Summary
A fim de estudar as alterações de fibras nervosas intra-epidérmica nociceptivos (IENFs) em neuropatias dolorosas (PN), protocolos que nós desenvolvemos pode examinar directamente as alterações morfológicas observadas tridimensionais em IENFs nociceptivos. Análise tridimensional de IENFs tem o potencial de avaliar as alterações morfológicas de IENF na PN.
Abstract
Uma biópsia da pele é geralmente utilizado para quantificar intraepidérmicos densidades de fibras nervosas (IENFD) para o diagnóstico de 1,2 polineuropatia periférica. Actualmente, é prática comum para recolher três milímetros biópsias de pele a partir da perna distal (DL) e na coxa proximal (PT) para a avaliação de polineuropatias comprimento dependentes 3. No entanto, devido à natureza de IENFs multidireccional, é um desafio para examinar sobreposição estruturas nervosas através da análise de imagem bidimensional (2D). Alternativamente, tridimensional de imagem (3D) poderia fornecer a melhor solução para este dilema.
No relatório atual, apresentamos métodos para aplicar imagens em 3D para estudar neuropatia dolorosa (PN). A fim de identificar IENFs, amostras de pele são processadas para análise de imunofluorescência de produto do gene da proteína 9.5 (PGP), um marcador neuronal panela. Actualmente, é uma prática padrão para diagnosticar neuropatias fibra pequenos usando IENFD determinada por imuno-histoquímica PGP usando microscopia de campo claro 4. No presente estudo, aplicou-se análise de imunofluorescência dupla para identificar IENFD total, utilizando o PGP, e IENF nociceptiva, através da utilização de anticorpos que reconhecem a tropomiosina-receptor-quinase A (Trk A), o receptor de alta afinidade para o factor de crescimento do nervo 5. As vantagens do IENF co-coloração com PGP e Trk anticorpos se beneficia do estudo de PN através da coloração claramente fibras PGP-positivas, nociceptivos. Estes sinais de fluorescência pode ser quantificada para determinar as alterações morfológicas e IENFD nociceptivos do IENF associados PN. As imagens fluorescentes são obtidas por microscopia confocal e processadas para análise 3D. 3D-imaging fornece capacidades de rotação para analisar mais alterações morfológicas associadas à PN. Tomados em conjunto, co-coloração fluorescente, imagem confocal e análise 3D beneficiar claramente o estudo de PN.
Introduction
Actualmente, é prática comum para os médicos para quantificar intraepidérmicos densidades de fibras nervosas (IENFD) a partir de biópsias de punção da pele, que podem ser utilizados para diagnosticar neuropatias pequenas fibras 3, 6-8. As biópsias são tomadas a partir da perna distal (DL), de 10 cm acima do maléolo lateral, e a coxa proximal (PT), 20 cm abaixo da espinha ilíaca anterior 9. Todos IENF são rotulados usando o produto do gene da proteína 9.5 (PGP), um marcador neuronal pan 10-12. Actualmente, é uma prática padrão para diagnosticar neuropatias fibra pequenos usando IENFD determinada pela coloração PGP com brightfield microscopia 6. Além disso, vários grupos de pesquisa têm utilizaram protocolos de imunofluorescência para o PGP imunohistoquímica 7-9. Neuropatia fibra pequeno é comumente associado com dor neuropática. A fim de entender melhor o papel do IENF essencial para o processamento da dor, foi desenvolvida uma técnica para co-label IENF total, com fibras que geram dor. Nociceptiva IENF, especificamente Aδ e fibras C, pode ser estudada através da co-rotulagem de IENF com PGP e o marcador nociceptiva, tropomyosin-receptor-quinase A (Trk A) 5. Trk A é o receptor de elevada afinidade para o factor de crescimento do nervo, que é essencial para o desenvolvimento de nocicepção. As fibras nervosas nociceptivas A positivas Trk são fibras peptidérgicas que expressam a substância P (SP) e peptídeo relacionado com gene da calcitonina (CGRP). Anteriormente, Lauria e colegas aplicaram a técnica de dupla marcação para estudar PN, co-rotulagem IENF PGP positivo com um marcador nociceptivo 10. No nosso estudo anterior, foi demonstrado que IENF Trk A-positivos, mas não IENF Trk A-negativos, foram regulada positivamente num modelo animal de neuropatia diabética dolorosa 5. Esta técnica de co-rotulagem fornece a capacidade de comparar a quantificação de IENFD nociceptiva totalizar IENFD ea capacidade de estudar alterações morfológicas associadas à PN. A capacidade de visualizar nociceptiva IENF e compare quantificação de IENFD total IENFD nociceptiva poderia fornecer provas objectivas para a presença da dor, e possivelmente percepção da intensidade da dor associada com PN. Esta técnica é também aplicável para a pele de modelos animais. Em comparação com estudos anteriores, o protocolo actual descreve métodos para análise de imagem 3D, criando a possibilidade de evitar os erros que possam ocorrer na análise da imagem 2D.
