Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

הדמיה תלת ממדית של סיבי עצב Intraepidermal nociceptive בביופסיות עור אדם

Published: April 29, 2013 doi: 10.3791/50331
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1
1Department of Neurology, University of Michigan, 2Department of Internal Medicine, University of Michigan

Summary

על מנת ללמוד את השינויים של סיבי עצב intraepidermal nociceptive (IENFs) בneuropathies כואב (PN), פיתחנו פרוטוקולים שיכולים ישירות לבחון שינויים מורפולוגיים תלת ממדיים שנצפו בIENFs nociceptive. ניתוח תלת ממדי של IENFs יש את הפוטנציאל כדי להעריך את השינויים מורפולוגיים של IENF בPN.

Abstract

ביופסיה של העור משמשת בדרך כלל כדי לכמת את צפיפות סיבי עצב intraepidermal (IENFD) לאבחון של 1,2 פולינאורופתיה ההיקפי. נכון לעכשיו, הוא מנהג נפוץ כדי לאסוף 3 מ"מ ביופסיות עור מהרגל דיסטלי (DL) והירך הפרוקסימלי (PT) להערכת polyneuropathies אורך תלויה 3. עם זאת, בשל אופי multidirectional של IENFs, זה מאתגר לבחון חופף מבנים עצביים דרך הניתוח של הדמיה דו ממדית (2D). לחלופין, הדמיה תלת ממדית (3D) יכולה לספק פתרון טוב יותר לדילמה זו.

בדו"ח הנוכחי, אנו מציגים שיטות ליישום 3D הדמיה ללמוד נוירופתיה הכואבת (PN). על מנת לזהות IENFs, דגימות עור מעובדות לניתוח immunofluorescent של מוצר חלבון גן 9.5 (PGP), סמן עצבי מחבת. נכון לעכשיו, הוא מנהג סטנדרטי לאבחון neuropathies סיבים הקטנים באמצעות IENFD להרתיענכרה על ידי אימונוהיסטוכימיה PGP באמצעות מיקרוסקופיה brightfield 4. במחקר הנוכחי, אנחנו מוחלים ניתוח כפול immunofluorescent לזהות IENFD הכולל, באמצעות PGP, וIENF nociceptive, באמצעות השימוש בנוגדנים המזהים tropomyosin קולט-קינאז, זיקה גבוהה לקולטן (TRK) לגורם גדילה עצבי 5. היתרונות של IENF שיתוף מכתים עם PGP וTRK A נוגדני יתרונות המחקר של PN ידי בבירור מכתים סיבי PGP חיוביים, nociceptive. ניתן לכמת אותות ניאון אלה כדי לקבוע שינויי IENFD ומורפולוגי nociceptive של IENF קשורים PN. את תמונות הניאון נרכשות על ידי מיקרוסקופיה confocal ומעובד לניתוח 3D. 3D הדמיה מספקת יכולות סיבוב נוסף כדי לנתח שינויים מורפולוגיים הקשורים PN. יחדיו, ניאון שיתוף מכתים, ההדמיה confocal, וניתוח 3D באופן ברור לטובת המחקר של PN.

