Summary
För att studera de förändringar av nociceptiva intraepidermal nervfibrer (IENFs) i smärtsamma neuropatier (PN), utvecklade vi protokoll som direkt skulle kunna undersöka tredimensionella morfologiska förändringar som observerats i nociceptiva IENFs. Tredimensionell analys av IENFs har potential att utvärdera de morfologiska förändringarna av IENF i PN.
Abstract
En stansbiopsi av huden används ofta för att kvantifiera intraepidermal densiteter nervfiber (IENFD) för diagnos av perifer polyneuropati 1,2. För närvarande är det vanligt att samla in 3 biopsier mm hud från den distala benet (DL) och den proximala låret (PT) för utvärdering av längd-beroende polyneuropatier 3. Men på grund av den månginriktat natur IENFs, är det svårt att undersöka överlappande nervstrukturer genom analys av tvådimensionella (2D) avbildning. Alternativt kunde tredimensionella (3D) avbildning ge en bättre lösning på detta dilemma.
I den aktuella rapporten presenterar vi metoder för att tillämpa 3D-avbildning för att studera smärtsam neuropati (PN). För att identifiera IENFs är hudprover behandlas för immunofluorescerande analys av protein-genprodukten 9,5 (PGP), en pan neuronal markör. I dagsläget är det praxis att diagnostisera små fibrer neuropati använder IENFD avskräckabryts av PGP immunohistokemi med brightfield mikroskopi 4. I den aktuella studien, tillämpade vi dubbel immunofluorescens analys för att identifiera total IENFD, använder PGP, och nociceptiv IENF, genom användning av antikroppar som känner igen tropomyosin-receptor-kinas A (Trk A), högaffinitetsreceptorn för nervtillväxtfaktor 5. Fördelarna med co-färgning IENF med PGP och Trk A antikroppar gynnar studie av PN genom att tydligt färgning PGP-positiva, nociceptiva fibrer. Dessa fluorescerande signaler kan kvantifieras för att bestämma nociceptiva IENFD och morfologiska förändringar i IENF förknippas med PN. De fluorescerande bilder förvärvas genom konfokalmikroskopi och bearbetas för 3D-analys. 3D-bildbehandling ger roterande förmåga att ytterligare analysera morfologiska förändringar i samband med PN. Sammantaget fluorescerande co-färgning, konfokal avbildning och 3D analys drar bevisligen studiet av PN.
Introduction
För närvarande är det vanligt att läkare att kvantifiera intraepidermal densiteter nervfibrer, (IENFD) från huden stansbiopsier, som kan användas för att diagnostisera små fibrer neuropati 3, 6-8. Biopsier tas från den distala benet (DL), 10 cm ovanför laterala fotknölen, och den proximala låret (PT), 20 cm under främre iliaca ryggraden 9. Alla IENF är märkta med proteingenprodukt 9,5 (PGP), en pan neuronal markör 10-12. I dagsläget är det praxis att diagnostisera små fibrer neuropati använder IENFD bestäms av PGP färgning med brightfield mikroskopi 6. Dessutom har flera forskargrupper använde immunofluorescerande protokoll för PGP immunohistokemi 7-9. Små fibrer neuropati är ofta förknippad med neuropatisk smärta. För att ytterligare förstå rollen av IENF viktigt för smärta bearbetning, utvecklade vi en teknik för att co-label total IENF med fibrer som genererar smärta. Nociceptiv IENF, särskilt Aδ och C-fibrer, kan studeras genom co-märkning av IENF med PGP och nociceptiv markör, tropomyosin-receptor-kinas A (Trk A) 5. Trk A är den högaffinitetsreceptor för nervtillväxtfaktor som är väsentlig för utvecklingen av nociception. TRK A-positiva nociceptiva nervfibrer är peptiderga fibrer som uttrycker substans P (SP) och kalcitoningenrelaterad peptid (CGRP). Tidigare gällde Lauria och kollegor dubbel-märkning teknik för att studera PN, co-märkning PGP-positiv IENF med en nociceptiv markör 10. I vår tidigare studie visade vi att Trk A-positiv IENF, men inte Trk A-negativ IENF var uppreglerad vid en djurmodell av smärtsam diabetesneuropati 5. Detta samarbete märkning teknik ger möjlighet att jämföra kvantifiering av nociceptiv IENFD till total IENFD och förmågan att studera morfologiska förändringar i samband med PN. Förmågan att visualisera nociceptiv IENF och bolagenre kvantifiering av total IENFD till nociceptiv IENFD kunde ge objektiva belägg för förekomst av smärta, och möjligen inblick i svårighetsgraden av smärta i samband med PN. Denna teknik är också tillämplig på hud av djurmodeller. I jämförelse med tidigare studier, beskriver det nuvarande protokollet metoder för 3D bildanalys, skapar möjlighet att undvika fel som kan uppstå i 2D bildanalys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Del A: Immunohistochemistry
Framställning av 96-brunnars platta och förebyggande av Punch bakgrundsfärgning hudbiopsier samlas från människa och inkuberades under 12-24 h i fixeringslösningen (2% paraformaldehyd med 0,75 M L-lysin-lösning (pH 7,4) och 0,05 mM natriumperjodat) vid 4 ° C såsom beskrivits tidigare 8. Prover sedan cryoprotected i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) med 20% glycerol vid 4 ° C i upp till 1 vecka, inbäddade i montering media optimal kapning temperatur (OCT), sedan uppställd i 50 ìm tjocka sektioner på en kryostat. Protokollet som beskrivs nedan är avsedd för åtta hud sektioner, det maximala antalet hud sektioner möjligt att genomgå fritt flytande immunhistokemi i en 96-brunnars platta.