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Protocol
Parte A: Imunohistoquímica
Preparação de placa de 96 poços e prevenção de fundo de coloração Dentre as biópsias da pele são recolhidos a partir de sujeitos humanos e incubados durante 12-24 h em solução de fixação (2% de paraformaldeído com uma solução de L-lisina 0,75 M (pH 7,4) e 0,05 mM de periodato de sódio) a 4 ° C como descrito anteriormente 8. As amostras são então cryoprotected em tampão fosfato salino (PBS) com 20% de glicerol, a 4 ° C durante até 1 semana, incorporado nos meios de fixação da temperatura de corte óptima (OCT), e depois seccionado em secções de 50 um de espessura sobre um criostato. O protocolo abaixo descrito é concebido para oito cortes de pele, o número máximo possível de secções de pele de sofrer imunohistoquímica de flutuação livre em uma placa de 96 poços.
DIA 1:
1. Prevenção da imunoreactividade não específica no estrato córneo
- Etiqueta de placa de 96 poços, como mostrado na Figura 1. Adicionar 150 ul de Imagem-IT FX sinal (Imagem-IT), eficaz para o bloqueio de fundo de coloração 11,12, para cada poço na linha 1 da placa de 96 poços.
- Adicionar 150 ul de PBS 1X para cada poço na fila 2 e 3 da placa de 96 poços.
- Adquirir duas seções 50 mM por paciente: uma seção da biópsia tomado em DL, uma seção da biópsia tomada na PT. Uma ansa de inoculação (LeLoop) é usado para transferir a partir de secções de uma lavagem para a seguinte para evitar danos morfológica. Gentilmente transferir cada seção 50 mM, utilizando um loop inoculação, em um indivíduo bem de Linha 1, que contém a imagem-IT. Incubar seções em Imagem-lo por 30 minutos em temperatura ambiente em uma cadeira de balanço plana.
- Lavar duas vezes com secções 1X PBS (linhas 2 e 3) durante 10 min à TA. Coloque em um prato bem roqueiro plana entre lavagens.
2. Preparação de BSA a 5% da solução de bloqueio e 1% de solução de lavagem
- Enquanto as seções de biópsia estão incubando em Imagem-IT, prepare-se 5% de bloqueio soluçãoção (BSA, TX-100, 0,3% de solução 0,1 M de PBS-BSA a vórtice até que se dissolva completamente 5%).
- Adicionar 150 ul de solução de bloqueio BSA a 5% em cada cavidade de linha 4.
- Utilizando uma ansa de inoculação, transferir secções em poços individuais de 5% de solução de bloqueio de BSA. Incubar as secções em solução de bloqueio de BSA 5% durante 1-2 horas à temperatura ambiente em um balancim plana.
