Summary
Per studiare i cambiamenti di fibre nervose nocicettive intraepidermiche (IENFs) nelle neuropatie dolorose (PN), abbiamo sviluppato protocolli che potrebbe esaminare direttamente le variazioni morfologiche tridimensionali osservati in IENFs nocicettivi. Analisi tridimensionale IENFs ha il potenziale di valutare le variazioni morfologiche del IENF in PN.
Abstract
Una biopsia della pelle è comunemente utilizzato per quantificare intraepidermiche densità delle fibre nervose (IENFD) per la diagnosi di polineuropatia 1,2 periferico. Attualmente, è pratica comune per raccogliere 3 millimetri biopsie dalla gamba distale (DL) e la coscia prossimale (PT) per la valutazione di polyneuropathies lunghezza-dipendenti 3. Tuttavia, a causa della natura di IENFs multidirezionale, è impegnativo per esaminare sovrapposizione strutture nervose attraverso l'analisi di formazione immagine bidimensionale (2D). Alternativamente, l'imaging tridimensionale (3D) potrebbe fornire una soluzione migliore per questo dilemma.
Nella presente relazione, presentiamo i metodi per applicare l'imaging 3D per lo studio neuropatia dolorosa (PN). Per identificare IENFs, campioni di pelle vengono elaborati per l'analisi di immunofluorescenza di proteine prodotto genico 9.5 (PGP), un marcatore neuronale padella. Al momento, si tratta di una pratica standard per la diagnosi di piccole neuropatie in fibra con IENFD scoraggiareminato da PGP immunoistochimica utilizzando campo chiaro microscopia 4. In questo studio, abbiamo applicato all'analisi doppia immunofluorescenza per identificare IENFD totale, utilizzando PGP, e IENF nocicettiva, attraverso l'uso di anticorpi che riconoscono tropomiosina-recettore-chinasi A (Trk A), il recettore ad alta affinità per il fattore di crescita nervosa 5. I vantaggi di co-colorazione IENF con anticorpi A PGP e Trk avvantaggia lo studio del PN dalla colorazione chiaramente PGP-positivi, le fibre nocicettive. Questi segnali fluorescenti possono essere quantificati per determinare nocicettivi cambiamenti IENFD e morfologiche IENF associate a PN. Le immagini fluorescenti sono acquisite da microscopia confocale ed elaborati per l'analisi 3D. 3D Imaging fornisce capacità di rotazione per analizzare ulteriormente i cambiamenti morfologici associati a PN. Nel loro insieme, fluorescente co-colorazione, confocale e analisi 3D chiaramente beneficiare studio della PN.
Introduction
Allo stato attuale, è pratica comune per i medici di quantificare intraepidermiche densità delle fibre nervose, (IENFD) da biopsie cutanee, che possono essere utilizzati per diagnosticare piccole neuropatie fibra 3, 6-8. Le biopsie sono presi dalla gamba distale (DL), 10 cm sopra il malleolo laterale, e la coscia prossimale (PT), 20 cm al di sotto della spina iliaca anteriore 9. Tutto IENF vengono etichettati utilizzando prodotto gene della proteina 9.5 (PGP), un marker neuronale padella 10-12. Al momento, si tratta di una pratica standard per la diagnosi di piccole neuropatie in fibra con IENFD determinata colorando PGP con campo chiaro microscopia 6. Inoltre, diversi gruppi di ricerca hanno utilizzato protocolli di immunofluorescenza per PGP immunoistochimica 7-9. Neuropatia Piccolo fibra è comunemente associato con dolore neuropatico. Per comprendere ulteriormente il ruolo di IENF essenziale per l'elaborazione del dolore, abbiamo sviluppato una tecnica di co-label IENF totale con fibre che generano dolore. Nociceptiva IENF, specificamente Aδ e fibre C, possono essere studiati attraverso la co-etichettatura dei IENF con PGP e il marcatore nocicettivo, tropomiosina-recettore-chinasi A (Trk A) 5. Trk A è il recettore ad alta affinità per il fattore di crescita nervoso che è essenziale per lo sviluppo della nocicezione. Le fibre nervose nocicettive A-positivi Trk sono fibre peptidergici che esprimono la sostanza P (SP) e la calcitonina peptide correlato al gene (CGRP). In precedenza, Lauria e colleghi hanno applicato la tecnica della doppia etichettatura per studiare PN, co-etichettatura IENF PGP-positivo con un pennarello nocicettivo 10. Nel nostro precedente studio, abbiamo dimostrato che Trk IENF A-positivo, ma non Trk IENF A-negativo, sono stati sovraregolati in un modello animale di neuropatia diabetica dolorosa 5. Questa tecnica di co-etichettatura offre la possibilità di confrontare la quantificazione di IENFD nocicettivo al totale IENFD e la capacità di studiare i cambiamenti morfologici associati a PN. La capacità di visualizzare nocicettivo IENF e compare quantificazione di IENFD totale a IENFD nocicettivo potrebbe fornire evidenza oggettiva per la presenza di dolore, e possibilmente comprensione della gravità del dolore associato a PN. Questa tecnica è applicabile alla pelle anche di modelli animali. Rispetto agli studi precedenti, l'attuale protocollo descrive i metodi per l'analisi delle immagini 3D, creando l'opportunità di evitare errori che potrebbero verificarsi in analisi di immagini 2D.