Introduction

נכון לעכשיו, הוא מנהג נפוץ עבור רופאים לכמת צפיפות סיבי עצב intraepidermal, (IENFD) מביופסיות אגרוף עור, שניתן להשתמש בם כדי לאבחן neuropathies קטן סיבים 3, 6-8. ביופסיות שנלקחו מהרגל דיסטלי (DL), 10 ס"מ מעל malleolus לרוחב, וירך הפרוקסימלי (PT), 20 ס"מ מתחת לעמוד השדרה הכסל הקדמי 9. כל IENF מסומנים באמצעות מוצר גן חלבון 9.5 (PGP), סמן 10-12 מחבת עצבית. נכון לעכשיו, הוא מנהג סטנדרטי לאבחון neuropathies סיבים הקטנים באמצעות IENFD נקבע על ידי צביעת PGP עם brightfield מיקרוסקופיה 6. בנוסף, מספר קבוצות מחקר השתמשו בפרוטוקולי Immunofluorescent לPGP אימונוהיסטוכימיה 7-9. נוירופתיה סיבים קטנה היא נפוצה הקשורים כאב נוירופתי. על מנת להבין את תפקידו של IENF החיוני לעיבוד כאב נוסף, פיתחנו טכניקה לIENF הכוללת שיתוף תווית עם סיבים שיוצרים כאב. Nociceptive IENF, במיוחד Aδ וסיבי C, ניתן ללמוד דרך שיתוף התיוג של IENF עם PGP וסמן nociceptive, tropomyosin-קולטן קינאז (TRK) 5. TRK הוא זיקה הגבוהה לקולטן לגורם גדילה עצבי שחיוני להתפתחות של Nociception. את סיבי עצב nociceptive חיובי TRK הם סיבים שpeptidergic המפורש חומר P (SP) וקלציטונין גנים הקשורים פפטיד (CGRP). בעבר, Lauria ועמיתיו ליישם את הטכניקה כפולת התיוג ללמוד PN, IENF PGP חיובי שיתוף תיוג עם סמן nociceptive 10. במחקר הקודם שלנו, הוכיח כי IENF TRK-חיובי, אך לא IENF שלילי TRK, שהוגברו במודל חיה של נוירופתיה סוכרתית כואבת 5. טכניקת שיתוף תיוג זה מספקת את היכולת להשוות כימות של IENFD nociceptive לסך IENFD והיכולת ללמוד שינויים מורפולוגיים הקשורים PN. היכולת לדמיין IENF nociceptive וcompaמחדש כימות של IENFD המוחלטת לIENFD nociceptive יכולה לספק ראיות אובייקטיביות לקיומו של כאב, ואולי תובנה חומרת כאב קשור PN. טכניקה זו היא גם לעור של מודלים של בעלי חיים. בהשוואה למחקרים קודמים, בפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטות לניתוח תמונת 3D, יצירת ההזדמנות להימנע מטעויות שעלולות להתרחש בניתוח תמונת 2D.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

חלק א ': אימונוהיסטוכימיה

הכנה של צלחת 96 היטב ומניעה של ביופסיות עור Punch מכתים רקע נאספות מבני אדם וטופחו במשך 12-24 שעות בפתרון מקבע (paraformaldehyde 2% עם פתרון 0.75 מ 'L-ליזין (pH 7.4) ונתרן 0.05 מ"מ periodate) על 4 מעלות צלזיוס כפי שתואר לעיל 8. דוגמאות אז cryoprotected בופר פוספט (PBS) עם גליצרול 20% על 4 מעלות צלזיוס עד שבוע 1, מוטבע בתקשורת הרכבה טמפרטורה אופטימלית חיתוך (אוקטובר), ולאחר מכן מחולקת למקטעים עבים 50 מיקרומטר על cryostat. הפרוטוקול המתואר להלן מיועד לחלקי עור 8, את המספר המרבי של חלקי עור אפשר לעבור אימונוהיסטוכימיה החופשית צף באחד 96 גם צלחת.

יום 1:

1. מניעת immunoreactivity הלא ספציפי בשכבה הקרנית

  1. 96 גם צלחת תווית כפי שמוצג באיור 1. הוסף 150 μl של תמונה-IT FX איתותים (Image-IT), יעילות לחסימת מכתים רקע 11,12, לכל אחד גם בשורת 1 של 96 גם הצלחת.
  2. הוסף 150 μl של 1X PBS היטב לתוך כל אחד בשורת 2 ו -3 של 96 גם הצלחת.
  3. רכישת שני סעיפים 50 מיקרומטר לכל מטופל: סעיף אחד מהביופסיה נלקחת בDL, סעיף אחד מהביופסיה נלקחת בPT. לולאת inoculating (LeLoop) משמשת להעברת חלקים מאחד למשנהו לשטוף כדי למנוע נזק מורפולוגי. בעדינות להעביר כל סעיף 50 מיקרומטר, באמצעות לולאת inoculating, לאדם גם בשורה 1, המכיל תמונה-IT. דגירה סעיפים בתמונה-IT עבור 30 דקות ב RT על כיסא נדנדה שטוחה.
  4. יש לשטוף את חלקי פעמיים עם 1X PBS (שורות 2 ו -3) במשך 10 דקות ב RT. מניחים צלחת גם על כיסא נדנדה שטוחה בין שטיפות.

