Summary
С целью изучения изменений ноцицептивных внутриэпидермальных нервные волокна (IENFs) в болезненных невропатии (PN), мы разработали протоколы, которые могут непосредственно исследовать трехмерный морфологических изменений, наблюдаемых в ноцицептивных IENFs. Трехмерный анализ IENFs имеет потенциал, чтобы оценить морфологические изменения в IENF PN.
Abstract
Биопсии кожи обычно используется для количественной внутриэпидермальных нервных волокон плотностью (IENFD) для диагностики периферической 1,2 полинейропатии. В настоящее время это обычная практика, чтобы собрать 3 мм биопсии кожи от дистального ногу (DL) и проксимального бедра (PT) для оценки длины зависит полинейропатии 3. Однако из-за разнонаправленного характера IENFs, это сложно рассматривать перекрытие нервных структур путем анализа двумерного (2D) изображения. Кроме того, трехмерные (3D) изображения может обеспечить лучшее решение этой дилеммы.
В настоящем докладе мы представляем методы применения 3D визуализации для изучения болезненной нейропатии (PN). Для того чтобы определить IENFs, образцы кожи обрабатываются для иммунофлуоресцентного анализа белковых генного продукта 9,5 (PGP), поддон нейронального маркера. В настоящее время она является стандартной практикой для диагностики небольших невропатии волокна с использованием IENFD сдерживанияляется PGP иммуногистохимию использованием светлого микроскопии 4. В данном исследовании мы применяли двойного иммунофлуоресцентного анализа для определения общего IENFD, используя PGP и ноцицептивной IENF, с помощью антител, которые распознают тропомиозином-рецептор-киназы (TRK), высокое сродство к рецептору фактора роста нервов 5. Преимущества совместного окрашивания IENF с PGP и ТРК антител приносит пользу изучения PN, четко окрашивания PGP-позитивные, ноцицептивных волокон. Эти флуоресцентные сигналы могут быть количественно определить ноцицептивных IENFD и морфологические изменения, связанные с IENF PN. Флуоресцентные изображения приобретаются с помощью конфокальной микроскопии и обрабатывается для анализа 3D. 3D-визуализация обеспечивает крутящий способностей для дальнейшего анализа морфологических изменений, связанных с PN. Взятые вместе, флуоресцентные совместным окрашиванием, конфокальной микроскопии и 3D анализ ясно пользу изучения PN.
Introduction
В настоящее время это обычная практика для врачей количественно внутриэпидермальных нервного волокна плотностью (IENFD) из кожи биопсии удар, который может быть использован для диагностики небольших невропатии волокна 3, 6-8. Биопсии взяты из дистальной ножки (DL), 10 см над наружной лодыжки, и проксимальный бедра (РТ), 20 см ниже передней подвздошной ости 9. Все IENF помечены использованием белкового продукта гена 9,5 (PGP), пан нейронный маркер 10-12. В настоящее время она является стандартной практикой для диагностики небольших невропатии волокна с использованием IENFD определяется PGP окрашивания светлого микроскопии 6. Кроме того, некоторые исследовательские группы использовали иммунофлуоресцентного протоколы для PGP иммуногистохимии 7-9. Малый невропатии волокна, обычно связанных с невропатической боли. В целях более глубокого понимания роли IENF необходимых для обработки боли, мы разработали методику совместного этикетке общей IENF с волокнами, которые генерируют боли. Nocicepных IENF, в частности Aδ и С-волокна, могут быть изучены через кооперацию, маркировка IENF с PGP и ноцицептивной маркером, тропомиозином-рецептор-киназы (TRK) 5. Trk является высокое сродство к рецептору фактора роста нервов, что является необходимым для развития болевой чувствительности. ТРК-положительных ноцицептивных нервных волокон являются волокна, которые пептидергических экспресс вещество Р (SP) и кальцитонин