomiyozin-reseptör kinaz tanıyan antikorların kullanımı yoluyla. PGP ve Trk A antikorları ile birlikte boyama İESL avantajları açıkça PGP pozitif, nosiseptif lifler boyanarak PN çalışma yararlanır. Bu floresan sinyalleri PN ile ilişkili İESL nosiseptif IENFD ve morfolojik değişiklikleri belirlemek için ölçülebilir. Floresan görüntüler konfokal mikroskobu ile elde edilen ve 3D analiz için işlenir. 3D görüntüleme daha PN ile ilişkili morfolojik analiz dönme yetenekleri sağlar. Birlikte ele alındığında, floresan ortak boyama, konfokal görüntüleme ve 3D analiz açıkça PN çalışma yarar.
Introduction
Şu anda, küçük lif nöropatiler 3, 6-8 teşhis etmek için kullanılabilir deri punch biyopsi, gelen intraepidermal sinir lifi yoğunluğu, (IENFD) ölçmek için hekimler için yaygın bir uygulamadır. Biyopsiler distal bacak (DL), lateral malleol üzerinde 10 cm, ve proksimal uyluk (PT), anterior iliyak 9 aşağıda 20 cm alınır. Tüm İESL protein gen ürünü 9.5 (PGP), bir pan nöronal belirteç 10-12 kullanılarak etiketlenir. Şu anda, standart kullanarak küçük lif nöropati teşhis etmek için uygulama aydınlık mikroskobu 6 ile PGP boyama tarafından belirlenir IENFD. Olduğu Ayrıca, çeşitli araştırma grupları PGP immünhistokimya 7-9 için immunofluorescent protokolleri kullandık. Küçük lif nöropati genellikle nöropatik ağrı ile ilişkilidir. Daha fazla ağrı işlem için gerekli İESL rolünü anlamak için, biz ağrı oluşturmak lifleri ile birlikte etiket toplam İESL için bir teknik geliştirdi. Nocicepözellikle Aö tive İESL ve C lifleri, PGP ile İESL bir arada-etiketleme ve nosiseptif işaretleyici, tropomiyozin-reseptör-kinaz A (Trk A) 5 üzerinden incelenebilir. Trk A nosisepsiyon gelişimi için gerekli olan bir sinir büyüme faktörü için yüksek afiniteli reseptördür. Trk A pozitif nosiseptif sinir lifleri peptiderjik lifleri olduğunu ifade P maddesi (SP) ve kalsitonin gen ilişkili peptid (CGRP). Daha önce, Lauria ve arkadaşları PN, 10 bir nosiseptif işaretleyici ile birlikte etiketleme PGP pozitif İESL incelemek için çift etiketleme tekniği uygulanır. Daha önceki çalışmada, Trk A pozitif İESL, ancak Trk A-negatif İESL, ağrılı diyabetik nöropati 5 bir hayvan modelinde upregulated olduğunu göstermiştir. Bu ortak etiketleme tekniği IENFD ve PN ile ilişkili morfolojik çalışma yeteneği toplam nosiseptif IENFD ölçümü karşılaştırmak için yeteneği sağlar. Nosiseptif İESL ve iştigal görselleştirmek için yeteneğinosiseptif IENFD toplam IENFD yeniden ölçümü PN ile ilişkili ağrının şiddeti içine objektif ağrı varlığı için kanıt, ve muhtemelen fikir verebilir. Bu teknik ayrıca, hayvan modelleri arasında cilde uygulanabilir. Daha önceki çalışmalarda ile karşılaştırıldığında, mevcut protokol 2D görüntü analizi oluşabilir hataları önlemek için fırsat yaratmak, 3D görüntü analizi için yöntemler anlatılmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bir Bölüm: İmmünohistokimya
Arka plan boyama Delme deri biyopsisi 96 oyuklu plaka hazırlanması ve önlenmesi insan denekler toplandı ve sabitleştirici çözelti içinde 12-24 saat (2% 0.75 M L-Lizin çözeltisi (pH 7.4) ile paraformaldehit ve 0,05 mM sodyum periodat) inkübe edilir 4 ° C sıcaklıkta, daha önce tarif edildiği 8. Örnekler daha sonra daha sonra montaj medya optimum kesim sıcaklık (OCT), bir kriyostat 50 mikron kalınlığında bölüme kesitli gömülü, en fazla 1 hafta için 4 az 20% gliserol ° C ile tuzlu su (PBS) tamponlu fosfat cryoprotected vardır. Aşağıda tarif edilen protokole eden bir 96-çukurlu plaka içinde serbest bir immünohistokimya geçmesi deri kesitleri, maksimum sayıda olası, 8 deri kesitleri için tasarlanmıştır.