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Protocol
Parte A: Immunoistochimica
Preparazione della piastra a 96 pozzetti e la prevenzione di colorazione di fondo Punch biopsie cutanee sono raccolti da soggetti umani e incubato per 12-24 ore in una soluzione di fissativo (paraformaldeide al 2% con 0,75 M soluzione di L-lisina (pH 7.4) e 0,05 mm di sodio periodate) a 4 ° C, come descritto in precedenza 8. I campioni vengono poi crioprotetti in tampone fosfato (PBS) con il 20% di glicerolo a 4 ° C per un massimo di 1 settimana, incorporato nel supporto di montaggio della temperatura ottimale di taglio (OCT), poi sezionato in 50 micron sezioni spesse su un criostato. Il protocollo descritto di seguito è progettato per 8 sezioni di pelle, il numero massimo di sezioni cutanee possibile sottoporsi immunoistochimica libero di fluttuare in una piastra a 96 pozzetti.
1 ° GIORNO:
1. Prevenzione della immunoreattività non specifica nello strato corneo
- Etichetta piastra da 96 pozzetti, come mostrato in Figura 1. Aggiungere 150 ml di Immagine-IT FX Signal (Immagine-IT), efficace per bloccare la colorazione di fondo 11,12, in tutti i pozzetti in riga 1 della piastra a 96 pozzetti.
- Aggiungere 150 microlitri di PBS 1X in ciascun pozzetto della fila 2 e 3 della piastra a 96 pozzetti.
- Acquisire due 50 sezioni micron per paziente: una sezione della biopsia prese a DL, una sezione della biopsia prese a PT. Di un'ansa da inoculo (LeLoop) è utilizzato per trasferire sezioni da un risciacquo all'altro per evitare danni morfologici. Delicatamente trasferire ogni sezione 50 micron, con un ansa, in un individuo ben di Riga 1, contenente immagini-IT. Incubare le sezioni in Image-IT per 30 min a RT su un rocker piatto.
- Sciacquare le sezioni due volte con PBS 1X (righe 2 e 3) per 10 min a RT. Collocare piastra bene su una sedia a dondolo piatta tra risciacqui.
2. Preparazione del 5% BSA Blocking Solution e 1% soluzione di risciacquo
- Mentre le sezioni di biopsia sono incubando in Image-IT, preparare 5% soluzione bloccantezione (5% di BSA, 0,3% TX-100, 0,1 M soluzione di PBS-Vortex fino BSA si scioglie completamente).
- Aggiungere 150 ml di soluzione di blocco BSA 5% in ogni pozzetto della fila 4.
- L'utilizzo di un ansa, trasferire le sezioni in singoli pozzetti della soluzione bloccante 5% di BSA. Incubare le sezioni in soluzione di blocco BSA 5% per 1-2 ore a temperatura ambiente su un rocker piatto.
3. Preparazione di 1% BSA risciacquo soluzione e diluizione degli anticorpi primari
- Mentre le sezioni sono incubando in una soluzione bloccante 5% BSA, preparare la soluzione di risciacquo 1% (1% BSA, TX-100, 0,1 M soluzione di PBS-Vortex 0,3% BSA fino scioglie completamente).