2. הכנה של 5% פתרון חסימת BSA ו1% פתרון שטיפה

  1. בעוד סעיפי ביופסיה הם דוגרים בתמונה-IT, להכין 5% חסימת solution (5% פתרון BSA, 0.3% TX-100, 0.1 מ 'PBS-BSA וורטקס עד מתמוסס לחלוטין).
  2. הוסף 150 μl של פתרון חסימת BSA 5% לבאר כל השורה 4.
  3. באמצעות לולאת inoculating, להעביר חלקים לתוך בארות בודדות של פתרון 5% BSA חסימה. דגירה סעיפים בפתרון חסימת BSA 5% עבור 1-2 שעות ב RT על כיסא נדנדה שטוחה.

3. הכנה של 1% פתרון BSA שטיפה ודילול של נוגדנים ראשוניים

  1. בעוד סעיפים הם דוגרים בפתרון 5% BSA חסימה, להכין 1% שטיפת פתרון (BSA 1%, 0.3% פתרון TX-100, 0.1 מ 'PBS-BSA וורטקס עד מתמוסס לחלוטין).
  2. בעוד סעיפים הם דוגרים בפתרון 5% BSA חסימה, לדלל נוגדנים עיקריים ב1% שטיפת פתרון.
    1. במשך שמונה סעיפים (μl 8 X 150 = 1,200 μl) יש צורך בסכום כולל של 1,200 μl. את הנוגדנים הראשוניים מורכבים ב1,500 μl (כ -20% בנפח נוסף).
    2. דילולים של הנוגדנים העיקריים: PGP, 1:500; TRK,1:500 ב1% BSA שטיפת פתרון.

4. דגירה של ביופסיות מחולק בנוגדן ראשוני

  1. הוסף 150 μl של נוגדנים עיקריים מדוללים לתוך הבארות הייעודיות של 96 גם הצלחת (שורה 5).
  2. העבר את החלקים מ5% חסימת פתרון (שורה 4) לתוך בארות הנוגדן הראשוניות הייעודיות (שורה 5).
  3. חותם את הצלחת 96 היטב עם parafilm ורדיד אלומיניום, כדי למנוע התייבשות וחשיפה לאור.
  4. דגירה 96 גם צלחת O / N ב 4 ° C על כיסא נדנדה שטוחה.

יום 2:

5. יש לשטוף את ביופסיות בפתרון שטיפת BSA 1%

  1. הוסף 150 μl של פתרון שטיפת BSA 1% לכל אחד גם בשורה 6, 7, ו -8.
  2. יש לשטוף את החלקים שלוש פעמים עם שטיפת פתרון BSA 1% (6 שורות, 7, ו -8) במשך שעה 1 בכל פעם על RT. לכסות את הצלחת היטב בנייר אלומיניום ומניחים על נדנדה שטוחה בין שטיפות.

6. דילול של נוגדנים משני

<ol>
  • בעוד סעיפים מודגרת בשטיפה האחרונה של פתרון שטיפת BSA 1% (שורה 8), לדלל נוגדנים משני בפתרון שטיפת BSA 1%:
    1. במשך שמונה סעיפים (μl 8 X 150 = 1,200 μl) יש צורך בסכום כולל של 1,200 μl. את הנוגדנים משני בנויים ב1,500 μl (כ -20% בנפח נוסף).
    2. דילולים של נוגדנים משני: לPGP (אלקסה פלואוריד 488 חמור נגד הארנב, 1:250), לTRK (אלקסה פלואוריד 647 חמורים נגד עיזים, 1:250) בפתרון BSA 1% שטיפה.

    • 7. דגירה של ביופסיות מחולק בנוגדנים משני

    1. הוסף 150 μl של נוגדנים משני מדוללים לתוך בארותיהם המיועדות של צלחת 96 היטב (שורה 9).
    2. העבר את החלקים מחסימת פתרון 1% BSA (שורה 8) לנוגדנים משני היטב (שורה 9).
    3. חותם את הצלחת 96 היטב עם parafilm ורדיד אלומיניום, כדי למנוע התייבשות וחשיפה לאור.
    4. דגירה סעיפים במיועד המשני הנוגדנים O/ N ב 4 ° C על כיסא נדנדה שטוחה.