DAG 1:
Ett. Förebyggande av Ospecifik Immunoreaktivitet i stratum corneum
- Label 96-brunnar såsom visas i figur 1. Tillsätt 150 ul Bild-IT FX Signal (Bild-IT), effektiv för blockering bakgrundsfärgningen 11,12, i varje brunn i rad 1 i 96-brunnar.
- Tillsätt 150 ul av 1X PBS i varje brunn i rad 2 och 3 i 96-brunnar.
- Skaffa två 50 ìm sektioner per patient: en sektion från biopsi tas på DL, ett avsnitt från biopsi tas på PT. En inokulering loop (LeLoop) används för att överföra delar från en sköljning till nästa för att undvika morfologiska skador. Försiktigt överföra vardera 50 um avsnitt, med en ympning slinga, i en individ väl av Rad 1, innehållande Image-IT. Inkubera avsnitt i Image-IT för 30 min vid RT på en plan rocker.
- Skölj sektioner två gånger med 1X PBS (rader 2 och 3) under 10 min vid rumstemperatur. Placera brunnar på en plan rocker mellan sköljningar.
2. Framställning av 5% BSA blockeringslösning och en% sköljningslösning
- Medan biopsi sektioner inkubation i Image-IT, förbereda 5% blockerande lösningenning (5% BSA, 0,3% TX-100, 0,1 M PBS-Vortex lösningen tills BSA helt löst).
- Tillsätt 150 | il 5% BSA blockerande lösningen i varje brunn i rad 4.
- Använda en ympa loop, överföra delar i enskilda brunnar i 5% BSA blockerande lösningen. Inkubera avsnitt i 5% BSA blockerande lösningen under 1-2 timmar vid RT på en plan rocker.
Tre. Framställning av 1% BSA sköljlösning och Spädning av primära antikroppar
- Medan sektionerna inkubera i 5% BSA blockerande lösningen, bereda 1% sköljningslösning (1% BSA, 0,3% TX-100, 0,1 M PBS-Vortex lösningen tills BSA helt löst).
- Medan sektionerna är inkubering i 5% BSA blockerande lösningen, utspädd primära antikroppar i 1% sköljlösning.
- För åtta sektioner (8 x 150 ^ = 1,200 l) sammanlagt 1.200 il behövs. De primära antikroppar görs upp i 1500 ^ il (ca 20% extra volym).
- Utspädningar av de primära antikropparna: PGP, 1:500, Trk A,1:500 i 1% BSA sköljlösning.
4. Inkubation av snittade Biopsier i primär antikropp
- Tillsätt 150 | il av utspädda primära antikroppar i de utsedda brunnarna i 96-brunnar (Rad 5).
- Överför sektioner från 5% blockerande lösningen (Rad 4) till de utsedda primära antikroppar brunnar (rad 5).
- Täta 96-brunnar med parafilm och aluminiumfolie för att undvika uttorkning och ljusexponering.
- Inkubera 96-brunnar O / N vid 4 ° C på en plan rocker.
DAG 2:
Fem. Skölj Biopsier i 1% BSA sköljningslösning
- Tillsätt 150 | il av 1% BSA sköljlösning i varje brunn i rad 6, 7, och 8.
