Summary
Afin d'étudier les changements de fibres nerveuses nociceptives (intraépidermiques IENFs) dans les neuropathies douloureuses (PN), nous avons développé des protocoles qui pourraient examiner directement les modifications morphologiques tridimensionnels observés dans IENFs nociceptifs. Analyse tridimensionnelle de IENFs a le potentiel d'évaluer les changements morphologiques des IENF en PN.
Abstract
Une biopsie de la peau est couramment utilisé pour quantifier la densité des fibres nerveuses intraépidermiques (IENFD) pour le diagnostic de neuropathie périphérique 1,2. À l'heure actuelle, il est de pratique courante de collecter 3 biopsies cutanées mm de la jambe distale (DL) et la cuisse proximale (PT) pour l'évaluation des polyneuropathies dépendant de la longueur 3. Toutefois, en raison de la nature multidirectionnelle de IENFs, il est difficile d'examiner chevauchement structures nerveuses à travers l'analyse de l'imagerie en deux dimensions (2D). Alternativement, l'imagerie en trois dimensions (3D) pourrait fournir une meilleure solution à ce dilemme.
Dans le présent rapport, nous présentons les méthodes d'application de l'imagerie 3D pour étudier neuropathie douloureuse (PN). Afin d'identifier IENFs, des échantillons de peau sont traités pour l'analyse d'immunofluorescence d'un produit de gène de la protéine 9.5 (PGP), un marqueur neuronal casserole. À l'heure actuelle, il est de pratique courante pour diagnostiquer petits neuropathies de fibres en utilisant IENFD dissuaderminées par PGP immunohistochimie en utilisant la microscopie en fond clair 4. Dans la présente étude, nous avons appliqué double analyse d'immunofluorescence pour identifier IENFD totale, en utilisant PGP, et IENF nociceptive, grâce à l'utilisation d'anticorps qui reconnaissent la tropomyosine-récepteur-kinase A, le récepteur (Trk A) une forte affinité pour le facteur de croissance nerveuse 5. Les avantages de IENF co-marquage avec PGP et Trk anticorps de prestations de l'étude des PN par coloration clairement fibres PGP-positives, nociceptifs. Ces signaux de fluorescence peuvent être quantifiés pour déterminer les changements IENFD et morphologiques nociceptifs de IENF associés à PN. Les images fluorescentes sont acquises par microscopie confocale et traitées pour l'analyse 3D. 3D-imagerie fournit des capacités de rotation pour analyser plus avant les modifications morphologiques associées à PN. Pris dans leur ensemble, fluorescent co-marquage, l'imagerie confocale et l'analyse 3D bénéficient clairement de l'étude des PN.
Introduction
À l'heure actuelle, il est de pratique courante pour les médecins de quantifier la densité des fibres nerveuses intra-épidermique (IENFD) à partir de biopsies de peau poinçon, qui peuvent être utilisés pour diagnostiquer les petits neuropathies de fibres 3, 6-8. Les biopsies sont prises à partir de la jambe distale (DL), 10 cm au-dessus de la malléole externe, et la cuisse proximale (PT), 20 cm en dessous du épine iliaque antérieure 9. Tous IENF sont marquées d'utiliser le produit de gène de la protéine 9.5 (PGP), un marqueur neuronal pan 10-12. À l'heure actuelle, il est de pratique courante pour diagnostiquer petits neuropathies de fibres en utilisant IENFD déterminé par coloration avec PGP brightfield microscopie 6. En outre, plusieurs groupes de recherche ont utilisé des protocoles d'immunofluorescence pour PGP immunohistochimie 7-9. Neuropathie des petites fibres est souvent associée à la douleur neuropathique. Afin de mieux comprendre le rôle de IENF indispensables pour le traitement de la douleur, nous avons développé une technique de co-label IENF totale avec des fibres qui génèrent des douleurs. Nociceptive IENF, spécifiquement Aδ et les fibres de carbone, peuvent être étudiés à travers le co-marquage de IENF avec PGP et le marqueur nociceptive, tropomyosin-récepteur-kinase