ген родственный пептид (CGRP). Ранее Лория и коллеги применили двойной маркировки методика исследования PN, со-маркировки PGP-позитивные IENF с ноцицептивной маркером 10. В нашем предыдущем исследовании мы показали, что Trk IENF-положительных, но не Trk-отрицательных IENF, были активируется в животной модели болезненной диабетической нейропатии 5. Это сотрудничество маркировки метод обеспечивает возможность сравнить количественное ноцицептивных IENFD к общему IENFD и способность изучение морфологических изменений, связанных с PN. Возможность визуализировать ноцицептивных IENF и компаниямповторное определение количества от общего IENFD в ноцицептивных IENFD может обеспечить объективных признаков на наличие боли и, возможно представление о серьезности боль, связанную с PN. Этот метод также применим к коже животных моделях. По сравнению с предыдущими исследованиями, текущий протокол описывает методы для анализа 3D изображения, создавая возможность избежать ошибок, которые могут возникать в 2D анализа изображения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Часть А: Иммуногистохимия
Приготовление 96-луночный планшет и профилактики фоновое окрашивание биопсии кожи Удар собирают из человеческих субъектов и инкубировали в течение 12-24 ч в фиксирующий раствор (2% параформальдегида с 0,75 М L-лизин раствор (рН 7,4) и 0,05 мМ периодата натрия) при 4 ° С, как описано выше 8. Затем образцы криопротекции в фосфатном буферном растворе (PBS) с 20% глицерина при 4 ° С в течение 1 недели, встроенные в монтажной среды оптимальной температуры резки (OCT), а затем разрезали на 50 мкм разделы криостата. Протокол, описанный ниже предназначена для 8 секций кожу, максимальное количество разделов кожи можно проходить свободно плавающих иммуногистохимии в один 96-луночного планшета.
День 1:
1. Предупреждение неспецифической иммунореактивности в роговом слое
- Этикетка 96-луночный планшет, как показано на рисунке 1. Добавить 150 мкл Изображение-IT FX сигнала (Изображение-IT), эффективное для блокирования фоновое окрашивание 11,12, в каждую лунку в строке 1 96-луночный планшет.
- Добавить 150 мкл 1X PBS в каждую лунку в строке 2 и 3 96-луночного планшета.
- Приобретите два 50 мкм разделов на одного пациента: один участок от биопсии, принятые на DL, один раздел из биопсии, принятые на PT. Прививки петли (LeLoop) используется для передачи разделов из одного полоскания к следующему чтобы избежать морфологических повреждений. Аккуратно передать каждому разделу 50 мкм, используя прививки петли, в отдельную лунку ряд 1, содержащие изображения-IT. Выдержите в разделах Изображение-IT в течение 30 минут при комнатной температуре на плоской рокера.
- Промыть разделах дважды 1X PBS (строки 2 и 3) в течение 10 мин при комнатной температуре. Место, хорошо пластины на плоский рокер между полосканий.
2. Приготовление 5% BSA Блокирующий раствор и 1% раствора для промывки
- В то время как биопсия разделах высиживания в изображение-IT, готовить 5% блокирующего растворации (5% BSA, 0,3% ТХ-100, 0,1 М PBS-Vortex раствор до BSA полного растворения).
- Добавить 150 мкл 5% BSA блокирующего раствора в каждую лунку Ряд 4.
- Использование прививки петли, передавать секций в отдельных скважинах 5% BSA блокирующий раствор. Инкубируют секций в 5% BSA блокирующем растворе в течение 1-2 ч при комнатной температуре на плоской качалку.
3. Приготовление 1% BSA раствора для промывки и разбавления первичных антител
- А в разделах высиживания в 5% BSA блокирующий раствор, готовят 1% раствора для промывки (1% BSA, 0,3% ТХ-100, 0,1 М PBS-вихревое решение BSA до полного растворения).
- А в разделах высиживания в 5% BSA блокирующим раствором, разбавленным первичных антител в 1% раствора для промывки.