1. GÜN:
1. Stratum corneum Non-spesifik İmmünreaktivitesi önlenmesi
- Etiket 96 oyuklu plaka Şekil 1 'de gösterildiği gibi. Resim-IT 96-plaka Satır 1 her kuyuya arka plan boyama 11,12, engelleme etkili FX Sinyal (Resim-IT), 150 ul ekleyin.
- 96-kuyulu plakanın Sıra 2 ve 3, her kuyuya 1X PBS 150 ul ekle.
- Hasta başına iki adet 50 mikron bölümleri edinin: DL alınan biyopsi itibaren bir bölümü, PT alınan biyopsi gelen bir bölüm. Bir aşılama döngü (LeLoop) morfolojik zarar görmemesi için bir sonraki durulama birinden bölümleri aktarmak için kullanılır. Yavaşça Resim-IT içeren, iyi Satır 1 bir birey haline, bir aşılama döngü kullanarak, her 50 mikron bölümü aktarmak. Düz rocker oda sıcaklığında 30 dakika için Resim-IT bölümleri inkübe edin.
- Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca PBS 1X (satırlar 2 ve 3) ile iki kez bölümleri durulayın. Durulama arasında düz bir rocker plaka yerleştirin.
2. % 5 BSA Engelleme Çözümü ve% 1 Yıkama Çözüm hazırlanması
- Biyopsi bölümleri Resim-BT kuluçka olsa da, çözüm engelleme 5% hazırlamaktın (% 5 BSA tamamen eriyene kadar BSA,% 0.3 TX-100, 0.1 M PBS-Vortex çözelti) eklenmiştir.
- Satır 4 her kuyuya% 5 BSA engelleme çözeltisi 150 ul ekle.
- , Bir aşılama döngü kullanılarak,% 5 BSA bloke çözeltisinin bireysel kuyulara bölümleri transfer. Düz rocker 1-2 oda sıcaklığında saat 5% BSA engelleme çözümü bölümleri inkübe edin.
3. Primer Antikorlar 1% BSA Durulama Çözüm ve Seyreltme hazırlanması
- Kesitler% 5 BSA çözeltisi içinde bloke kuluçka iken,% 1 durulama çözeltisi (% 1 BSA,% 0.3 TX-100, 0.1 M PBS-BSA çözeltisi Vorteks tamamen eriyene kadar) hazırlanması.
- Kesitler% 5 BSA engelleme çözeltisi içinde inkübe edilir olsa da,% 1 çözeltisi durulama primer antikorlar seyreltin.
- Sekiz bölümden (8 x 150 ul = 1.200 ml) 1.200 ul toplam gereklidir. Primer antikor 1.500 ul (% 20 ilave hacim kadar) içinde yapılır.
- Birincil antikor çözeltiler: PGP, 1:500; Trk A,1:500 1% BSA çözeltisi durulama.
4. İlköğretim Antikor içinde Kesitli Biyopsiler inkübasyonu
- 96-kuyulu plakanın belirlenmiş oyuklara (sıra 5) içine seyreltilmiş birincil antikor 150 ul ekle.
- Belirlenen primer antikor kuyular (Satır 5) içine% 5 engelleme çözümü (Satır 4) bölümleri aktarın.
- Kurutma ve hafif etkilenmemesi için parafilm ve alüminyum folyo ile 96 plaka mühür.
- Düz bir rocker 96-plaka 4 O / N ° C inkübe edin.