A (Trk A) 5. Trk A est le récepteur de haute affinité pour le facteur de croissance du tissu nerveux qui est essentiel pour le développement de la nociception. Les fibres nerveuses nociceptives A-positifs sont des fibres Trk peptidergiques qui expriment la substance P (SP) et la calcitonine de peptide lié au gène de (CGRP). Auparavant, Lauria et ses collègues ont appliqué la technique du double étiquetage pour étudier PN, co-marquage IENF PGP-positif avec un marqueur nociceptive 10. Dans notre précédente étude, nous avons démontré que Trk IENF A-positif, mais pas Trk IENF A-négatif, ont été régulés à la hausse dans un modèle animal de la neuropathie diabétique douloureuse 5. Cette technique de co-marquage permet de comparer la quantification des IENFD nociceptive au total IENFD et la possibilité d'étudier les changements morphologiques associés à PN. La capacité de visualiser nociceptive IENF et sociétésre quantification de IENFD total à IENFD nociceptive pourrait fournir une preuve objective de la présence de la douleur, et peut-être un aperçu de la gravité de la douleur associée à la PN. Cette technique est également applicable à la peau des modèles animaux. En comparaison avec les études précédentes, le protocole actuel décrit les méthodes d'analyse d'image 3D, créant la possibilité d'éviter des erreurs qui pourraient se produire dans l'analyse d'images 2D.
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Protocol
Partie A: immunohistochimie
Préparation de la plaque de 96 puits et la prévention de fond coloration biopsies de peau sont recueillies auprès de sujets humains et incubé pendant 12-24 heures dans la solution de fixation (paraformaldéhyde à 2% avec une solution de L-lysine 0,75 M (pH 7,4) et 0,05 mM periodate de sodium) à 4 ° C comme précédemment décrit 8. Les échantillons sont ensuite cryoprotégés en phosphate salin (PBS) tamponné avec 20% de glycérol à 4 ° C pendant 1 semaine, ancrée dans les milieux de montage de la température de coupe optimale (OCT), puis découpé en 50 sections um d'épaisseur sur un cryostat. Le protocole décrit ci-dessous est destiné à huit coupes de peau, le nombre maximal de coupes de peau possible de subir immunohistochimie flottant librement dans une plaque à 96 puits.
JOUR 1:
1. Prévention des Immunoréactivité non spécifique dans le stratum corneum
- Étiquette plaque 96 ainsi que le montre la figure 1. Ajouter 150 pi de Image-IT FX Signal (Image-IT), efficace pour bloquer la coloration de fond 11,12, dans chaque puits dans la rangée 1 de la plaque de 96 puits.
- Ajouter 150 pi de PBS 1X dans chaque puits dans la rangée 2 et 3 de la plaque de 96 puits.
- L'acquisition de deux sections de 50 um par patient: une section de la biopsie prise à DL, une section de la biopsie prise à PT. Une anse (LeLoop) est utilisé pour transférer des sections d'un rinçage à l'autre pour éviter d'endommager morphologique. Transférer délicatement chaque section de 50 um, en utilisant une anse, dans un puits individuel de rang 1, contenant l'image-IT. Incuber les coupes dans l'image-IT pendant 30 min à température ambiante sur un rocker plat.
- Rincer sections deux fois avec du PBS 1X (lignes 2 et 3) pendant 10 min à température ambiante. Placer la plaque et sur un rocker plat entre rinçages.
2. Préparation de 5% de BSA Solution de blocage et 1% solution de rinçage
- Alors que des coupes de biopsies sont en incubation dans Image-IT, préparer 5% blocage solutiontion (5% de BSA, 0,3%-100 TX, 0,1 M solution PBS-BSA Vortex jusqu'à dissolution complète).
- Ajouter 150 pi de solution de blocage de BSA 5% dans chaque puits de la rangée 4.
- En utilisant une anse, transférer sections dans des puits individuels d'une solution de blocage de 5% de BSA. Incuber les coupes dans une solution de blocage de BSA 5% pendant 1-2 heures à la température ambiante sur une bascule plat.