- В течение восьми разделов (8 х 150 = 1200 мкл мкл) в общей сложности 1200 мкл необходима. Первичные антитела состоят в 1500 мкл (около 20% дополнительного объема).
- Разведения первичных антител: PGP, 1:500; Trk,1:500 в 1% BSA раствора для промывки.
4. Инкубация Sectioned Биопсия в первичных антител
- Добавить 150 мкл разбавленного первичными антителами в назначенный лунки 96-луночного планшета (строка 5).
- Передача разделов от 5% блокирующий раствор (строка 4) в специально отведенные скважин антител (строка 5).
- Уплотнение 96-луночный планшет с парафином и алюминиевая фольга, чтобы избежать высыхания и освещенности.
- Инкубируют 96-луночный планшет O / N при 4 ° С на плоской качалку.
ДЕНЬ 2:
5. Промыть биопсий 1% BSA раствора для промывки
- Добавить 150 мкл 1% BSA раствора для промывки в каждую лунку в ряд 6, 7 и 8.
- Промыть разделах три раза 1% BSA промывки раствором (строки 6, 7 и 8) в течение 1 часа каждый раз при комнатной температуре. Кожух и пластины с алюминиевой фольгой и положите на плоскую рокер между полосканий.
6. Разведение вторичными антителами
<OL>- В течение восьми разделов (8 х 150 = 1200 мкл мкл) в общей сложности 1200 мкл необходима. Вторичные антитела состоят в 1500 мкл (около 20% дополнительного объема).
- Разведения вторичных антител: для PGP (Alexa Fluor 488 осла анти-кролик, 1:250), для Trk (Alexa Fluor 647 осла анти-козел, 1:250) в 1% BSA раствора для промывки.
7. Инкубация Sectioned биопсий вторичными антителами
- Добавить 150 мкл разбавленных вторичных антител в своих назначенных лунки 96-луночного планшета (строка 9).
- Передача секций от 1% BSA блокирующий раствор (строка 8) в вторичными антителами хорошо (9 ряд).
- Уплотнение 96-луночный планшет с парафином и алюминиевая фольга, чтобы избежать высыхания и освещенности.
- Выдержите разделов в назначенный вторичными антителами O/ N при 4 ° С на плоской рокера.
8. Промыть биопсий 1% BSA раствора для промывки
- Добавить 150 мкл 1% BSA раствора для промывки в каждую лунку в 10 строк, 11 и 12.
- Промыть разделах три раза 1% BSA промывки раствором (Строки 10, 11 и 12) в течение 1 часа каждый раз при комнатной температуре. Кожух и пластины с алюминиевой фольгой и положите на плоскую рокер между полосканий.
9. Подготовка стекла микроскопа и монтаж Sectioned Биопсия
- В то время как биопсия разделах высиживания после последнего полоскания 1% BSA раствора для промывки (строка 12), подготовить для микроскопа.
- Добавьте 50 мкл 1% BSA раствора для промывки на одном слайде одновременно.
- Удалить из разделов 1% BSA раствора для промывки (строка 12), и поместить его в 50 мкл капли 1% BSA раствора для промывки на указанном стекло микроскопа. После оптимизации положение разделе удалить избыток 1% BSA раствора для промывки с bulbed пипетки стекла, принимают меры предосторожностичтобы они не соприкасались образца.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь раздела не загибают, образец должен быть плоским по отношению к поверхности предметного стекла.
- Место 1 каплю Продли Золотой Antifade монтажа реагента с DAPI рядом с биопсией на предметное стекло микроскопа. Возьмите 22x22 мм покровным стеклом микроскопа и осторожно поместите его на биопсию и капли реагента Продли Золотой Antifade с падением DAPI. Повторите эти действия для каждого раздела.
- Пусть микроскопом сухой O / N при комнатной температуре в темноте.