3. Preparação de 1% de BSA e da solução de lavagem a diluição dos anticorpos primários
- Embora as secções são incubar em 5% de solução de bloqueio de BSA, preparar uma solução de lavagem 1% (BSA a 1%, 0,3% de TX-100, solução de PBS-Vortex 0,1 M até que se dissolva completamente BSA).
- Embora as secções são incubar em 5% de solução de bloqueio de BSA, dilui-se os anticorpos primários em 1% de solução de lavagem.
- Durante oito secções (8 x 150 mL = 1,200 mL) é necessário um total de 1200 ul. Os anticorpos primários são feitos em 1500 ul (cerca de 20% volume extra).
- As diluições dos anticorpos primários: PGP, 1:500; Trk A,1:500 em BSA a 1% solução de lavagem.
4. Incubação de biópsias seccionados em Anticorpo primário
- Adicionar 150 ul de anticorpos primários diluídos nas cavidades designadas da placa de 96 poços (linha 5).
- Transferir secções de 5% de solução de bloqueio (linha 4) para os poços de anticorpos primários designados (Linha 5).
- Selar a placa de 96 poços com parafilme e uma folha de alumínio para evitar a secagem e exposição à luz.
- Incubar a placa de 96 poços de O / N a 4 ° C em um balancim plana.
DIA 2:
5. Enxaguar biópsias em BSA a 1% solução de lavagem
- Adicionar 150 ul de solução de lavagem 1% de BSA para cada poço na linha 6, 7 e 8.
- Enxaguar secções três vezes com solução de lavagem 1% de BSA (linhas 6, 7 e 8), durante 1 hora de cada vez, à TA. Cobrir a placa bem com papel alumínio e coloque no balancim plana entre lavagens.
6. A diluição dos anticorpos secundários
<ol>- Durante oito secções (8 x 150 mL = 1,200 mL) é necessário um total de 1200 ul. Os anticorpos secundários são feitos em 1500 ul (cerca de 20% volume extra).
- Diluições dos anticorpos secundários: para PGP (Alexa Fluor 488 burro anti-coelho, 1:250), para Trk A (Alexa Fluor 647 burro anti-cabra, 1:250) em solução de lavagem 1% BSA.
7. Incubação de biópsias seccionados em Anticorpo secundário
- Adicionar 150 uL de anticorpos secundários diluídos nas suas cavidades designadas da placa de 96 poços (linha 9).
- Transferir secções de solução a 1% de BSA de bloqueio (Linha 8) no poço de anticorpo secundário (linha 9).
- Selar a placa de 96 poços com parafilme e uma folha de alumínio para evitar a secagem e exposição à luz.
- Incubar seções no designado secundário anticorpos O/ N a 4 ° C em um balancim plana.
8. Enxaguar biópsias em BSA a 1% solução de lavagem
- Adicionar 150 ul de solução de lavagem 1% de BSA para cada poço na linha 10, 11 e 12.
- Enxaguar secções três vezes com solução de lavagem 1% de BSA (linhas 10, 11 e 12) durante 1 hora de cada vez, à TA. Cobrir a placa bem com papel alumínio e coloque em uma cadeira de balanço plana entre lavagens.
9. Preparação de Lâminas de Microscopia e montagem Biopsias Seccionado
- Enquanto secções de biópsia estão incubando no último enxaguamento de solução de lavagem 1% de BSA (linha 12), preparam lâminas de microscópio.
- Coloque 50 ml de solução a 1% de lavagem BSA em um slide de cada vez.
- Remover secções de 1% de solução de lavagem de BSA (linha 12), e colocá-lo na gota 50 mL de solução de lavagem 1% de BSA na lâmina de microscópio designado. Após optimização da posição da secção, remover o excesso de solução de lavagem 1% de BSA com uma pipeta de vidro bulbed, tomando precauçõesevitar tocar o espécime.
NOTA: Certifique-secção não é dobrado, a amostra deve ser plana contra a superfície da lâmina de microscópio.