3. Préparation de 1% de BSA solution de rinçage et la dilution des anticorps primaires
- Tandis que les sections sont en incubation dans une solution de blocage de 5% de BSA, préparer une solution de rinçage de 1% (1% de BSA, 0,3% TX-100, 0,1 M solution PBS-BSA Vortex jusqu'à dissolution complète).
- Tandis que les sections sont en incubation dans une solution de blocage de 5% de BSA, diluer anticorps primaires dans 1% solution de rinçage.
- Pendant huit sections (8 x 150 pi = 1,200 pi), un total de 1.200 pi est nécessaire. Les anticorps primaires sont constitués en 1500 pl (sur un volume supplémentaire de 20%).
- Les dilutions des anticorps primaires: PGP, 1:500; Trk A,1:500 à 1% de BSA solution de rinçage.
4. L'incubation des biopsies sectionné Anticorps primaire
- Ajouter 150 ul d'anticorps primaires dilués dans les puits désignés de la plaque de 96 puits (ligne 5).
- Transfert sections de solution de blocage de 5% (Ligne 4) dans les puits d'anticorps primaires désignées (ligne 5).
- Sceller la plaque de 96 puits avec du parafilm et du papier d'aluminium pour éviter le dessèchement et exposition à la lumière.
- Incuber la plaque à 96 puits O / N à 4 ° C sur une bascule plat.
JOUR 2:
5. Rincer biopsies dans 1% BSA solution de rinçage
- Ajouter 150 pi de solution de rinçage de BSA 1% dans chaque puits dans la rangée 6, 7 et 8.
- Rincer sections trois fois avec une solution de rinçage de BSA à 1% (lignes 6, 7 et 8) pendant 1 heure à chaque fois à température ambiante. Couvrir la plaque et de papier d'aluminium et placer sur rocker plat entre rinçages.
6. La dilution des anticorps secondaires
<ol>- Pendant huit sections (8 x 150 pi = 1,200 pi), un total de 1.200 pi est nécessaire. Les anticorps secondaires sont constitués en 1500 pl (sur un volume supplémentaire de 20%).
- Des dilutions des anticorps secondaires: pour PGP (Alexa Fluor 488 âne anti-lapin, 1:250), pour Trk A (Alexa Fluor 647 âne anti-chèvre, 1:250) dans une solution de rinçage de la BSA 1%.
7. L'incubation des biopsies sectionné Anticorps secondaires
- Ajouter 150 ul d'anticorps secondaires dilués dans leurs puits désignés de la plaque de 96 puits (Ligne 9).
- Transfert sections de solution à 1% de BSA blocage (Ligne 8) en anticorps secondaire bien (Ligne 9).
- Sceller la plaque de 96 puits avec du parafilm et du papier d'aluminium pour éviter le dessèchement et exposition à la lumière.
- Incuber les coupes dans l'anticorps secondaire désigné O/ N à 4 ° C sur une bascule plate.
8. Rincer biopsies dans 1% BSA solution de rinçage
- Ajouter 150 pi de solution de rinçage de BSA 1% dans chaque puits dans la rangée 10, 11 et 12.
- Rincer sections trois fois avec une solution de rinçage de BSA à 1% (lignes 10, 11, et 12) pendant 1 heure à chaque fois à température ambiante. Couvrir la plaque et de papier d'aluminium et placer sur un rocker plat entre rinçages.
9. Préparation des lames de microscope et de montage biopsies sectionnés
- Alors que des coupes de biopsies sont en incubation dans la dernière eau de rinçage de la solution de rinçage BSA 1% (ligne 12), préparer des lames de microscope.
- Placez 50 pi de 1% solution de rinçage BSA sur une diapositive à l'autre.
- Supprimer des sections de 1% de solution de rinçage BSA (Ligne 12), et le placer dans la chute de 50 pi de solution de rinçage de BSA 1% sur la lame du microscope désigné. Après l'optimisation de la position de la section, enlever l'excès de solution de rinçage de BSA 1% avec une pipette en verre bulbe, en prenant des précautionspour éviter de toucher l'échantillon.
NOTE: Assurez-vous que la section ne soit pas plié; l'échantillon doit être à plat sur la surface de la lame de microscope.