ПРИМЕЧАНИЕ: удалить пузырьки воздуха использовании кончика пипетки. Вытирать излишки Продли Золотой Antifade реагента.
Часть B: конфокальной микроскопии
10. Конфокальной микроскопии
- Изображение использованием сигналов флуоресценции Olympus Fluoview 500 лазерной сканирующей конфокальной микроскопии с 40X нефтью погружения (1.3 NA) объективных и увеличения в два раза с Fluoview программное обеспечение версии 5.0. Используйте Alexa Fluor 488 и Alexa Fluor 647 для возбуждения 543 нм гелий-неоновый зеленый лазер и 633-нм гелий-неоновый красный лазер, соответственно. Alexa Fluor 488 сигнала представляет собой зеленый справочной таблицы (LUT) и Alexa Fluor 647 на красный LUT.
- Установка конфокальной отверстия для каждого детектора при 400 мкм для повышения сигналов. Последовательного сканирования должно быть принято при разрешении 1024 х 1024 с максимально разделения сигналов.
- Захват трехмерной г-серии, используя 1,2 мкм г шагом интервалов (на основе оптимального блок сканирования рассчитано с помощью программного обеспечения Fluoview) Калмана с усреднением (два кадра).
Часть C: Трехмерная визуализация и анимация
11. Трехмерные (3D) визуализации и анимации
- Открытое Fluoview файлов в программном обеспечении Imaris x64 (версия 7.3, Bitplane AG) для визуализации 3D наборов изображений.
- Настройка параметров экрана, сколько необходимо для повышения контрастности нервных специфический сигнал.
- Создать Суrface визуализировать кожно-эпидермального границы. С помощью контурного инструмента в режиме рисования провести границу.
- Назначьте полупрозрачной поверхности к границе для того, чтобы увидеть основные флуоресцентных сигналов.
- Захват неподвижных изображений 3D флуоресцентные сигналы для создания снимка изображения 3D-фильмов.
- Используйте функцию анимации для создания 3D-фильма. Фотографии можно повернуть на 360 градусов несколько раз, чтобы показать каждого сигнала отдельно и объединенной (рис. 2, 3, и 4). Набор анимации для создания фильмов, состоящих из 200 кадров анимированы при 15 кадрах в секунду. Сохранить каждый фильм в качестве сырьевого файл AVI.
- Сжатие заключительный фильм AVI с VirtualDub (версии 1.9.4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мы применили текущий протокол для изучения морфологии IENF в СТ и биопсии кожи DL от пациентов с PN. Кожа, из трех предметов, была собрана в университете штата Юта, чтобы продемонстрировать патоморфологию связанные с PN. Предметы включают: Случай 1: 51-летний мужчина с историей PN сахарного диабета 2 типа (Продолжительность: 14 месяцев; боли оценка: 51); Случай 2: 56-летний мужчина с историей PN сахарного диабета 2 типа (продолжительность: 108 месяцев; боли оценка: 47) и Вариант 3: 66-летний мужчина с историей PN сахарного диабета 2 типа (продолжительность: 42 месяцев; боли оценка: 46). Неврологические истории и экспертизы, в том числе количественное сенсорное тестирование и исследования нервной проводимости, проводились для оценки периферической нейропатии. Боль оценки были определены на основе 0-100 визуальной аналоговой шкале боли.
Используя этот протокол, мы имеем возможность изучать структуру 3D IENFs в коже человека (рис. 2). На рисунке 2 (фиг. 3). 3D визуализации аксонов отеки, представлены на рисунке 3, показывает, что эти опухоли шаровидные структуры распределены по IENFs. Кроме того, эти методы могут быть использованы в изучении ветвящихся в IENFs (рис. 4). 3D изображения разветвления представлены на фигуре 4 показано, что морфологические изменения происходят в присутствии PN. Как описано выше, дермально-эпидермального граница была определена на основании морфологии и ориентации нервы и пиксел разницы в интенсивности между дермой и эпидермисом 8. Синий трассировки, изображенный на рисунках 2, 3 и 4, Указывает на кожно-эпидермального соединения.