2. GÜN:
5. % 1 BSA Yıkama Çözüm Biyopsiler durulayın
- Her Serisi 6 iyi, 7, ve 8 içine% 1 BSA durulama solüsyonu 150 ul ekleyin.
- 1 saat oda sıcaklığında her bir kez% 1 BSA durulama çözeltisi (satır 6, 7 ve 8) ile bölümler üç kez yıkayın. Durulama arasında düz rocker alüminyum folyo ve yer ile plaka Kapak.
6. İkincil antikorlar seyreltilmesi
<ol>- Sekiz bölümden (8 x 150 ul = 1.200 ml) 1.200 ul toplam gereklidir. İkincil antikorlar 1.500 ul (% 20 ilave hacim kadar) içinde yapılır.
- İkincil antikor seyreltileri:% 1 BSA durulama çözeltisi içinde Trk A (Alexa Fluor 647 eşek anti-keçi, 1:250) PGP (Alexa Fluor 488 eşek anti-tavşan, 1:250) için.
7. İkincil Antikor içinde Kesitli Biyopsiler inkübasyonu
- 96-kuyulu plakanın kendi belirlenmiş oyuklara (satır 9) içine seyreltilmiş sekonder antikor, 150 ul ekleyin.
- De ikincil antikor içine% 1 BSA engelleme çözümü (Satır 8) (Row 9) bölümleri aktarın.
- Kurutma ve hafif etkilenmemesi için parafilm ve alüminyum folyo ile 96 plaka mühür.
- Belirlenen sekonder antikor O bölümleri inkübe4 de / N ° düz rocker C.
8. % 1 BSA Yıkama Çözüm Biyopsiler durulayın
- Sıra 10, 11, ve 12 her kuyuya% 1 BSA yıkama çözeltisi 150 ul ekle.
- 1 saat oda sıcaklığında her bir kez% 1 BSA durulama çözeltisi (satır 10, 11, ve 12) ile bölümler üç kez yıkayın. Durulama arasında düz bir rocker alüminyum folyo ve yer ile plaka Kapak.
9. Mikroskop Slaytlar ve Montaj Kesitli Biyopsiler hazırlanması
- Biyopsi bölüm 1% BSA durulama solüsyonu (Satır 12) Son yıkamada kuluçka olsa da, mikroskop slaytlar hazırlamak.
- Her seferinde bir slayt üzerinde% 1 BSA yıkama çözeltisi 50 ul koyun.
- 1% BSA durulama solüsyonu (Satır 12) bölümleri çıkarın ve belirlenen mikroskop lamı üzerine 1% BSA durulama çözüm 50 ul damla yerleştirin. Bölümün konumunu optimize sonra, önlemlerin alınması, bir soğan biçiminde cam pipet ile fazla% 1 BSA durulama çözüm kaldırmakörnek dokunmamak için.
NOT: bölümünün üzerine katlanmış olmadığından emin olun, numune mikroskop lamı yüzeyine karşı düz olmalıdır.
- Yeri 1 damla mikroskop lamı üzerine biyopsi yakın DAPI ile reaktif montaj Altın antifade uzatır. Bir 22x22 mm mikroskop cam lamel alın ve yavaşça biyopsi üzerine yerleştirin ve bir damla DAPI damla ile Altın antifade reaktif uzatmak. Her bölüm için tekrarlayın.
- Karanlıkta oda sıcaklığında O / N mikroskop slaytlar kurumasını bekleyin.
NOT: Bir pipet kullanarak herhangi bir hava kabarcıklarını çıkarın. Altın antifade reaktif uzatmak uzak aşırı silin.
Bölüm B: Konfokal Görüntüleme
10. Konfokal Görüntüleme
- 40X yağ daldırma (1.3 NA) objektif ve Fluoview sürüm 5.0 yazılımı ile zoom iki kez konfokal mikroskop tarama bir Olympus Fluoview 500 lazer kullanarak görüntü floresan sinyalleri. Sırasıyla 543-nm HeNe yeşil lazer ve 633-nm HeNe Kırmızı lazer, heyecanlandırmak için Alexa Fluor 488 ve Alexa Fluor 647 kullanın. Alexa Fluor 488 sinyal kırmızı bir LUT tarafından masa yeşil bir görünüm (LUT) ve Alexa Fluor 647 ile temsil edilir.