    8. יש לשטוף את ביופסיות בפתרון שטיפת BSA 1%

    1. הוסף 150 μl של 1% BSA פתרון שטיפה היטב לתוך כל אחד בשורת 10, 11, ו -12.
    2. יש לשטוף את החלקים שלוש פעמים עם שטיפת פתרון BSA 1% (10 שורות, 11, ו -12) עבור שעה 1 בכל פעם על RT. לכסות את הצלחת היטב בנייר אלומיניום ומניחים על כיסא נדנדה שטוחה בין שטיפות.

    9. הכנת שקופיות מיקרוסקופ וביופסיות מחולק הרכבה

    1. בעוד סעיפי ביופסיה הם דוגרים בשטיפה האחרונה של שטיפת פתרון BSA 1% (שורה 12), להכין שקופיות מיקרוסקופ.
    2. הנח 50 μl של פתרון BSA 1% שטיפה בשקופית אחת בכל פעם.
    3. הסר חלקים מפתרון שטיפת BSA 1% (שורה 12), ולמקם אותו בירידה של 50 μl פתרון שטיפת BSA 1% בשקופית מיקרוסקופ הייעודי. אחרי אופטימיזציה עמדתו של הסעיף, להסיר פתרון BSA 1% עודף שטיפה עם טפטפת זכוכית כדורית, נקיטת אמצעי זהירותכדי להימנע ממגע הדגימה.

    הערה: ודא שסעיף אינו מקופל; הדגימה צריכה להיות שטוחה על פני השטח של שקופית מיקרוסקופ.

    1. מקום 1 טיפה של להאריך antifade זהב הרכבה מגיב עם DAPI ליד הביופסיה בשקופית מיקרוסקופ. קח coverslip זכוכית מיקרוסקופ מ"מ 22x22 ומניח בעדינות אותו על ביופסיה וירידה של להאריך מגיב antifade זהב עם ירידת DAPI. חזור על פעולה עבור כל מקטע.
    2. בואו שקופיות מיקרוסקופ יבשה O / N ב RT בחושך.

    הערה: הוצא את כל בועות אוויר באמצעות קצה פיפטה. למחות עודף להאריך מגיב antifade זהב.

    חלק ב ': ההדמיה Confocal

    10. ההדמיה confocal

    1. אותות הקרינה תמונה באמצעות לייזר 500 FluoView אולימפוס סריקת מיקרוסקופ confocal עם נפט טבילה (1.3 NA) אובייקטיבית וזום שתי פעמים עם תוכנת 5.0 גרסת FluoView 40X. השתמש אלקסה פלואוריד 488 ו אלקסה פלואוריד 647 לרגש HeNe 543 ננומטר לייזר הירוק והאדום HeNe לייזר 633 ננומטר, בהתאמה. אות אלקסה פלואוריד 488 מיוצגת על ידי מראה ירוק עד שולחן (LUT) ופלואוריד אלקסה 647 על ידי LUT אדום.
    2. הגדר את פתחי confocal לכל גלאי ב400 מיקרומטר כדי לשפר את האותות. סריקות רציפות צריכים להילקח ברזולוציה של 1,024 x 1,024 למקסם את הפרדת אות.
    3. ללכוד תלת ממדי Z-סדרה באמצעות 1.2 מיקרומטר מרווחי z צעד (מבוסס על יחידת הסריקה האופטימלית מחושבת על ידי תוכנת FluoView) עם מיצוע קלמן (שתי מסגרות).