Рисунок 1. Принципиальная схема, представляющая установки для 96-луночный планшет для биопсии кожи иммуногистохимии.
Рисунок 2. Трехмерные (3D) изображения IENF. Представитель 3D-изображение (A) PGP-позитивные IENF, помечены зеленым, что составляет общего IENF (первый поворот на 360 °) и (B) Trk-положительных IENF, обозначенные красным, представляющих ноцицептивных IENF (второе вращение на 360 °) и (C ) объединенного изображения демонстрируют PGP-позитивные, ноцицептивной IENF (третий поворот на 360 °) в выборке из кожи Случай 1. Bar = 20 мкм. Нажмите здесь для просмотра фильма.
Рисунок3. Трехмерные (3D) изображения аксонов опухоли в IENF ПН. Представитель 3D изображение аксонов опухоли (стрелки) вдоль IENFs, помечены PGP с зеленого сигнала, и в подкожной сплетения в коже выборка из Случай 2. Bar = 10 мкм. Нажмите здесь для просмотра фильма.
Рисунок 4. Трехмерные (3D) изображения ветвления аксонов в IENF ПН. Представитель 3D изображение аксонов ветвления (наконечники стрел), а также IENFs, помечены PGP с зеленого сигнала, в выборке из кожи Случай 3. Bar = 20 мкм. Нажмите здесь для просмотра фильма.
| Компоненты 5% BSA Блокирующий раствор: | Необходимое количество для 12,5 мл |
| 1X PBS | 8,125 мл |
| 0,1% Тритон Х-100 (ТХ-100) [конечная концентрация: 0,03%] | 3,75 мл |
| Бычьего сывороточного альбумина (BSA) | 0,625 г |
| ИТОГО | 12,5 мл |
Таблица 1. 5% BSA Блокирующий раствор.
| Компоненты 1% раствора для промывки: | Необходимое количество на 12 мл |
| 1X PBS | 8,625 мл |
| 0,1% ТХ-100 [конечная концентрация: 0,03%] | 3,25 мл |
| Бычьего сывороточного альбумина (BSA) | 0,125 г |
| ИТОГО | 12 мл |
Таблица 2. 1% BSA Блокирующий раствор.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Измерение IENFD широко используется для определения степени периферические невропатии 13,14. В настоящее время наиболее часто используемый протокол только измеряет плотность нервных волокон, которые проникают через базальную мембрану эпидермиса, она не учитывает аксональное ветвления и / или морфологическими изменениями нервов. Кроме того, текущие IENFD анализ не коррелируют IENFD с наличием болей в PN 15.
Ранее мы сообщали, что увеличение количества ноцицептивных IENFD связаны с болью поведения в дБ / дБ мышей, мыши модели сахарного диабета 2 типа 5. В этом докладе мы впервые применили двойные Иммунофлуоресцентной протокол для изучения ноцицептивных IENF. В текущем исследовании, мы расширяем наш протокол на кожу человека от пациентов с PN. Двойного иммунофлуоресцентного анализа обеспечивает измерения как общего, так и IENF ноцицептивных IENF, подмножество IENFs, которые обеспечиваютболь. Эти ноцицептивных IENF в основном положительные для Trk и другие нейропептиды ноцицептивных 5. Похожие двойного иммунофлуоресцентного анализа болезненные невропатии было описано Лауриа и коллеги 10. Они сообщают о снижении IENFD для переходных рецепторный потенциал канала катиона подсемейства V элемент 1 (TRPV1) у пациентов с болезненной нейропатии. Текущий протокол может обеспечить альтернативный подход для измерения ноцицептивных IENFD на основе наших данных животных 5.