- Placer 1 goutte d'or Prolongez antifade réactif montage avec DAPI près de la biopsie sur la lame du microscope. Jetez un microscope mm lamelle de verre 22x22 et placer délicatement sur une biopsie et une goutte de réactif Prolongez antifade or avec une chute DAPI. Répétez l'opération pour chaque section.
- Laissez lames de microscope sec O / N à température ambiante dans l'obscurité.
NOTE: Retirer les bulles d'air à l'aide d'une pipette. Essuyez l'excès de prolonger réactif antifade d'or.
Partie B: imagerie confocale
10. Imagerie confocale
- signaux de fluorescence de l'image en utilisant un Olympus FluoView 500 microscope confocal à balayage laser avec une immersion dans l'huile (1,3 NA) objectif et le zoom à deux reprises avec le logiciel version 5.0 de FluoView 40X. Utilisation Alexa Fluor 488 et Alexa Fluor 647 pour exciter le 543-nm laser HeNe vert et le laser HeNe rouge 633 nm, respectivement. Le signal Alexa Fluor 488 est représentée par un aspect vert table de consultation (LUT) et l'Alexa Fluor 647 par une LUT rouge.
- Définissez les ouvertures confocale pour chaque détecteur à 400 um à améliorer les signaux. Balayages séquentiels devraient être prises à une résolution de 1024 x 1024 pour maximiser la séparation du signal.
- Capturer trois dimensions Z-série en utilisant 1,2 um d'intervalles z étape (basé sur l'unité de numérisation optimale calculée par le logiciel FluoView) avec Kalman moyenne (deux cadres).
Partie C: visualisation en trois dimensions et d'animation
11. Trois dimensions (3D) Visualisation et animation
- Ouvrez des fichiers FluoView dans le logiciel Imaris x64 (version 7.3, Bitplane AG) pour visualiser les ensembles d'images 3D.
- Réglez afficher au besoin pour améliorer le contraste du signal spécifique nerf.
- Créer un surface de visualiser la limite dermo-épidermique. Utilisez l'outil de contour en mode DRAW pour dessiner la frontière.
- Attribuez une surface semi-transparente à la frontière afin de voir les signaux fluorescents sous-jacents.
- Capturer des images fixes des signaux de fluorescence 3D pour créer des images instantanées de l'animation 3D.
- Utilisez la fonction d'animation pour créer un film en 3D. Les images peuvent être tournés de 360 degrés à plusieurs reprises de montrer chaque signal séparément et fusionnés (figures 2, 3 et 4). Réglez animation pour créer des films constitués de 200 images animées à 15 images par seconde. Enregistrez chaque film comme un fichier AVI brut.
- Compresser le film AVI finale avec le logiciel VirtualDub (version 1.9.4).
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Representative Results
Nous avons appliqué le protocole actuel pour étudier la morphologie des IENF dans PT et DL biopsies cutanées de patients atteints de PN. La peau, à partir de trois sujets, ont été recueillis à l'Université de l'Utah pour démontrer la pathomorphologie associé avec PN. Les sujets suivants: Cas 1: un homme de 51 ans avec une histoire de PN du diabète de type 2 (durée: 14 mois; score de douleur: 51); Cas 2: un homme de 56 ans avec une histoire de PN du diabète de type 2 (durée: 108 mois; score de douleur: 47) et Cas 3: un homme de 66 ans avec une histoire de PN du diabète de type 2 (durée: 42 mois; score de douleur: 46). L'histoire et l'examen neurologique, y compris les tests sensoriels quantitatifs et des études de conduction nerveuse, ont été effectuées pour évaluer la neuropathie périphérique. Les scores de douleur ont été déterminés sur la base 0-100 échelle de douleur visuelle analogique.