    חלק ג': ויזואליזציה ואנימציה תלת ממדיות

    11. ויזואליזציה (3D) תלת ממדים ואנימציה

    1. קבצי FluoView פתוחים בתוכנת x64 Imaris (גרסה 7.3, Bitplane AG) כדי להמחיש את הסטים של תמונות 3D.
    2. התאם להציג לפי צורך כדי לשפר את הניגודיות של אות מסוימת בעצבים.
    3. צור surface לדמיין גבול עורי, אפידרמיס. השתמש בכלי קונטור בתיקו מצב לשרטט את הגבול.
    4. הקצאת משטח שקוף למחצה עד לגבול כדי לראות את אותות הניאון בסיסיים.
    5. לכידת תמונות סטילס של אותות ניאון 3D כדי ליצור תמונות Snapshot של סרט 3D.
    6. השתמש בתכונת האנימציה ליצור סרט 3D. את התמונות ניתן לסובב 360 מעלות מספר פעמים כדי להראות לכל אות בנפרד וממוזג (איורים 2, 3 ו -4). הגדר אנימציה כדי ליצור סרטים בהיקף של 200 מסגרות אנימציה ב15 מסגרות לשנייה. שמור כל סרט כקובץ AVI גלם.
    7. לדחוס את סרט AVI הסופי עם תוכנת VirtualDub (גרסת 1.9.4).

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    אנחנו מוחלים פרוטוקול הנוכחי כדי ללמוד את המורפולוגיה של IENF בביופסיות עור וPT DL מחולים עם PN. העור, משלושה נושאים, שנאסף באוניברסיטת יוטה להפגין pathomorphology קשור PN. הנושאים כוללים: מקרה 1: גבר בן 51 עם היסטוריה של PN של סוכרת מהסוג 2 (משך: 14 חודשים; ניקוד כאב: 51); מקרה 2: גבר בן 56 עם היסטוריה של PN בסוכרת מסוג 2 (משך: 108 חודשים; ניקוד כאב: 47), ומקרה 3: גבר בן 66 עם היסטוריה של PN של סוכרת מהסוג 2 (משך: 42 חודשים; ניקוד כאב: 46). היסטוריה ובדיקת נוירולוגית, כולל בדיקות חושיות כמותי ומחקרי הולכה עצביות, בוצעו על מנת להעריך נוירופתיה היקפית. ציוני כאב נקבעו על בסיס סולם כאב האנלוגי ויזואלית 0-100.

    באמצעות פרוטוקול זה, אנו יכולים ללמוד את מבנה 3D של IENFs בעור אנושי (איור 2). באיור 2 (איור 3). ההדמיה 3D של נפיחויות axonal, המוצגות באיור 3, מוכיחה כי נפיחויות אלה הן מבנים כדוריים מופצים יחד IENFs. בנוסף, ניתן להשתמש בשיטות אלה כדי ללמוד הסתעפות בIENFs (איור 4). תמונות 3D של הסתעפות מוצג באיור 4 מראות כי שינויים מורפולוגיים יתקיימו עם הנוכחות של PN. כפי שתואר לעיל, בגבול עורי, אפידרמיס נקבע בהתבסס על מורפולוגיה וכיוון של עצבים ואת ההבדל בין עוצמת פיקסל הדרמיס והאפידרמיס 8. האיתור הכחול, מתואר באיורים 2, 3, ו 4, מציין את צומת עורי-אפידרמיס.

    איור 1
    איור 1. תרשים סכמטי המייצג את ההתקנה לצלחת 96 היטב לעור הביופסיה אימונוהיסטוכימיה.

    איור 2. תלת ממדי (3D) תמונות של IENF. תמונת 3D נציג () IENF PGP החיובי, שכותרתו ירוקה, המייצגת IENF הכולל (הראשון 360 מעלות סיבוב) ו (ב) IENF חיובי TRK, שכותרתו אדומה, המייצג IENF nociceptive (360 מעלות הסיבוב שני), ו (ג ) תמונה ממוזגת הוכחת IENF PGP חיובי, nociceptive (360 מעלות סיבוב שלישי) במדגם עור ממקרה 1. בר = 20 מיקרומטר. לחץ כאן לצפייה בסרט.

    דמות3. תמונה (3D) תלת ממדית של נפיחויות axonal בIENF של PN. תמונת 3D נציג נפיחויות axonal (ראשי חץ) לאורך IENFs, שכותרתו על ידי PGP עם אות ירוק, ובתוך מקלעת subdermal בדגימת עור ממקרה 2. בר = 10 מיקרומטר. לחץ כאן לצפייה בסרט.