- Sinyalleri geliştirmek için 400 mikron her dedektör için konfokal diyafram ayarlayın. Sıralı tarama sinyal ayırma üst düzeye çıkarmak için 1.024 x 1.024 çözünürlükte alınmalıdır.
- Kalman ortalama (iki kare) ile 1.2 mikron z adım aralıklarla (Fluoview yazılımı tarafından hesaplanan en uygun tarama ünitesi dayalı) kullanarak üç boyutlu z serisi yakalamak.
Bölüm C: Üç boyutlu Görselleştirme ve Animasyon
11. Üç boyutlu (3D) Görselleştirme ve Animasyon
- Imaris x64 yazılım açık Fluoview dosyaları (sürüm 7.3, Bitplane AG) 3D görüntü setleri görselleştirmek için.
- Ayarlayın gibi sinir belirli bir sinyal kontrast arttırmak için gerekli görüntüler.
- Bir su oluşturmakdermal-epidermal sınır görselleştirmek için RFaCe. Sınır çizmek için beraberlik modunda Kontur aracını kullanın.
- Temel floresan sinyalleri görmek için sınır bir yarı saydam yüzey atayın.
- 3D film Anlık görüntüler oluşturmak için 3D floresan sinyallerin fotoğraf yakalayın.
- Bir 3D film oluşturmak için animasyon özelliğini kullanın. Görüntüler (Şekil 2, 3, ve 4) ayrı ayrı ve birleştirilmiş her sinyal göstermek için 360 derece birkaç kez döndürülebilir. Saniyede 15 kare animasyon 200 kare oluşan filmleri oluşturmak için animasyon ayarlayın. Bir ham AVI dosyası olarak her bir film kaydedin.
- VirtualDub yazılımı (versiyon 1.9.4) ile son AVI film sıkıştırın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Biz PN hastalardan PT ve DL biyopsi İESL morfolojisini incelemek için geçerli protokol uygulanır. Cilt, üç konulardan, PN ile ilişkili pathomorphology göstermek için Utah Üniversitesi'nde toplandı. Konular şunlardır: Durum 1: tip 2 diyabet (: 14 ay; ağrı skoru: süresi 51); PN öyküsü olan 51 yaşındaki erkek Durum 2: PN öyküsü olan 56 yaşındaki erkek ve Durum 3: Tip 2 diyabet (: 42 ay; ağrı skoru: süresi 46) PN bir geçmişi olan 66 yaşındaki erkek; tip 2 diyabet (:; 47 ağrı skoru 108 ay süreli) bir. Kantitatif duyusal test ve sinir ileti çalışmaları da dahil olmak üzere nörolojik öykü ve muayene, periferik nöropati değerlendirmek için yapıldı. Ağrı skorları 0-100 görsel analog ağrı skalasına göre belirlenmiştir.
Bu protokol kullanarak, insan derisinde IENFs (Şekil 2) 3 boyutlu yapısını incelemek edebiliyoruz. Şekil 2'de, (Şekil 3) incelemek için kullanılabilir. Şekil 3'te sunulan aksonal şişlikler, 3 boyutlu görüntüleme Bu şişlikler IENFs boyunca dağıtılmıştır küresel yapılar olduğunu göstermektedir. Buna ek olarak, bu yöntemler IENFs (Şekil 4) bölgesindeki dallanma incelemek için kullanılabilir. Şekil 4 'de dallanma 3D görüntülerin morfolojik değişiklikler PN varlığı ile yer aldığını göstermektedir. Daha önce açıklandığı gibi, dermal-epidermal sınır morfolojisi ve yönlendirme sinirlerin ve dermis ve epidermis 8 arasındaki piksel yoğunluğu fark temel alınarak belirlenmiştir. Mavi Şekil 2, 3 tasvir izleme, ve 4, Dermal-epidermal bağlantı gösterir.
Şekil 1. Deri biyopsisi immünhistokimya için bir 96-plaka için kurulum temsil eden şematik diyagramı.