- Coloque uma gota de reagente Prolongar montagem com DAPI perto da biópsia na lâmina de microscópio antifade Ouro. Dê uma lamela de vidro mm microscópio 22x22 e colocá-lo suavemente sobre a biópsia e uma gota de reagente Prolongar antifade ouro com DAPI queda. Repita a operação para cada seção.
- Vamos lâminas de microscópio seca O / N em RT na escuridão.
NOTA: Remova as bolhas de ar usando uma ponteira. Limpe o excesso de prolongar reagente antifade Ouro.
Parte B: imagem confocal
10. Confocal
- Sinais de fluorescência de imagem usando uma Olympus FluoView 500 microscópio confocal de varredura a laser com óleo de imersão (1,3 NA) objetiva de 40X e zoom duas vezes com software versão 5.0 FluoView. Use Alexa Fluor 488 e Alexa Fluor 647 para excitar a 543 nm HeNe laser verde e 633 nm HeNe laser vermelho, respectivamente. O sinal Alexa Fluor 488 é representado por um olhar verde a tabela (LUT) e Alexa Fluor 647 por uma LUT vermelho.
- Definir as aberturas confocais para cada detector a 400 um para melhorar os sinais. Varreduras seqüenciais devem ser tomados com uma resolução de 1024 x 1024 para maximizar a separação do sinal.
- Capturar tridimensional z séries utilizando 1,2 mM intervalos z-passo (com base na unidade de digitalização óptima calculados pelo software FluoView) com média de Kalman (dois quadros).
Parte C: visualização tridimensional e animação
11. Tridimensional (3D) Visualização e Animação
- Abrir arquivos FluoView em software x64 Imaris (versão 7.3, Bitplane AG) para visualizar os conjuntos de imagens 3D.
- Ajustar o indicador conforme necessário para aumentar o contraste do sinal específico do nervo.
- Criar um surface para visualizar o limite dermo-epidérmica. Use a ferramenta Contorno no modo de desenho para desenhar o contorno.
- Atribuir uma superfície semi-transparente para o limite, a fim de ver os sinais fluorescentes subjacentes.
- Capturar imagens estáticas dos sinais fluorescentes em 3D para criar imagens instantâneo do filme em 3D.
- Use o recurso de animação para criar um filme em 3D. As imagens podem ser giradas em 360 graus várias vezes para mostrar cada sinal separadamente e intercalado (Figuras 2, 3 e 4). Definir animação para criar filmes que consistem em 200 quadros animaram a 15 quadros por segundo. Salve cada filme como um arquivo AVI cru.
- Comprimir o final do filme AVI com o software VirtualDub (versão 1.9.4).
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Representative Results
Foi aplicado o protocolo atual para estudar a morfologia do IENF na PT e DL biópsias de pele de pacientes com PN. A pele, a partir de três indivíduos, foi recolhido da Universidade de Utah, para demonstrar a Pathomorphology associado PN. Os temas incluem: Caso 1: um homem de 51 anos com uma história de PN de diabetes tipo 2 (duração: 14 meses; escore de dor: 51); Caso 2: um homem de 56 anos com uma história de PN de diabetes tipo 2 (duração: 108 meses; escore de dor: 47), e Caso 3: um homem de 66 anos de idade, com história de PN de diabetes tipo 2 (duração: 42 meses; escore de dor: 46). História e exame neurológico, incluindo o teste sensorial quantitativo e estudos de condução nervosa, foram realizados para avaliar neuropatia periférica. Os escores de dor foram determinados com base no 0-100 escala visual analógica de dor.
Usando este protocolo, somos capazes de estudar a estrutura 3D de IENFs na pele humana (Figura 2). Na Figura 2 (Figura 3). Imagem em 3D de inchaços axonais, apresentados na Figura 3, demonstram que estas estruturas globulares inchaços são distribuídos ao longo IENFs. Além disso, estes métodos podem ser usados para estudar a ramificação nas IENFs (Figura 4). Imagens 3D de ramificação apresentados na Figura 4 demonstram que as alterações morfológicas ocorrem com a presença de PN. Como anteriormente descrito, a fronteira dermo-epidérmica foi determinada com base na morfologia e na orientação dos nervos e da diferença de intensidade de pixel entre a derme e epiderme 8. O traçado azul, representado nas Figuras 2, 3 e 4, Indica a junção dermo-epidérmica.