- Skölj sektioner tre gånger med 1% BSA sköljlösning (rader 6, 7 och 8) under 1 timme varje gång vid RT. Täck brunnar med aluminiumfolie och placera på platt rocker mellan sköljningar.
6. Spädning av Sekundära antikroppar
<ol>- För åtta sektioner (8 x 150 ^ = 1,200 l) sammanlagt 1.200 il behövs. De sekundära antikroppar görs upp i 1500 il (ca 20% extra volym).
- Spädningar av de sekundära antikropparna: för PGP (Alexa Fluor 488 åsna anti-kanin, 1:250), för Trk A (Alexa Fluor 647 åsna anti-get, 1:250) i 1% BSA sköljningslösning.
7. Inkubation av snittade Biopsier i sekundär antikropp
- Tillsätt 150 | il av utspädda sekundära antikroppar i sina utsedda brunnarna i 96-brunnar (Rad 9).
- Överför sektioner från 1% BSA blockerande lösningen (Rad 8) till sekundär antikropp väl (rad 9).
- Täta 96-brunnar med parafilm och aluminiumfolie för att undvika uttorkning och ljusexponering.
- Inkubera avsnitt i den utsedda sekundära antikroppar O/ N vid 4 ° C på en plan rocker.
8. Skölj Biopsier i 1% BSA sköljningslösning
- Tillsätt 150 | il av 1% BSA sköljlösning i varje brunn i rad 10, 11, och 12.
- Skölj sektioner tre gånger med 1% BSA sköljlösning (Rader 10, 11 och 12) under 1 timme varje gång vid RT. Täck brunnar med aluminiumfolie och placera på en flat rocker mellan sköljningar.
9. Framställning av objektglas och Montering sektioneras biopsier
- Medan biopsi sektioner inkubation i sista sköljningen av 1% BSA sköljningslösning (Rad 12), förbereda objektglas.
- Placera 50 | il av 1% BSA sköljlösning på en bild i taget.
- Ta bort sektioner från en% BSA sköljlösning (Rad 12), och placera den i 50 | il droppe av 1% BSA sköljlösning på avsedd objektglas. Efter att optimera placeringen av avsnittet, avlägsna överskott 1% BSA sköljningslösning med en lökformad glas pipett, vidta försiktighetsåtgärderatt undvika att röra provet.
OBS: Se avsnitt inte viks över, provet ska ligga platt mot ytan på objektglas.
- Placera en droppe av Förläng Gold antifade montering reagens med DAPI nära biopsi på mikroskop-objektglaset. Ta en 22x22 mm täckglas mikroskop glas och försiktigt placera den över biopsi och en droppe av Förläng Guld antifade reagens med DAPI droppe. Upprepa för varje avsnitt.
- Låt mikroskopobjektglas torr O / N vid RT i mörker.
OBS: Ta bort eventuella luftbubblor med hjälp av en pipett spets. Torka bort överflödigt Förläng reagens Gold antifade.
Del B: Confocal avbildning
10. Confocal Imaging
- Bild fluorescenssignalerna använder en Olympus FluoView 500 laserskanning konfokalmikroskop med 40X oljeimmersionsobjektiv (1,3 NA) objektiv och zooma två gånger med FluoView version 5.0 programvara. Använd Alexa Fluor 488 och Alexa Fluor 647 att excitera 543-nm HeNe grön laser och 633-nm HeNe Röd laser, respektive. Alexa Fluor 488 signalen representeras av en grön look up table (LUT) och Alexa Fluor 647 med en röd LUT.
- Ställ in konfokala öppningar för varje detektor vid 400 um för att förbättra signaler. Sekventiell skanningar bör tas med en upplösning på 1024 x 1024 för att maximera signal separation.
- Fånga tredimensionella Z-serien med 1,2 um z-steg intervaller (baserat på den optimala skannerenheten beräknas av FluoView mjukvara) med Kalman genomsnitt (två ramar).
Del C: Tredimensionell visualisering och animering
11. Tredimensionell (3D) visualisering och animering
- Öppna Fluoview filer i Imaris x64 mjukvara (version 7.3, Bitplane AG) för att visualisera 3D-bilden uppsättningar.
- Justera visas som behövs för att förbättra kontrasten av nerven specifik signal.
- Skapa en surface att visualisera dermal-epidermal gränsen. Använd Contour verktyget i oavgjort läge att dra gränsen.
- Tilldela en halvtransparent yta till gränsen för att se de bakomliggande fluorescerande signaler.