    איור 4. תמונה (3D) תלת ממדית של axonal הסתעפות בIENF של PN. תמונת מייצגת 3D של הסתעפות axonal (ראשי חץ) יחד IENFs, שכותרתו על ידי PGP עם אות ירוקה, במדגם עור ממקרה 3. בר = 20 מיקרומטר. לחץ כאן לצפייה בסרט.

    רכיבים של פתרון 5% BSA חסימה: הסכום הדרוש ל12.5 מ"ל
    1X PBS 8.125 מ"ל
    0.1% טריטון [ריכוז סופי: 0.03%] X-100 (TX-100) 3.75 מ"ל
    אלבומין בסרום שור (BSA) 0.625 גרם
    סך הכל 12.5 מ"ל

    טבלת מס '1. 5% BSA חסימת פתרון.

    רכיבים של 1% שטיפת פתרון: הסכום הדרוש ל12 מ"ל
    1X PBS 8.625 מ"ל
    0.1% TX-100 [ריכוז סופי: 0.03%] 3.25 מ"ל
    אלבומין בסרום שור (BSA) 0.125 גרם
    סך הכל 12 מ"ל

    טבלת 2. BSA 1% חסימת פתרון.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    מדידה של IENFD כבר בשימוש נרחב על מנת לקבוע את מידת נוירופתיה היקפית 13,14. נכון לעכשיו, הפרוטוקול הנפוץ ביותר מודד רק את הצפיפות של סיבי עצב שחודרים את קרום המרתף של האפידרמיס, זה לא לוקח בחשבון הסתעפות ו / או שינויים מורפולוגיים של העצבים axonal. בנוסף, ניתוח IENFD נוכחי לא הוכח, כדי לקשר בין IENFD עם הנוכחות של כאב בPN 15.

    אנחנו דיווחו בעבר כי מספרים מוגברים של IENFD nociceptive קשורים להתנהגויות כאב בעכברי db / db, מודל עכבר של סוכרת מהסוג 2 5. בדוח זה, אנחנו מוחלים ראשון פרוטוקול immunofluorescent כפול ללמוד IENF nociceptive. במחקר הנוכחי, אנו מרחיבים את הפרוטוקול שלנו לעור אנושי מחולים עם PN. ניתוח immunofluorescent הכפול מספק מדידות של שניהם IENF הכולל וIENF nociceptive, קבוצת המשנה של IENFs שמתווכיםכאב. IENF nociceptive אלה הם בעיקר חיוביים עבור TRK ונוירופפטידים nociceptive אחרים 5. ניתוח immunofluorescent כפול דומה לנוירופתיה מכאיבה תואר על ידי Lauria ועמיתיו 10. הם דיווחו מופחתים IENFD לקולט חולף פוטנציאל ערוץ subfamily חבר קטיון V 1 (TRPV1) בחולים עם נוירופתיה מכאיבה. הפרוטוקול הנוכחי יכול לספק גישה אלטרנטיבית למדידת IENFD nociceptive מבוסס על נתונים של בעלי החיים שלנו 5.

    הפרוטוקול הנוכחי מציע גישת 3D ללימוד מבנה IENF. בשילוב עם ניתוח immunofluorecent כפול, הפרוטוקול הנוכחי מספק שיטות לבחון את המורפולוגיה של IENFs nociceptive. מחקרים קודמים לא דיווחו על קשר בין צפיפות או הסתעפות של IENF nociceptive עם PN. הנה, אנחנו מדגימים פרוטוקול ללימוד הסתעפות axonal ונפיחות בIENFs של עור אנושי. ניתוח 3D שלנו מציע כי מ 'זהethod יכול לשמש כדי ללמוד את השינויים מורפולוגיים של IENF בPN. בנוסף, ההדמיה 3D יכולה לשפר את הפרוטוקולים השוטפים של מדידת IENFD על ידי הימנעות מטעויות הקשורות לראיה מופחתת של מבנים חופפים קשורים 2D-הדמיה.