En utilisant ce protocole, nous sommes en mesure d'étudier la structure 3D de IENFs dans la peau humaine (Figure 2). Dans la figure 2 (Figure 3). Imagerie 3D de gonflements axonaux, présentés dans la figure 3, montre que ces gonflements sont des structures globulaires répartis le long IENFs. En outre, ces méthodes peuvent être utilisées pour étudier ramification dans IENFs (Figure 4). Des images en 3D de ramification présenté dans la figure 4 montrent que des changements morphologiques ont lieu avec la présence de PN. Comme décrit précédemment, la frontière dermo-épidermique a été déterminée en fonction de la morphologie et l'orientation des nerfs et de la différence d'intensité des pixels entre le derme et l'épiderme 8. Le tracé bleu, représenté sur les figures 2, 3 et 4, Indique la jonction dermo-épidermique.
Figure 1. Schéma représentant l'installation d'une plaque de 96 puits pour biopsie de la peau immunohistochimie.
Figure 2. Images tridimensionnelles (3D) de IENF. Représentant l'image 3D (A) IENF PGP-positif, marqué vert, représentant IENF totale (première rotation à 360 °) et (B) Trk IENF A-positif, marqué rouge, représentant IENF nociceptive (deuxième rotation à 360 °), et (C ) une image fusionnée démontrer, IENF nociceptive PGP-positive (troisième rotation ° 360) dans un échantillon de peau de cas 1. Bar = 20 um. Cliquez ici pour voir le film.
Figure3. Image en trois dimensions (3D) des gonflements axonale dans IENF de PN. Image 3D représentant de gonflements axonaux (pointes de flèches) ainsi IENFs, marqués par PGP avec un signal vert, et dans le plexus sous-cutané dans un échantillon de peau de cas n ° 2. Bar = 10 um. Cliquez ici pour voir le film.
Figure 4. Image en trois dimensions (3D) de axonale ramification dans IENF de PN. Représentant l'image 3D de ramification axonale (pointes de flèches) le long IENFs, labellisé par PGP avec un signal vert, dans un échantillon de peau de cas 3. Bar = 20 um. Cliquez ici pour voir le film.
| Composantes de 5% de BSA Solution de blocage: | Montant nécessaire pour 12,5 ml |
| PBS 1X | 8.125 ml |
| 0,1% de Triton X-100 (TX-100) [Concentration finale: 0.03%] | 3,75 ml |
| Sérum albumine bovine (BSA) | 0,625 g |
| TOTAL | 12,5 ml |
Tableau 1. 5% de BSA solution de blocage.
| Composants de 1% solution de rinçage: | Montant nécessaire pour 12 ml |
| PBS 1X | 8.625 ml |
| 0,1% TX-100 [Concentration finale: 0.03%] | 3,25 ml |
| Sérum albumine bovine (BSA) | 0,125 g |
| TOTAL | 12 ml |
Tableau 2. BSA 1% solution de blocage.
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Discussion
Mesure de IENFD a été largement utilisé pour déterminer le degré de neuropathies périphériques 13,14. À l'heure actuelle, le protocole le plus couramment utilisé ne mesure que les densités de fibres nerveuses qui traversent la membrane basale de l'épiderme, elle ne tient pas compte de branchement axonal et / ou les modifications morphologiques des nerfs. En outre, l'analyse IENFD actuelle n'a pas été montré une corrélation IENFD avec la présence de la douleur chez PN 15.
Nous avons déjà indiqué que l'augmentation du nombre de IENFD nociceptive sont associées à des comportements de la douleur chez la souris db / db, un modèle murin de diabète de type 2 5. Dans ce rapport, nous avons appliqué un premier protocole en double immunofluorescence pour étudier IENF nociceptive. Dans l'étude actuelle, nous élargissons notre protocole à la peau humaine à partir de patients atteints de PN. La double analyse d'immunofluorescence permet de mesurer à la fois IENF totale et IENF nociceptive, le sous-ensemble de IENFs qui interviennentdouleur. Ces IENF nociceptive sont majoritairement positives pour Trk A et d'autres neuropeptides nociceptifs 5. Analyse d'immunofluorescence à double similaire à neuropathies douloureuses a été décrit par Lauria et ses collègues 10. Ils ont rapporté réduit IENFD pour transient receptor potentiel sous-famille canal de l'élément 1 (TRPV1) V de cations chez les patients ayant des neuropathies douloureuses. Le protocole actuel pourrait fournir une approche alternative pour la mesure de IENFD nociceptive basée sur nos données animales 5.