- Fånga stillbilder i 3D fluorescerande signaler för att skapa Stillbilder i 3D-film.
- Använd Animation funktion för att skapa en 3D-film. Bilderna kan roteras 360 grader flera gånger för att visa varje signal för sig och sammanslagna (figurerna 2, 3 och 4). Ställ animering för att skapa filmer som består av 200 bildrutor animerade med 15 bilder per sekund. Spara varje film som en rå AVI-fil.
- Komprimera den slutliga AVI film med VirtualDub programvara (version 1.9.4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi tillämpade det nuvarande protokollet för att studera morfologi IENF i PT och DL hudbiopsier från patienter med PN. Huden, från tre individer, samlades vid University of Utah för att demonstrera pathomorphology förknippas med PN. Ämnena är: Mål 1: a 51-årig man med en historia av PN av typ 2-diabetes (varaktighet: 14 månader, smärtan: 51), mål 2: a 56-årig man med en historia av PN av typ 2-diabetes (längd: 108 månader, smärtan: 47), och i mål 3: a 66-årig man med en historia av PN av typ 2-diabetes (varaktighet: 42 månader, smärtan: 46). Neurologisk historia och examination, inklusive kvantitativ sensorisk testning och nerv studier överledningsrubbningar, utfördes för att bedöma perifer neuropati. Upplevd smärta har fastställts baserat på 0-100 visuell analog smärtskala.
Användning av detta protokoll, kan vi studera 3D-strukturen för IENFs i human hud (Figur 2). I figur 2 (Figur 3). 3D-avbildning av axonal svullnad, som presenteras i Figur 3, visar att dessa svullnader är klotformiga strukturer fördelade längs IENFs. Dessutom kan dessa metoder användas för att studera förgrening i IENFs (Figur 4). 3D-bilder av förgrening som presenteras i figur 4 visar att morfologiska förändringar äga rum med närvaron av PN. Såsom tidigare beskrivits, var den dermala-epidermala gränsen bestäms baserat på morfologi och orientering av nerver och pixelintensiteten skillnaden mellan dermis och epidermis 8. Den blå spårning, avbildas i figurerna 2, 3, och 4, Indikerar dermal-epidermal korsning.
Figur 1. Schematiskt diagram som representerar konfiguration för en 96-brunnar för hudbiopsi immunohistokemi.
Figur 2. Tredimensionella (3D) bilder av IENF. Representant 3D-bild av (A) PGP-positiv IENF, märkt grönt, representerande totalt IENF (första 360 ° rotation) och (B) Trk A-positiv IENF, märkt rött, representerar nociceptiv IENF (andra 360 ° rotation), och (C ) ett sammanslagna bilden visar PGP-positiv, nociceptiv IENF (tredje 360 ° rotation) i en hud prov från mål 1. Bar = 20 pm. Klicka här för att se filmen.
FigurTre. Tredimensionell (3D) bild av axonal svullnader i IENF av PN. Representant 3D-bild av axonal svullnader (pilspetsar) längs IENFs, märkta av PGP med en grön signal, och inom subdermala plexus i en hud prov från mål 2. Bar = 10 mikrometer. Klicka här för att se filmen.
Figur 4. Tredimensionell (3D) bild av axonal förgrening i IENF av PN. Representant 3D-bild av axonal förgrening (pilspetsar) längs IENFs, märkt av PGP med en grön signal, i en hud prov från mål 3. Bar = 20 pm. Klicka här för att se filmen.
| Komponenter i 5% BSA blockeringslösning: | Belopp som behövs för 12,5 ml |
| 1X PBS | 8.125 ml |
| 0,1% Triton X-100 (TX-100) [Slutlig koncentration: 0,03%] | 3,75 ml |
| Bovint serumalbumin (BSA) | 0,625 g |
| TOTAL | 12,5 ml |
Tabell 1. 5% BSA blockeringslösning.
| Komponenter i 1% Sköljning Lösning: | Belopp som behövs för 12 ml |
| 1X PBS | 8.625 ml |
| 0,1% TX-100 [Slutlig koncentration: 0.03%] | 3,25 ml |
| Bovint serumalbumin (BSA) | 0,125 g |
| TOTAL | 12 ml |
Tabell 2. 1% BSA blockeringslösning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mätning av IENFD har i stor utsträckning använts för att fastställa graden av perifera neuropatier 13,14. För närvarande mäter den vanligaste protokoll som endast tätheter av nervfibrer som penetrerar basalmembranet av överhuden, det tar inte hänsyn till axonal förgrening och / eller morfologiska förändringar i nerver. Dessutom har nuvarande IENFD analysen inte visats korrelera IENFD med förekomsten av smärta i PN 15.