Şekil 2. İESL üç boyutlu (3D) görüntü. (A) PGP pozitif İESL Temsilcisi 3D görüntü, nosiseptif İESL (ikinci 360 ° dönme) temsil eden kırmızı etiketli toplam İESL (ilk 360 ° dönme) ve (B) Trk A pozitif İESL, temsil eden, yeşil etiketli ve (C ) Durum 1 bir cilt örnek PGP pozitif, nosiseptif İESL (üçüncü 360 ° dönme) gösteren birleştirilmiş bir görüntü. Bar = 20 mikron. filmi görmek için buraya tıklayın.
Şekil3. PN İESL aksonal şişlikler üç boyutlu (3D) görüntü. Olgu 2 bir deri örnek yeşil bir sinyal ile PGP etiketli IENFs birlikte aksonal şişlikler (ok başları),, ve cilt altı pleksus içinde Temsilcisi 3D görüntü. Bar = 10 mm. filmi görmek için buraya tıklayın.
Şekil 4. PN İESL dallanma aksonal üç boyutlu (3D) görüntü. Durum 3 bir deri örneğinde, yeşil bir sinyal ile PGP etiketli IENFs birlikte aksonal dallanma (ok başları) Temsilcisi 3D görüntü,. Bar = 20 mikron. filmi görmek için buraya tıklayın.
| % 5 BSA Engelleme Çözüm Bileşenleri: | 12.5 ml için gerekli miktar |
| 1X PBS | 8.125 ml |
| % 0.1 Triton X-100 (TX-100) [nihai konsantrasyon:% 0.03] | 3.75 ml |
| Sığır Serum Albumin (BSA) | 0.625 g |
| TOPLAM | 12.5 mi |
Tablo 1. % 5 BSA Çözüm engelleme.
| 1% Bileşenleri Çözüm Durulama: | 12 ml için gerekli miktar |
| 1X PBS | 8.625 ml |
| % 0.1 TX-100 [Final Konsantrasyon: 0.03%] | 3.25 ml |
| Sığır Serum Albumin (BSA) | 0.125 gr |
| TOPLAM | 12 mL |
Tablo 2'de. 1% BSA Çözüm engelleme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
IENFD ölçümü yaygın periferik nöropatiler 13,14 derecesini belirlemek için kullanılmıştır. Şu anda, en sık kullanılan protokol sadece epidermisin bazal membran nüfuz sinir liflerinin yoğunluğu ölçer, bu dikkate aksonal dallanma ve / veya sinirlerin morfolojik değişiklikler almaz. Buna ek olarak, mevcut IENFD analiz PN 15 ağrı varlığı ile IENFD ilişkili olduğu gösterilmiştir olmamıştır.
Daha önce nosiseptif IENFD artan sayıda db / db farelerinde ağrı davranışları, tip 2 diyabet 5'te bir fare modeli ile ilişkili olduğu bildirilmektedir. Bu raporda, ilk nosiseptif İESL incelemek için bir çift immunofluorescent protokolü uyguladık. Bu çalışmada, biz PN hastalardan insan derisi için protokol genişletin. Çift immunofluorescent analizi aracılık IENFs alt kümesini, toplam İESL ve nosiseptif İESL hem ölçümleri sağlarağrı. Bu nosiseptif İESL Trk A ve diğer nosiseptif nöropeptitlerin 5 için çoğunlukla olumlu. Ağrılı nöropatiler benzer çift immunofluorescent analizi Lauria ve arkadaşları 10 tarafından tarif edilmiştir. Onlar rapor ağrılı nöropatisi olan hastalarda geçici reseptör potansiyeli katyon kanal alt ailesi V üyesi 1 (TRPV1) için IENFD azalır. Mevcut protokol bizim hayvan verileri 5 dayalı nosiseptif IENFD ölçümü için alternatif bir yaklaşım sağlayabilir.