- Mentre le sezioni sono incubando in una soluzione bloccante 5% BSA, diluire anticorpi primari in 1% soluzione di risciacquo.
- Per otto sezioni (8 x 150 ml = 1,200 microlitri) è necessario un totale di 1.200 microlitri. Gli anticorpi primari sono costituiti i 1.500 microlitri (circa il 20% del volume extra).
- Le diluizioni degli anticorpi primari: PGP, 1:500; Trk A,1:500 in 1% BSA soluzione di risciacquo.
4. L'incubazione delle biopsie sezionati in anticorpo primario
- Aggiungere 150 ml di anticorpi primari diluiti nei pozzetti designate della piastra a 96 pozzetti (riga 5).
- Trasferire sezioni da bloccare soluzione al 5% (riga 4) nei pozzetti di anticorpi primari designati (riga 5).
- Sigillare la piastra a 96 pozzetti con parafilm e foglio di alluminio per evitare l'essiccazione e l'esposizione alla luce.
- Incubare la piastra a 96 pozzetti O / N a 4 ° C su un rocker piatto.
GIORNO 2:
5. Sciacquare biopsie in 1% BSA soluzione di risciacquo
- Aggiungere 150 microlitri di soluzione di risciacquo BSA 1% in ogni pozzetto con riga 6, 7, e 8.
- Risciacquare sezioni tre volte con soluzione di risciacquo BSA 1% (righe 6, 7, e 8) per 1 ora ogni volta a RT. Coprire la piastra bene con un foglio di alluminio e posto su bilanciere piatta tra risciacqui.
6. Diluizione degli anticorpi secondari
<ol>- Per otto sezioni (8 x 150 ml = 1,200 microlitri) è necessario un totale di 1.200 microlitri. Gli anticorpi secondari sono costituiti i 1.500 microlitri (circa il 20% del volume extra).
- Le diluizioni degli anticorpi secondari: per PGP (Alexa Fluor 488 asino anti-coniglio, 1:250), per Trk A (Alexa Fluor 647 asino anti-capra, 1:250) in 1% BSA soluzione di risciacquo.
7. L'incubazione delle biopsie sezionati in anticorpo secondario
- Aggiungere 150 ml di anticorpi secondari diluiti nei rispettivi pozzetti designate della piastra a 96 pozzetti (riga 9).
- Trasferire le sezioni da 1% soluzione di BSA blocco (riga 8) nel anticorpo secondario bene (riga 9).
- Sigillare la piastra a 96 pozzetti con parafilm e foglio di alluminio per evitare l'essiccazione e l'esposizione alla luce.
- Incubare sezioni del designato anticorpi secondari O/ N a 4 ° C su un rocker piatto.
8. Sciacquare biopsie in 1% BSA soluzione di risciacquo
- Aggiungere 150 microlitri di soluzione di BSA 1% risciacquo in ciascun pozzetto della fila 10, 11, e 12.
- Risciacquare sezioni tre volte con soluzione di risciacquo BSA 1% (righe 10, 11 e 12) per 1 ora ogni volta a RT. Coprire la piastra bene con un foglio di alluminio e posto su un bilanciere piatta tra risciacqui.
9. Preparazione di preparati microscopici e montaggio Biopsie sezionate
- Mentre le sezioni di biopsia sono incubando nell'ultimo risciacquo della soluzione di risciacquo BSA 1% (riga 12), preparare vetrini da microscopio.
- Porre 50 ml di soluzione di risciacquo 1% di BSA in una diapositiva alla volta.
- Rimuovere le sezioni da 1% soluzione di risciacquo BSA (riga 12) e posizionarlo nella 50 microlitri goccia di soluzione di risciacquo BSA 1% sul vetrino da microscopio designato. Dopo ottimizzando la posizione della sezione, rimuovere l'eccesso di soluzione di risciacquo BSA 1% con una pipetta di vetro bulbed, prendendo precauzioniper evitare di toccare il campione.
NOTA: Assicurarsi che la sezione non è ripiegato su, il campione deve essere piatto contro la superficie del vetrino da microscopio.