Vi har tidigare rapporterat att ett ökande antal nociceptiv IENFD är förknippade med smärta beteenden i db / db-möss, en musmodell för typ 2-diabetes 5. I denna rapport, tillämpade vi först en dubbel immunofluorescens protokoll för att studera nociceptiv IENF. I den aktuella studien, utökar vi våra protokoll för mänsklig hud från patienter med PN. Den dubbla immunofluorescens analys ger mätningar av både total IENF och nociceptiv IENF, den delmängd av IENFs som förmedlarsmärta. Dessa nociceptiv IENF är mestadels positiva för Trk A och andra nociceptiva neuropeptider 5. Liknande dubbel immunofluorescens analys för smärtsamma neuropatier har beskrivits av Lauria och kollegor 10. De rapporterade minskad IENFD för transient receptor potential katjonkanal underfamiljen V medlem 1 (TRPV1) hos patienter med smärtsamma neuropatier. Den nuvarande protokollet kan ge en alternativ metod för mätning av nociceptiv IENFD utifrån våra djurdata 5.
Det nuvarande protokollet erbjuder en 3D-metod för att studera IENF struktur. I kombination med dubbla immunofluorecent analys, ger det nuvarande protokollet metoder för att undersöka morfologi nociceptiva IENFs. Tidigare studier har inte rapporterat ett samband mellan densitet eller förgrening av nociceptiv IENF med PN. Här visar vi ett protokoll för att studera axonal förgrening och svullnad i IENFs av mänsklig hud. Vår 3D-analys tyder på att detta metod skulle kunna användas för att studera de morfologiska förändringarna av IENF i PN. Dessutom kan 3D-avbildning förbättra de nuvarande protokollen för IENFD mätning genom att undvika fel som är associerade med reducerad visualisering av överlappande strukturer i samband med 2D-bildåtergivning.
Axonal svullnad definieras som en förstoring av en axonal parti med en diameter som är större än två gånger den för den ursprungliga axonal kaliber 16. Denna struktur innehåller fragment av axonal cytoskeletonen och komponenter av axonal transport. Axonal svullnad anses vara en tidig del av axonal neuropati 6,16,17. Däremot har 3D-analys av axonal svullnad strukturer inte rapporterats i litteraturen. Som visas i figur 3, kan 3D-avbildning ge viktig insikt för axonal svullnad förknippas med PN.
Det är väl karakteriserad att axonal förgrening medföljer återhämtningen från nervskada 18. Emellertid dentillgängliga metoder för att kvantifiera axonal förgrening fortfarande är begränsad utifrån 2D-bildåtergivning. Såsom beskrivs i figur 4, kunde axonal förgrening vara komplicerat genom den slingrande karaktär regenererande nerver. Följaktligen kunde de förgreningspunkter skymmas av närliggande nervtrådar att påverka noggrannheten hos kvantifiering. Den 3D bildanalys av våra protokoll ger förbättrad visualisering för information om de förgrenade nerver.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter att deklarera.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Institutes of Health bidrag K08 NS061039-01A2, Programmet för Neurology Research & Discovery, och A. Alfred Taubman Medical Research Institute vid University of Michigan. Detta arbete använde morfologi och bildanalys Kärna av Michigan Diabetes Research and Training Center, som finansieras av National Institutes of Health Grant 5P90 DK-20572 från National Institute of Diabetes and Digestive och njursjukdomar. Författarna vill tacka Robinson Singleton och Gordon Smith (University of Utah) för deras generösa donation av mänsklig hud prover för att stödja den inledande utvecklingen av nociceptiv biomarkör immunohistokemi teknik.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X PBS | Fisher Scientific | BP399-4 | To make up 1X PBS |
| Image-IT FX Signal | Invitrogen | I36933 | Image-IT |
| Protein Gene Product 9.5 (Polyclonal rabbit) | AbD Serotec | 7863-0504 | PGP |
| Tropomyosin Related-Kinase A (Polyclonal goat) | R&D Systems | AF1056 | Trk A |
| Alexa Fluor 488 donkey α-rabbit | Invitrogen | A21206 | AF488 donkey α-goat |
| Alexa Fluor 647 donkey α-goat | Invitrogen | A21447 | AF647 donkey α-goat |
| Albumin, from Bovine Serum | Sigma-Aldrich | A7906-100 | BSA |
| Triton X- 100 | Sigma-Aldrich | T9284 | TX-100 |
| Non-calibrated Loop | LeLoop | MP 199025 | inoculating Loop |
| 96-well assay plate | Corning Incorporated | 3603 | Well plate |
| Prolong Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P36931 | DAPI |
| Microscope Cover Glass 22x22 mm | Fisher Scientific | 12-541-B | Coverslips |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | Microscope Slides |
| Olympus Fluoview Laser Scanning Confocal Microscope | Olympus | FV500 | Confocal Microscope |
| Optimum Cutting Temperature | Sakura | 4583 | OCT |
| Leica cryostat | Leica | CM1850 | Cryostat |
References
- Lauria, G., Holland, N., et al. Epidermal innervation: changes with aging, topographic location, and in sensory neuropathy. J. Neurol. Sci. 164 (2), 172-178 (1999).