Mevcut protokol İESL yapısı eğitim için bir 3D bir yaklaşım sunuyor. Çift immunofluorecent analizi ile birlikte, mevcut protokol nosiseptif IENFs morfolojisini incelemek için yöntemler sağlar. Önceki çalışmalar yoğunlukları arasında veya PN ile nosiseptif İESL dallanma bir ilişki rapor edilmemiştir. Burada, aksonal insan derisinin IENFs dallanma ve şişlik eğitim için bir protokol göstermektedir. Bizim 3D analiz göstermektedir ki bu method PN İESL morfolojik değişiklikleri incelemek için kullanılabilir. Buna ek olarak, 3D görüntü 2D görüntü ile bağlantılı üst üste yapıların azaltılmış görselleştirme ile ilişkili hata kaçınarak IENFD ölçüm mevcut protokoller iyileştirebilir.
Aksonal şişme iki katından daha büyük orijinal aksonal kalibre 16 arasında bir çapa sahip bir aksonal bölümünün büyütülmüş olarak tanımlanır. Bu yapı aksonal hücre iskeleti ve aksonal taşıma bileşenlerinin parçaları içerir. Aksonal şişme aksonal nöropati 6,16,17 erken bir özelliği olarak kabul edilir. Bununla birlikte, aksonal şişme yapıların 3D analiz literatürde rapor edilmemiştir. Şekil 3'te görüldüğü gibi, 3 boyutlu görüntüleme PN ile ilişkili aksonal şişme için önemli fikir verebilir.
İyi aksonal dallanma sinir hasarı 18 kurtarma eşlik eden karakterizedir. Bununla birlikte,aksonal dallanma miktarının kullanılabilir metodoloji hala 2B görüntüleme dayalı sınırlıdır. Şekil 4 'de tarif edildiği gibi, aksonal dallanma rejenere sinirlerin dolambaçlı doğası gereği karmaşık olabilir. Sonuç olarak, dallanma noktaları miktar doğruluğunu etkileyebilir yakın sinir lifleri tarafından gizlenmiş olabilir. Bizim protokol 3D görüntü analiz dallanma sinirlerin Ayrıntılar için geliştirilmiş görselleştirme sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etmek.
Acknowledgments
Bu çalışma Sağlık Hibeler Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenmiştir K08 NS061039-01A2, Nöroloji Araştırma ve Keşif ve Michigan Üniversitesi'nde A. Alfred Taubman Tıp Araştırma Enstitüsü için Programı. Bu çalışma, Morfoloji ve Diyabet ve Sindirim ve Böbrek Hastalıkları Ulusal Enstitüsü'nden Sağlık Hibe 5P90 DK-20572 Ulusal Enstitüleri tarafından finanse edilen Michigan Diyabet Araştırma ve Eğitim Merkezi, resmi Analizi Çekirdek kullanılır. Yazarlar nosiseptif biyolojik immünhistokimya tekniği ilk gelişimini desteklemek için insan deri örneklerinde kendi cömert bağış için Robinson Singleton ve Gordon Smith (Utah Üniversitesi) teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X PBS | Fisher Scientific | BP399-4 | To make up 1X PBS |
| Image-IT FX Signal | Invitrogen | I36933 | Image-IT |
| Protein Gene Product 9.5 (Polyclonal rabbit) | AbD Serotec | 7863-0504 | PGP |
| Tropomyosin Related-Kinase A (Polyclonal goat) | R&D Systems | AF1056 | Trk A |
| Alexa Fluor 488 donkey α-rabbit | Invitrogen | A21206 | AF488 donkey α-goat |
| Alexa Fluor 647 donkey α-goat | Invitrogen | A21447 | AF647 donkey α-goat |
| Albumin, from Bovine Serum | Sigma-Aldrich | A7906-100 | BSA |
| Triton X- 100 | Sigma-Aldrich | T9284 | TX-100 |
| Non-calibrated Loop | LeLoop | MP 199025 | inoculating Loop |
| 96-well assay plate | Corning Incorporated | 3603 | Well plate |
| Prolong Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P36931 | DAPI |
| Microscope Cover Glass 22x22 mm | Fisher Scientific | 12-541-B | Coverslips |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | Microscope Slides |
| Olympus Fluoview Laser Scanning Confocal Microscope | Olympus | FV500 | Confocal Microscope |
| Optimum Cutting Temperature | Sakura | 4583 | OCT |
| Leica cryostat | Leica | CM1850 | Cryostat |
References
- Lauria, G., Holland, N., et al. Epidermal innervation: changes with aging, topographic location, and in sensory neuropathy. J. Neurol. Sci. 164 (2), 172-178 (1999).
- Sullivan, K. A., Hayes, J. M., et al. Mouse models of diabetic neuropathy. Neurobiol. Dis. 28 (3), 276-285 (2007).
- McArthur, J. C., Stocks, E. A., Hauer, P., Cornblath, D. R., Griffin, J. W. Epidermal nerve fiber density: normative reference range and diagnostic efficiency. Arch. Neurol. 55 (12), 1513-1520 (1998).
- Griffin, J. W., McArthur, J. C., Polydefkis, M. Assessment of cutaneous innervation by skin biopsies. Curr. Opin. Neurol. 14 (5), 655-659 (2001).
- Cheng, H. T., Dauch, J. R., Hayes, J. M., Yanik, B. M., Feldman, E. L. Nerve growth factor/p38 signaling increases intraepidermal nerve fiber densities in painful neuropathy of type 2 diabetes. Neurobiol. Dis. 45 (1), 280-287 (2012).
- Lauria, G., Lombardi, R., Camozzi, F., Devigili, G. Skin biopsy for the diagnosis of peripheral neuropathy. Histopathology. 54 (3), 273-285 (2009).
- Vlckova-Moravcova, E., Bednarik, J., Dusek, L., Toyka, K. V., Sommer, C. Diagnostic validity of epidermal nerve fiber densities in painful sensory neuropathies. Muscle Nerve. 37 (1), 50-60 (2008).
- Casanova-Molla, J., Morales, M., et al. Axonal fluorescence quantitation provides a new approach to assess cutaneous innervation. J. Neurosci. Methods. 200 (2), 190-198 (2011).
- Wang, L., Hilliges, M., Jernberg, T., Wiegleb-Edstrom, D., Johansson, O. Protein gene product 9.5-immunoreactive nerve fibres and cells in human skin. Cell Tissue Res. 261 (1), 25-33 (1990).
- Lauria, G., Morbin, M., et al. Expression of capsaicin receptor immunoreactivity in human peripheral nervous system and in painful neuropathies. J. Peripher. Nerv. Syst. 11 (3), 262-271 (2006).
- Penna, G., Fibbi, B., et al. Human benign prostatic hyperplasia stromal cells as inducers and targets of chronic immuno-mediated inflammation. J. Immunol. 182 (7), 4056-4064 (2009).
- Lentz, S. I., Edwards, J. L., et al. Mitochondrial DNA (mtDNA) Biogenesis: Visualization and Duel Incorporation of BrdU and EdU Into Newly Synthesized mtDNA In Vitro. J. Histochem. Cytochem. 58 (2), 207-218 (2010).
- Polydefkis, M., Hauer, P., Griffin, J. W., McArthur, J. C. Skin biopsy as a tool to assess distal small fiber innervation in diabetic neuropathy. Diabetes Technol. Ther. 3 (1), 23-28 (2001).
- Lauria, G. Small fibre neuropathies. Curr. Opin. Neurol. 18 (5), 591-597 (2005).
- Sorensen, L., Molyneaux, L., Yue, D. K. The relationship among pain, sensory loss, and small nerve fibers in diabetes. Diabetes Care. 29 (4), 883-887 (2006).
- Lauria, G., Morbin, M., et al. Axonal swellings predict the degeneration of epidermal nerve fibers in painful neuropathies. Neurology. 61 (5), 631-636 (2003).
- Herrmann, D. N., McDermott, M. P., et al. Epidermal nerve fiber density, axonal swellings and QST as predictors of HIV distal sensory neuropathy. Muscle Nerve. 29 (3), 420-427 (2004).
- Navarro, X. Chapter 27: Neural plasticity after nerve injury and regeneration. Int. Rev. Neurobiol. 87, 483-505 (2009).