- Mettere 1 goccia di reagente Prolungare Oro montaggio con DAPI pressi della biopsia sul vetrino da microscopio antifade. Prendete un 22x22 mm microscopio vetrino di vetro e posizionare delicatamente sopra la biopsia e una goccia di reagente Prolungare antifade Oro con DAPI goccia. Ripetere l'operazione per ogni sezione.
- Lasciate vetrini da microscopio secco O / N a temperatura ambiente al buio.
NOTA: Rimuovere eventuali bolle d'aria utilizzando un puntale. Asciugare eccesso Prolungare reagente antifade Oro.
Parte B: confocale Imaging
10. Confocale Imaging
- Segnali di fluorescenza immagine utilizzando un Olimpo FluoView 500 microscopio confocale a scansione laser con una immersione in olio (1,3 NA) obiettivo zoom e due volte con la versione del software FluoView 5.0 40X. Utilizzare Alexa Fluor 488 e Alexa Fluor 647 per eccitare il 543-nm HeNe laser verde e il 633-nm HeNe laser rosso, rispettivamente. Il segnale Alexa Fluor 488 è rappresentato da uno sguardo verde up table (LUT) e la Alexa Fluor 647 da una LUT rosso.
- Impostare le aperture confocale per ogni rivelatore a 400 micron per migliorare i segnali. Scansioni sequenziali dovrebbero essere prese ad una risoluzione di 1.024 x 1.024 per massimizzare la separazione del segnale.
- Cattura tridimensionale Z-serie con intervalli di 1,2 micron z-step (in base all'unità di scansione ottimale calcolato dal software FluoView) con Kalman media (due fotogrammi).
Parte C: visualizzazione tridimensionale e animazione
11. Tridimensionale (3D) di visualizzazione e animazione
- Aprire i file FluoView in software Imaris x64 (versione 7.3, Bitplane AG) di visualizzare i set di immagini 3D.
- Regolare la visualizzazione come necessario per migliorare il contrasto del segnale specifico nervo.
- Creare un surfaccia per visualizzare il confine dermo-epidermica. Utilizzare lo strumento Contour in modalità di disegno per disegnare il contorno.
- Assegnare una superficie semitrasparente al contorno per vedere i segnali fluorescenti sottostanti.
- Cattura immagini fisse dei segnali fluorescenti 3D per creare immagini istantanee del film in 3D.
- Utilizzare la funzione di animazione per creare un film in 3D. Le immagini possono essere ruotate di 360 gradi più volte per mostrare separatamente e unito ogni segnale (figure 2, 3 e 4). Impostare l'animazione per creare filmati composti da 200 fotogrammi animati a 15 fotogrammi al secondo. Salvare ogni filmato come file AVI raw.
- Comprimere il filmato finale AVI con VirtualDub software (versione 1.9.4).
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Representative Results
Abbiamo applicato l'attuale protocollo per studiare la morfologia di IENF in PT e DL biopsie cutanee di pazienti con PN. La pelle, da tre soggetti, è stato raccolto presso l'Università dello Utah per dimostrare la Pathomorphology associata a PN. I soggetti sono: Caso 1: un 51-anno-vecchio maschio con una storia di PN di diabete di tipo 2 (durata: 14 mesi; punteggio del dolore: 51); Caso 2: un 56-anno-vecchio maschio con una storia di PN di diabete di tipo 2 (durata: 108 mesi; punteggio del dolore: 47), e causa 3: un 66-anno-vecchio maschio con una storia di PN di diabete di tipo 2 (durata: 42 mesi; punteggio del dolore: 46). Storia neurologica e l'esame, compresi i test sensoriali quantitativi e studi di conduzione nervosa, sono stati eseguiti per valutare la neuropatia periferica. I punteggi del dolore sono stati determinati sulla base della scala analogica visiva del dolore 0-100.