Текущий протокол предлагает 3D подход к изучению IENF структуры. В сочетании с двойными immunofluorecent анализ, текущий протокол предоставляет методы для изучения морфологии ноцицептивных IENFs. Предыдущие исследования не выявили связь между плотностью или разветвления ноцицептивных IENF с PN. Здесь мы демонстрируем протокол для изучения аксональное ветвления и припухлость в IENFs кожи человека. Наши 3D анализ показывает, что это меню могут быть использованы для изучения морфологических изменений в IENF PN. Кроме того, 3D изображений может улучшить существующие протоколы из IENFD измерения, избегая ошибок, связанных с пониженной визуализации перекрывающихся структур, связанных с 2D-изображений.
Аксонов набухание определяется как расширение аксонального участок с диаметром больше чем в два раза, что оригинальный аксонального калибра 16. Эта структура содержит фрагменты аксонов компонентов цитоскелета и аксонов транспорта. Набухание аксонов считают ранним функция аксонов нейропатия 6,16,17. Тем не менее, 3D анализ аксонов опухоль структур не сообщалось в литературе. Как показано на рисунке 3, 3D визуализация может обеспечить важное понимание для аксональное отек, связанный с PN.
Это хорошо, что характеризуется аксональное ветвление сопровождает восстановление после повреждения нерва 18. Однакодоступные методики количественной оценки аксональное ветвления по-прежнему ограничена на основе 2D-изображений. Как показано на рисунке 4, аксонального ветвления может быть усложнена извилистый характер регенерации нервов. Следовательно, точки ветвления могут быть не видны близлежащие нервные волокна влияют на точность количественного определения. 3D визуализация анализа нашего протокола обеспечивает улучшенную визуализацию подробности ветвления нервов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов не объявить.
Acknowledgments
Работа выполнена при поддержке Национального института здравоохранения Гранты K08 NS061039-01A2, Программа исследований неврологии и Discovery, и Альфред Таубман А. Института медицинских исследований в Университете Мичигана. Наша работа Морфология и анализ изображений Основные научно-исследовательского Мичиган Диабет и учебный центр, финансируемый Национальным институтом здоровья Грант 5P90 DK-20572 от Национального института диабета, желудочно-кишечных и почечных заболеваний. Авторы хотели бы поблагодарить Робинсон Синглтон и Гордон Смит (Университет штата Юта) за их щедрое пожертвование образцы кожи человека для поддержки первоначального развития ноцицептивной технику иммуногистохимию биомаркеров.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X PBS | Fisher Scientific | BP399-4 | To make up 1X PBS |
| Image-IT FX Signal | Invitrogen | I36933 | Image-IT |
| Protein Gene Product 9.5 (Polyclonal rabbit) | AbD Serotec | 7863-0504 | PGP |
| Tropomyosin Related-Kinase A (Polyclonal goat) | R&D Systems | AF1056 | Trk A |
| Alexa Fluor 488 donkey α-rabbit | Invitrogen | A21206 | AF488 donkey α-goat |
| Alexa Fluor 647 donkey α-goat | Invitrogen | A21447 | AF647 donkey α-goat |
| Albumin, from Bovine Serum | Sigma-Aldrich | A7906-100 | BSA |
| Triton X- 100 | Sigma-Aldrich | T9284 | TX-100 |
| Non-calibrated Loop | LeLoop | MP 199025 | inoculating Loop |
| 96-well assay plate | Corning Incorporated | 3603 | Well plate |
| Prolong Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P36931 | DAPI |
| Microscope Cover Glass 22x22 mm | Fisher Scientific | 12-541-B | Coverslips |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | Microscope Slides |
| Olympus Fluoview Laser Scanning Confocal Microscope | Olympus | FV500 | Confocal Microscope |
| Optimum Cutting Temperature | Sakura | 4583 | OCT |
| Leica cryostat | Leica | CM1850 | Cryostat |
References
- Lauria, G., Holland, N., et al. Epidermal innervation: changes with aging, topographic location, and in sensory neuropathy. J. Neurol. Sci. 164 (2), 172-178 (1999).