- Sullivan, K. A., Hayes, J. M., et al.
- McArthur, J. C., Stocks, E. A., Hauer, P., Cornblath, D. R., Griffin, J. W. Epidermal nerve fiber density: normative reference range and diagnostic efficiency. Arch. Neurol. 55 (12), 1513-1520 (1998).
- Griffin, J. W., McArthur, J. C., Polydefkis, M. Assessment of cutaneous innervation by skin biopsies. Curr. Opin. Neurol. 14 (5), 655-659 (2001).
- Cheng, H. T., Dauch, J. R., Hayes, J. M., Yanik, B. M., Feldman, E. L. Nerve growth factor/p38 signaling increases intraepidermal nerve fiber densities in painful neuropathy of type 2 diabetes. Neurobiol. Dis. 45 (1), 280-287 (2012).
- Lauria, G., Lombardi, R., Camozzi, F., Devigili, G. Skin biopsy for the diagnosis of peripheral neuropathy. Histopathology. 54 (3), 273-285 (2009).
- Vlckova-Moravcova, E., Bednarik, J., Dusek, L., Toyka, K. V., Sommer, C. Diagnostic validity of epidermal nerve fiber densities in painful sensory neuropathies. Muscle Nerve. 37 (1), 50-60 (2008).
- Casanova-Molla, J., Morales, M., et al. Axonal fluorescence quantitation provides a new approach to assess cutaneous innervation. J. Neurosci. Methods. 200 (2), 190-198 (2011).
- Wang, L., Hilliges, M., Jernberg, T., Wiegleb-Edstrom, D., Johansson, O. Protein gene product 9.5-immunoreactive nerve fibres and cells in human skin. Cell Tissue Res. 261 (1), 25-33 (1990).
- Lauria, G., Morbin, M., et al. Expression of capsaicin receptor immunoreactivity in human peripheral nervous system and in painful neuropathies. J. Peripher. Nerv. Syst. 11 (3), 262-271 (2006).
- Penna, G., Fibbi, B., et al. Human benign prostatic hyperplasia stromal cells as inducers and targets of chronic immuno-mediated inflammation. J. Immunol. 182 (7), 4056-4064 (2009).
- Lentz, S. I., Edwards, J. L., et al. Mitochondrial DNA (mtDNA) Biogenesis: Visualization and Duel Incorporation of BrdU and EdU Into Newly Synthesized mtDNA In Vitro. J. Histochem. Cytochem. 58 (2), 207-218 (2010).
- Polydefkis, M., Hauer, P., Griffin, J. W., McArthur, J. C. Skin biopsy as a tool to assess distal small fiber innervation in diabetic neuropathy. Diabetes Technol. Ther. 3 (1), 23-28 (2001).
- Lauria, G.
- Sorensen, L., Molyneaux, L., Yue, D. K. The relationship among pain, sensory loss, and small nerve fibers in diabetes. Diabetes Care. 29 (4), 883-887 (2006).
- Lauria, G., Morbin, M., et al. Axonal swellings predict the degeneration of epidermal nerve fibers in painful neuropathies. Neurology. 61 (5), 631-636 (2003).
- Herrmann, D. N., McDermott, M. P., et al. Epidermal nerve fiber density, axonal swellings and QST as predictors of HIV distal sensory neuropathy. Muscle Nerve. 29 (3), 420-427 (2004).
- Navarro, X. Chapter 27: Neural plasticity after nerve injury and regeneration. Int. Rev. Neurobiol. 87, 483-505 (2009).