Usando questo protocollo, siamo in grado di studiare la struttura 3D di IENFs in pelle umana (Figura 2). In figura 2 (figura 3). Immagini 3D di rigonfiamenti assonali, presentati in figura 3, dimostra che questi rigonfiamenti sono strutture globulari distribuiti lungo IENFs. Inoltre, questi metodi possono essere utilizzati per studiare ramificazione in IENFs (Figura 4). Immagini 3D di ramificazione presentato nella Figura 4 dimostrano che i cambiamenti morfologici avvengono con la presenza di PN. Come precedentemente descritto, il confine dermo-epidermica è stata determinata sulla base di morfologia e l'orientamento dei nervi e la differenza di intensità dei pixel tra derma e dell'epidermide 8. Il tracciato blu, raffigurata nelle figure 2, 3 e 4, Indica la giunzione dermo-epidermica.
Figura 1. Rappresentazione schematica che rappresenta la configurazione di una piastra a 96 pozzetti per biopsia cutanea immunoistochimica.
Figura 2. Tridimensionali (3D) immagini di IENF. Rappresentante 3D immagine di (A) IENF PGP-positivo, etichettato verde, che rappresenta complessivamente IENF (prima rotazione di 360 °) e (B) Trk IENF A-positivo, etichetta rossa, che rappresenta IENF nocicettivo (seconda rotazione di 360 °), e (C ) una immagine fusa dimostrando PGP-positivo, IENF nocicettivo (terza rotazione di 360 °) in un campione di pelle da Case 1. Bar = 20 micron. Clicca qui per vedere film.
Figura3. Tridimensionale (3D) immagine di rigonfiamenti assonali in IENF di PN. Rappresentante Immagine 3D di rigonfiamenti assonali (punte di freccia) lungo IENFs, etichettati da PGP con un segnale verde, e all'interno del plesso sottocutaneo in un campione di pelle da Case 2. Bar = 10 micron. Clicca qui per vedere film.
Figura 4. Tridimensionale (3D) immagine di ramificazione assonale in IENF di PN. Rappresentante immagine 3D di ramificazione assonale (punte di freccia) lungo IENFs, etichettato da PGP con un segnale verde, in un campione di pelle da Case 3. Bar = 20 micron. Clicca qui per vedere film.
| Componenti del 5% BSA Blocking Solution: | Importo necessario per 12,5 ml |
| PBS 1X | 8.125 ml |
| 0,1% Triton X-100 (TX-100) [concentrazione finale: 0,03%] | 3,75 ml |
| Albumina di siero bovino (BSA) | 0.625 g |
| TOTALE | 12,5 ml |
Tabella 1. 5% di BSA Blocking Solution.
| Componenti del 1% Risciacquo Soluzione: | Importo necessario per 12 ml |
| PBS 1X | 8.625 ml |
| 0,1% TX-100 [concentrazione finale: 0,03%] | 3,25 ml |
| Albumina di siero bovino (BSA) | 0.125 g |
| TOTALE | 12 ml |
Tabella 2. 1% BSA Blocking Solution.
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Discussion
Misurazione di IENFD è stato ampiamente utilizzato per determinare il grado di neuropatie periferiche 13,14. Attualmente, il protocollo più comunemente usato misura solamente le densità di fibre nervose che penetrano la membrana basale dell'epidermide, ma non prende in considerazione ramificazione assonale e / o modifiche morfologiche dei nervi. Inoltre, l'analisi IENFD corrente non ha mostrato di correlare IENFD con la presenza di dolore in PN 15.
Abbiamo precedentemente riportato che l'aumento del numero di IENFD nocicettivo sono associati con comportamenti del dolore in db / db topo, un modello murino di diabete di tipo 2 5. In tale relazione, abbiamo prima applicato un doppio protocollo di immunofluorescenza per studiare IENF nocicettivo. In questo studio, abbiamo espandere il nostro protocollo di pelle umana da pazienti con PN. L'analisi doppia immunofluorescenza fornisce misurazioni di entrambi IENF totale e IENF nocicettivo, il sottoinsieme di IENFs che medianodolore. Questi IENF nocicettivo sono per lo più positivi per Trk A e altri neuropeptidi nocicettivi 5. Doppia immunofluorescenza analisi similare per neuropatie dolorose è stata descritta da Lauria e colleghi 10. Hanno riferito ridotto IENFD per transient receptor potenziale cazione canale sottofamiglia V membro 1 (TRPV1) in pazienti con neuropatie dolorose. Il protocollo attuale potrebbe fornire un approccio alternativo per la misura di IENFD nocicettivo sulla base dei nostri dati animali 5.