    נפיחות axonal מוגדרת כגדלה של חלק axonal בקוטר גדול יותר משתי פעמים כי קליבר 16 axonal המקורית. מבנה זה מכיל שברי שלד התא והמרכיבים של התחבורה axonal axonal. נפיחות axonal נחשבת תכונה מוקדמת של נוירופתיה axonal 6,16,17. עם זאת, הניתוח של מבני 3D נפיחות axonal לא דווח בספרות. כמתואר באיור 3, ההדמיה 3D יכולה לספק תובנות חשובה לנפיחות axonal קשורה PN.

    הוא מאופיין היטב כי הסתעפות axonal מלווה את ההחלמה מפגיעה בעצב 18. עם זאת,המתודולוגיה זמינה לכימות הסתעפות axonal עדיין מוגבלת המבוססת על ההדמיה 2D. כפי שמתואר באיור 4, יכולה להיות מסובכת הסתעפות axonal ידי הטבע המפותל של עצבי התחדשות. כתוצאה מכך, את הנקודות ההסתעפות יכולה להיות מוסתרות על ידי סיבי עצב סמוכים כדי להשפיע על הדיוק של כימות. ניתוח ההדמיה 3D של הפרוטוקול שלנו מספק הדמיה משופרת לפרטים של העצבים המסתעפים.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    אין ניגודי האינטרסים להכריז.

    Acknowledgments

    עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומי לבריאות מענקי K08 NS061039-01A2, התכנית לנוירולוגיה מחקר וגילוי, ואלפרד טאובמן מכון המחקר הרפואי א באוניברסיטת מישיגן. עבודה זו השתמשה במורפולוגיה וניתוח תמונת הליבה של מחקר מישיגן הסוכרת ומרכז הדרכה, שמומן על ידי המכון הלאומי לבריאות גרנט 5P90 DK-20572 מהמכון הלאומי לסוכרת ומחלות עיכול וכליות. המחברים מבקשים להודות לרובינסון וסינגלטון גורדון סמית (אוניברסיטת יוטה) לתרומתם הנדיבה של דגימות עור אנושיות כדי לתמוך בפיתוח הראשוני של טכניקת אימונוהיסטוכימיה הסמן הביולוגי nociceptive.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    10X PBS Fisher Scientific BP399-4 To make up 1X PBS
    Image-IT FX Signal Invitrogen I36933 Image-IT
    Protein Gene Product 9.5 (Polyclonal rabbit) AbD Serotec 7863-0504 PGP
    Tropomyosin Related-Kinase A (Polyclonal goat) R&D Systems AF1056 Trk A
    Alexa Fluor 488 donkey α-rabbit Invitrogen A21206 AF488 donkey α-goat
    Alexa Fluor 647 donkey α-goat Invitrogen A21447 AF647 donkey α-goat
    Albumin, from Bovine Serum Sigma-Aldrich A7906-100 BSA
    Triton X- 100 Sigma-Aldrich T9284 TX-100
    Non-calibrated Loop LeLoop MP 199025 inoculating Loop
    96-well assay plate Corning Incorporated 3603 Well plate
    Prolong Gold antifade reagent with DAPI Invitrogen P36931 DAPI
    Microscope Cover Glass 22x22 mm Fisher Scientific 12-541-B Coverslips
    Superfrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15 Microscope Slides
    Olympus Fluoview Laser Scanning Confocal Microscope Olympus FV500 Confocal Microscope
    Optimum Cutting Temperature Sakura 4583 OCT
    Leica cryostat Leica CM1850 Cryostat