Figura 1. Diagrama esquemático que representa a configuração de uma placa de 96 poços para biópsia da pele imuno-histoquímica.
Figura 2. Imagens tridimensionais (3D) de IENF. Representativas da imagem 3D de (A) IENF PGP-positivas, marcadas de verde, representando IENF totais (primeira rotação de 360 °) e (B) Trk IENF A positivo, etiquetado vermelho, representando IENF nociceptiva (segunda rotação de 360 °), e (C ) uma imagem mesclada demonstrando PGP positivo, IENF nociceptiva (terceira rotação de 360 °) em uma amostra de pele de caso 1. Bar = 20 mM. Clique aqui para ver filme.
Forma3. Tridimensional (3D) de inchaços axonais em IENF de PN. Representante imagem 3D de inchaços axonais (setas) ao longo IENFs, marcados por PGP com um sinal verde, e dentro do plexo subdérmico em uma amostra de pele do Caso 2. Bar = 10 mM. Clique aqui para ver filme.
Figura 4. Tridimensional (3D) de ramificação axonal em IENF de PN. Representante imagem 3D de ramificação axonal (setas) ao longo IENFs, rotulado por PGP com um sinal verde, em uma amostra de pele do Caso 3. Bar = 20 mM. Clique aqui para ver filme.
| Componentes de BSA a 5% de solução de bloqueio: | Quantidade necessária para 12,5 ml |
| PBS 1X | 8.125 ml |
| 0,1% de Triton X-100 (TX-100) [Concentração final: 0,03%] | 3,75 ml |
| Albumina de Soro Bovino (BSA) | 0,625 g |
| TOTAL | 12,5 ml |
Tabela 1. BSA a 5% da solução de bloqueio.
| Componentes de 1% Solução de lavagem: | Quantidade necessária para 12 ml |
| PBS 1X | 8.625 ml |
| 0,1% de TX-100 [Concentração final: 0,03%] | 3,25 ml |
| Albumina de Soro Bovino (BSA) | 0,125 g |
| TOTAL | 12 ml |
Tabela 2. BSA a 1% da solução de bloqueio.
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Discussion
Medição da IENFD tem sido amplamente utilizada para determinar o grau de neuropatias periféricas 13,14. Actualmente, o protocolo mais comumente utilizado apenas mede a densidade de fibras nervosas que penetram na membrana basal da epiderme, e não toma em consideração a ramificação axonal e / ou alterações morfológicas dos nervos. Além disso, a análise IENFD actual não foi mostrado para correlacionar IENFD com a presença de dor no PN 15.
Nós relatamos anteriormente que o aumento do número de IENFD nociceptiva estão associados com comportamentos de dor em camundongos db / db, um modelo do rato de diabetes tipo 2 5. Nesse relatório, aplicada pela primeira vez um protocolo de imunofluorescência dupla para estudar IENF nociceptiva. No estudo atual, nós expandimos nosso protocolo para a pele humana de pacientes com PN. A análise de imunofluorescência dupla fornece medições de ambos IENF total e IENF nociceptiva, o subconjunto de IENFs que medeiamdor. Estes IENF nociceptiva são em sua maioria positivos para Trk A e outros neuropeptídeos nociceptivos 5. Semelhante análise de imunofluorescência dupla para neuropatias dolorosas foi descrito por Lauria e colegas 10. Eles relataram redução IENFD para receptor potencial transitório cação canal membro da subfamília V 1 (TRPV1) em pacientes com neuropatias dolorosas. O actual protocolo poderia proporcionar uma abordagem alternativa para a medição do IENFD nociceptiva com base nos nossos dados de animais 5.
O protocolo atual oferece uma abordagem 3D para estudar a estrutura IENF. Em combinação com a análise immunofluorecent dupla, o protocolo atual fornece métodos para analisar a morfologia dos IENFs nociceptivos. Estudos anteriores não têm relatado uma associação entre as densidades ou ramificação do IENF nociceptiva com PN. Aqui, demonstramos um protocolo para o estudo de ramificação axonal e inchaço na IENFs da pele humana. A análise sugere que isto 3D método poderia ser usado para estudar as alterações morfológicas em IENF PN. Além disso, as imagens 3D poderia melhorar os protocolos actuais de medição IENFD evitando erros que estão associados com a redução de visualização da sobreposição das estruturas associadas com o 2D-imagiologia.
Tumefacção axonal é definida como uma ampliação de uma porção axonal com um diâmetro maior do que duas vezes maior do que o calibre axonal 16 original. Esta estrutura contém fragmentos de componentes do citoesqueleto e transporte axonal axonal. Inchaço axonal é considerado uma característica precoce de neuropatia axonal 6,16,17. No entanto, a análise das estruturas 3D inchaço axonal não foi relatada na literatura. Como representado na Figura 3, a imagem 3D pode fornecer informações importantes para a expansão axonal associada com PN.
É bem caracterizado que axonal ramificação acompanha a recuperação da lesão do nervo 18. No entanto, ometodologia para quantificar axonal ramificação ainda é limitado com base em imagens 2D. Conforme descrito na Figura 4, axonal ramificação pode ser complicada pela natureza tortuosa regeneração dos nervos. Por conseguinte, os pontos de ramificação pode ser obscurecida por fibras nervosas próximas a afectar a precisão da quantificação. A análise de imagens em 3D do nosso protocolo proporciona uma melhor visualização para obter detalhes sobre os nervos que se ramificam.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse a declarar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Grants Saúde K08 NS061039-01A2, o Programa de Neurologia Research & Discovery e The Taubman Alfred A. Instituto de Pesquisa de Medicina da Universidade de Michigan. Este trabalho utilizou a Morfologia e Análise de Imagem Núcleo de Michigan Diabetes Centro de Pesquisa e Formação, financiado pelo National Institutes of Health Grant 5P90 DK-20572 do Instituto Nacional de Diabetes e Doenças Digestivas e Renais. Os autores gostariam de agradecer a Robinson Singleton e Gordon Smith (University of Utah) pela sua generosa doação de amostras de pele humana para apoiar o desenvolvimento inicial da técnica de imuno-histoquímica biomarcador nociceptiva.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X PBS | Fisher Scientific | BP399-4 | To make up 1X PBS |
| Image-IT FX Signal | Invitrogen | I36933 | Image-IT |
| Protein Gene Product 9.5 (Polyclonal rabbit) | AbD Serotec | 7863-0504 | PGP |
| Tropomyosin Related-Kinase A (Polyclonal goat) | R&D Systems | AF1056 | Trk A |
| Alexa Fluor 488 donkey α-rabbit | Invitrogen | A21206 | AF488 donkey α-goat |
| Alexa Fluor 647 donkey α-goat | Invitrogen | A21447 | AF647 donkey α-goat |
| Albumin, from Bovine Serum | Sigma-Aldrich | A7906-100 | BSA |
| Triton X- 100 | Sigma-Aldrich | T9284 | TX-100 |
| Non-calibrated Loop | LeLoop | MP 199025 | inoculating Loop |
| 96-well assay plate | Corning Incorporated | 3603 | Well plate |
| Prolong Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P36931 | DAPI |
| Microscope Cover Glass 22x22 mm | Fisher Scientific | 12-541-B | Coverslips |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | Microscope Slides |
| Olympus Fluoview Laser Scanning Confocal Microscope | Olympus | FV500 | Confocal Microscope |
| Optimum Cutting Temperature | Sakura | 4583 | OCT |
| Leica cryostat | Leica | CM1850 | Cryostat |
References
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