Il protocollo attuale offre un approccio 3D per studiare la struttura IENF. In combinazione con analisi doppio immunofluorecent, l'attuale protocollo fornisce metodi per esaminare la morfologia di IENFs nocicettivi. Precedenti studi non hanno riportato un'associazione tra la densità o ramificazione di IENF nocicettivo con PN. Qui, dimostriamo un protocollo per lo studio ramificazione assonale e gonfiore IENFs di pelle umana. La nostra analisi suggerisce che questo 3D metodo potrebbe essere usato per studiare i cambiamenti morfologici del IENF a PN. Inoltre, l'imaging 3D potrebbe migliorare i protocolli di misura correnti IENFD evitando errori che sono associati con ridotta visualizzazione di strutture sovrapposte associati 2D-imaging.
Rigonfiamento assonale è definita come un ingrandimento di una porzione assonale con un diametro maggiore di due volte quella del calibro assonale originale 16. Questa struttura contiene frammenti del citoscheletro assonale e componenti di trasporto assonale. Rigonfiamento assonale è considerata una caratteristica precoce di neuropatia assonale 6,16,17. Tuttavia, l'analisi di strutture 3D rigonfiamento assonale non è stato riportato in letteratura. Come illustrato nella Figura 3, l'imaging 3D potrebbe fornire indicazioni importanti per il gonfiore assonale associato a PN.
E 'ben caratterizzata che assonale ramificazione accompagna il recupero dalla lesione del nervo 18. Tuttavia, lametodologia disponibile per quantificare ramificazione assonale è ancora limitata basata su immagini 2D. Come descritto in Figura 4, ramificazione assonale potrebbe essere complicata dalla natura tortuoso rigenerazione dei nervi. Di conseguenza, i punti di ramificazione potrebbero essere oscurati da fibre nervose vicine a influire sulla precisione della quantificazione. L'analisi di imaging 3D del nostro protocollo prevede una migliore visualizzazione per i dettagli dei nervi ramificazione.
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Disclosures
Nessun conflitto di interesse a dichiarare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health sovvenzioni K08 NS061039-01A2, il Programma per Neurology Research & Discovery, e The A. Alfred Taubman Medical Research Institute presso l'Università del Michigan. Questo lavoro utilizza la Morfologia e Image Analysis Nucleo del Michigan Diabetes Research e centro di formazione, finanziato dal National Institutes of Health di Grant 5P90 DK-20572 presso l'Istituto Nazionale del Diabete e Malattie Digestive e Renali. Gli autori desiderano ringraziare Robinson Singleton e Gordon Smith (University of Utah) per la generosa donazione di campioni di pelle umana per sostenere lo sviluppo iniziale della tecnica immunoistochimica biomarcatore nocicettivo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X PBS | Fisher Scientific | BP399-4 | To make up 1X PBS |
| Image-IT FX Signal | Invitrogen | I36933 | Image-IT |
| Protein Gene Product 9.5 (Polyclonal rabbit) | AbD Serotec | 7863-0504 | PGP |
| Tropomyosin Related-Kinase A (Polyclonal goat) | R&D Systems | AF1056 | Trk A |
| Alexa Fluor 488 donkey α-rabbit | Invitrogen | A21206 | AF488 donkey α-goat |
| Alexa Fluor 647 donkey α-goat | Invitrogen | A21447 | AF647 donkey α-goat |
| Albumin, from Bovine Serum | Sigma-Aldrich | A7906-100 | BSA |
| Triton X- 100 | Sigma-Aldrich | T9284 | TX-100 |
| Non-calibrated Loop | LeLoop | MP 199025 | inoculating Loop |
| 96-well assay plate | Corning Incorporated | 3603 | Well plate |
| Prolong Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P36931 | DAPI |
| Microscope Cover Glass 22x22 mm | Fisher Scientific | 12-541-B | Coverslips |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | Microscope Slides |
| Olympus Fluoview Laser Scanning Confocal Microscope | Olympus | FV500 | Confocal Microscope |
| Optimum Cutting Temperature | Sakura | 4583 | OCT |
| Leica cryostat | Leica | CM1850 | Cryostat |
References
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