- Sullivan, K. A., Hayes, J. M., et al. Mouse models of diabetic neuropathy. Neurobiol. Dis. 28 (3), 276-285 (2007).
- McArthur, J. C., Stocks, E. A., Hauer, P., Cornblath, D. R., Griffin, J. W. Epidermal nerve fiber density: normative reference range and diagnostic efficiency. Arch. Neurol. 55 (12), 1513-1520 (1998).
- Griffin, J. W., McArthur, J. C., Polydefkis, M. Assessment of cutaneous innervation by skin biopsies. Curr. Opin. Neurol. 14 (5), 655-659 (2001).
- Cheng, H. T., Dauch, J. R., Hayes, J. M., Yanik, B. M., Feldman, E. L. Nerve growth factor/p38 signaling increases intraepidermal nerve fiber densities in painful neuropathy of type 2 diabetes. Neurobiol. Dis. 45 (1), 280-287 (2012).
- Lauria, G., Lombardi, R., Camozzi, F., Devigili, G. Skin biopsy for the diagnosis of peripheral neuropathy. Histopathology. 54 (3), 273-285 (2009).
- Vlckova-Moravcova, E., Bednarik, J., Dusek, L., Toyka, K. V., Sommer, C. Diagnostic validity of epidermal nerve fiber densities in painful sensory neuropathies. Muscle Nerve. 37 (1), 50-60 (2008).
- Casanova-Molla, J., Morales, M., et al. Axonal fluorescence quantitation provides a new approach to assess cutaneous innervation. J. Neurosci. Methods. 200 (2), 190-198 (2011).
- Wang, L., Hilliges, M., Jernberg, T., Wiegleb-Edstrom, D., Johansson, O. Protein gene product 9.5-immunoreactive nerve fibres and cells in human skin. Cell Tissue Res. 261 (1), 25-33 (1990).
- Lauria, G., Morbin, M., et al. Expression of capsaicin receptor immunoreactivity in human peripheral nervous system and in painful neuropathies. J. Peripher. Nerv. Syst. 11 (3), 262-271 (2006).
- Penna, G., Fibbi, B., et al. Human benign prostatic hyperplasia stromal cells as inducers and targets of chronic immuno-mediated inflammation. J. Immunol. 182 (7), 4056-4064 (2009).
- Lentz, S. I., Edwards, J. L., et al. Mitochondrial DNA (mtDNA) Biogenesis: Visualization and Duel Incorporation of BrdU and EdU Into Newly Synthesized mtDNA In Vitro. J. Histochem. Cytochem. 58 (2), 207-218 (2010).
- Polydefkis, M., Hauer, P., Griffin, J. W., McArthur, J. C. Skin biopsy as a tool to assess distal small fiber innervation in diabetic neuropathy. Diabetes Technol. Ther. 3 (1), 23-28 (2001).
- Lauria, G. Small fibre neuropathies. Curr. Opin. Neurol. 18 (5), 591-597 (2005).
- Sorensen, L., Molyneaux, L., Yue, D. K. The relationship among pain, sensory loss, and small nerve fibers in diabetes. Diabetes Care. 29 (4), 883-887 (2006).
- Lauria, G., Morbin, M., et al. Axonal swellings predict the degeneration of epidermal nerve fibers in painful neuropathies. Neurology. 61 (5), 631-636 (2003).
- Herrmann, D. N., McDermott, M. P., et al. Epidermal nerve fiber density, axonal swellings and QST as predictors of HIV distal sensory neuropathy. Muscle Nerve. 29 (3), 420-427 (2004).
- Navarro, X. Chapter 27: Neural plasticity after nerve injury and regeneration. Int. Rev. Neurobiol. 87, 483-505 (2009).