Le protocole actuel offre une approche 3D pour l'étude de la structure IENF. En combinaison avec double analyse immunofluorecent, le protocole actuel fournit des méthodes pour examiner la morphologie des IENFs nociceptifs. Des études antérieures n'ont pas fait état d'une association entre la densité ou la dérivation du IENF nociceptive avec PN. Ici, nous démontrons un protocole pour l'étude de branchement axonal et l'enflure dans IENFs de la peau humaine. Notre analyse suggère que cette 3D méthode pourrait être utilisée pour étudier les changements morphologiques des IENF en PN. En outre, l'imagerie 3D peut améliorer les protocoles actuels de mesure IENFD en évitant les erreurs qui sont associés à une réduction de la visualisation des structures qui se chevauchent associés à 2D-imagerie.
Gonflement axonal est défini comme un agrandissement d'une partie des axones d'un diamètre supérieur à deux fois celle du calibre axonal d'origine 16. Cette structure contient des fragments de cytosquelette et composants de transport axonal axonale. Gonflement axonal est considéré comme un signe précoce de la neuropathie axonale 6,16,17. Cependant, l'analyse 3D des structures axonales gonflement n'a pas été rapportée dans la littérature. Comme le montre la figure 3, l'imagerie 3D pourrait donner un aperçu important gonflement axonal associé avec PN.
Il est bien caractérisé qui axonale ramification accompagne la récupération d'une blessure du nerf 18. Toutefois, leméthodologie disponible pour quantifier axonale ramification est encore limitée basée sur l'imagerie 2D. Comme décrit dans la figure 4, axonale ramification pourrait être compliqué par la nature tortueuse des nerfs régénérants. Par conséquent, les points de branchement peuvent être masqués par les fibres nerveuses à proximité pour affecter la précision de quantification. L'analyse de l'imagerie 3D de notre protocole permet une meilleure visualisation des détails sur les nerfs de branchement.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt à déclarer.
Acknowledgments
Ce travail a été financé par les Instituts de subventions de la Santé nationale K08 NS061039-01A2, le Programme de recherche en neurologie et Discovery, et l'Institut Alfred Taubman Medical Research de l'Université du Michigan. Ce travail utilise la morphologie et l'analyse des images de base de la recherche sur le diabète Michigan et centre de formation, financée par les National Institutes of Health subvention 5P90 DK-20572 de l'Institut national du diabète et des maladies digestives et rénales. Les auteurs tiennent à remercier Robinson Singleton et Gordon Smith (Université de l'Utah) pour leur généreux don d'échantillons de peau humaine pour soutenir le développement initial de la technique d'immunohistochimie de biomarqueurs nociceptive.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X PBS | Fisher Scientific | BP399-4 | To make up 1X PBS |
| Image-IT FX Signal | Invitrogen | I36933 | Image-IT |
| Protein Gene Product 9.5 (Polyclonal rabbit) | AbD Serotec | 7863-0504 | PGP |
| Tropomyosin Related-Kinase A (Polyclonal goat) | R&D Systems | AF1056 | Trk A |
| Alexa Fluor 488 donkey α-rabbit | Invitrogen | A21206 | AF488 donkey α-goat |
| Alexa Fluor 647 donkey α-goat | Invitrogen | A21447 | AF647 donkey α-goat |
| Albumin, from Bovine Serum | Sigma-Aldrich | A7906-100 | BSA |
| Triton X- 100 | Sigma-Aldrich | T9284 | TX-100 |
| Non-calibrated Loop | LeLoop | MP 199025 | inoculating Loop |
| 96-well assay plate | Corning Incorporated | 3603 | Well plate |
| Prolong Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P36931 | DAPI |
| Microscope Cover Glass 22x22 mm | Fisher Scientific | 12-541-B | Coverslips |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | Microscope Slides |
| Olympus Fluoview Laser Scanning Confocal Microscope | Olympus | FV500 | Confocal Microscope |
| Optimum Cutting Temperature | Sakura | 4583 | OCT |
| Leica cryostat | Leica | CM1850 | Cryostat |
References
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