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Lauria, G., Holland, N., et al. Epidermal innervation: changes with aging, topographic location, and in sensory neuropathy. J. Neurol. Sci. 164 (2), 172-178 (1999).
    2. Sullivan, K. A., Hayes, J. M., et al. Mouse models of diabetic neuropathy. Neurobiol. Dis. 28 (3), 276-285 (2007).
    3. McArthur, J. C., Stocks, E. A., Hauer, P., Cornblath, D. R., Griffin, J. W. Epidermal nerve fiber density: normative reference range and diagnostic efficiency. Arch. Neurol. 55 (12), 1513-1520 (1998).
    4. Griffin, J. W., McArthur, J. C., Polydefkis, M. Assessment of cutaneous innervation by skin biopsies. Curr. Opin. Neurol. 14 (5), 655-659 (2001).
    5. Cheng, H. T., Dauch, J. R., Hayes, J. M., Yanik, B. M., Feldman, E. L. Nerve growth factor/p38 signaling increases intraepidermal nerve fiber densities in painful neuropathy of type 2 diabetes. Neurobiol. Dis. 45 (1), 280-287 (2012).
    6. Lauria, G., Lombardi, R., Camozzi, F., Devigili, G. Skin biopsy for the diagnosis of peripheral neuropathy. Histopathology. 54 (3), 273-285 (2009).
    7. Vlckova-Moravcova, E., Bednarik, J., Dusek, L., Toyka, K. V., Sommer, C. Diagnostic validity of epidermal nerve fiber densities in painful sensory neuropathies. Muscle Nerve. 37 (1), 50-60 (2008).
    8. Casanova-Molla, J., Morales, M., et al. Axonal fluorescence quantitation provides a new approach to assess cutaneous innervation. J. Neurosci. Methods. 200 (2), 190-198 (2011).
    9. Wang, L., Hilliges, M., Jernberg, T., Wiegleb-Edstrom, D., Johansson, O. Protein gene product 9.5-immunoreactive nerve fibres and cells in human skin. Cell Tissue Res. 261 (1), 25-33 (1990).
    10. Lauria, G., Morbin, M., et al. Expression of capsaicin receptor immunoreactivity in human peripheral nervous system and in painful neuropathies. J. Peripher. Nerv. Syst. 11 (3), 262-271 (2006).
    11. Penna, G., Fibbi, B., et al. Human benign prostatic hyperplasia stromal cells as inducers and targets of chronic immuno-mediated inflammation. J. Immunol. 182 (7), 4056-4064 (2009).
    12. Lentz, S. I., Edwards, J. L., et al. Mitochondrial DNA (mtDNA) Biogenesis: Visualization and Duel Incorporation of BrdU and EdU Into Newly Synthesized mtDNA In Vitro. J. Histochem. Cytochem. 58 (2), 207-218 (2010).
    13. Polydefkis, M., Hauer, P., Griffin, J. W., McArthur, J. C. Skin biopsy as a tool to assess distal small fiber innervation in diabetic neuropathy. Diabetes Technol. Ther. 3 (1), 23-28 (2001).
    14. Lauria, G. Small fibre neuropathies. Curr. Opin. Neurol. 18 (5), 591-597 (2005).
    15. Sorensen, L., Molyneaux, L., Yue, D. K. The relationship among pain, sensory loss, and small nerve fibers in diabetes. Diabetes Care. 29 (4), 883-887 (2006).
    16. Lauria, G., Morbin, M., et al. Axonal swellings predict the degeneration of epidermal nerve fibers in painful neuropathies. Neurology. 61 (5), 631-636 (2003).
    17. Herrmann, D. N., McDermott, M. P., et al. Epidermal nerve fiber density, axonal swellings and QST as predictors of HIV distal sensory neuropathy. Muscle Nerve. 29 (3), 420-427 (2004).
    18. Navarro, X. Chapter 27: Neural plasticity after nerve injury and regeneration. Int. Rev. Neurobiol. 87, 483-505 (2009).

    Tags

    רפואה גיליון 74 נוירוביולוגיה מדעי המוח אנטומיה פיזיולוגיה ביולוגיה תאית נוירולוגיה פתולוגיה מחלות היקפיים במערכת עצבים PNS Polyneuropathies מחלות של מערכת עצבים סיבי עצב intraepidermal אנושי ביופסיה עור הדמיה תלת ממדית נוירופתיה הכואבת intraepidermal צפיפות סיבי עצב IENFD עצבים אימונוהיסטוכימיה מיקרוסקופיה confocal הדמיה
    הדמיה תלת ממדית של סיבי עצב Intraepidermal nociceptive בביופסיות עור אדם
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Dauch, J. R., Lindblad, C. N.,… More

    Dauch, J. R., Lindblad, C. N., Hayes, J. M., Lentz, S. I., Cheng, H. T. Three-dimensional Imaging of Nociceptive Intraepidermal Nerve Fibers in Human Skin Biopsies. J. Vis. Exp. (74), e50331, doi:10.3791/50331 (2013).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter