Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

وهناك طريقة للماوس البنكرياس جزيرة العزلة وبين الخلايا المخيم تقدير

Published: June 25, 2014 doi: 10.3791/50374
Automatic Translation
1, 2, 3, 2
1Department of Nutrional Sciences, University of Wisconsin-Madison, 2Department of Medicine, Division of Endocrinology, Diabetes, and Metabolism, University of Wisconsin-Madison, 3School of Pharmacy, University of Waterloo

Summary

يعاير في المختبر وظيفة β-الخلية باستخدام الماوس الجزر المعزولة لانجرهانز هو عنصر هام في دراسة الفيزيولوجيا المرضية السكري والعلاجات. في حين أن العديد من التطبيقات المتاحة المصب، ويصف هذا البروتوكول على وجه التحديد قياس الخلايا أحادي فسفات الأدينوزين الحلقي (المخيم) كمعلمة أساسية تحديد وظيفة خلايا β.

Abstract

سكر الدم غير المنضبط هو السمة المميزة لمرض السكري ويعزز حالة مرضية مختلفة مثل اعتلال الأعصاب، اعتلال الكلية، واعتلال الشبكية. مع الانتشار المتزايد لمرض السكري، وكلاهما مناعية من نوع 1 ونوع 2 المرتبط بالسمنة، والدراسات التي تهدف إلى ترسيم الفيزيولوجيا المرضية السكري والآليات العلاجية هي ذات أهمية حاسمة. الخلايا β لجزر لانجرهانز في البنكرياس المسؤولة عن إفراز الأنسولين بشكل مناسب في استجابة لتركيزات السكر في الدم مرتفعة. بالإضافة إلى الجلوكوز والمواد المغذية الأخرى، يتم تحفيز خلايا β أيضا هرمونات محددة، ووصف incretins، والتي تفرز من الأمعاء ردا على وجبة والعمل على مستقبلات خلايا β التي تزيد من إنتاج الخلايا أحادي فسفات الأدينوزين الحلقي ( المخيم). انخفاض وظيفة الخلايا β-، الشامل، والاستجابة incretin هي مفهومة جيدا للمساهمة في الفيزيولوجيا المرضية لمرض السكري من النوع 2، ويجري أيضا مرتبطة على نحو متزايد وايال داء السكري نوع 1. الماوس الحاضر جزيرة العزلة ومخيم بروتوكول تقرير يمكن أن يكون أداة للمساعدة في ترسيم آليات تعزيز تطور المرض والتدخلات العلاجية، وخاصة تلك التي يتم بوساطة المستقبلات incretin أو المستقبلات التي تعمل من خلال تعديل الإنتاج المخيم الخلايا ذات الصلة. في حين سيتم وصفها القياسات المخيم فقط، بروتوكول جزيرة العزلة وصفها يخلق إعداد النظيفة التي تسمح أيضا للعديد من التطبيقات المصب الأخرى، بما في ذلك الجلوكوز حفز افراز الانسولين، [3 H] ثيميدين-التأسيس، وفرة البروتين، والتعبير مرنا.

Introduction

صيانة صارمة من سوائية سكر الدم أمر حتمي لمنع حالة مرضية مختلفة مثل اعتلال الأعصاب، اعتلال الكلية، واعتلال الشبكية، وهي كلها بصمات علم الأمراض من نوع غير المنضبط 1 و 2 من مرض السكري 1. انخفاض وظيفة الخلايا β والشامل في كل نوع 1 و 2 من مرض السكري التشويش على تركيز الجلوكوز في الدم 2. في حين أن نوع مناعية 1 نتائج مرض السكري من خسارة مدمرة لخلايا β-المنتجة للانسولين، وضعف إفراز الأنسولين خلايا β وإشارات الأنسولين الطرفية في مرض السكري من النوع 2 معا تعزيز ارتفاع السكر في الدم، دسليبيدميا، وزيادة إنتاج الجلوكوز في الكبد، مما يؤدي في نهاية المطاف في كلا فقدان القدرة كتلة خلايا β والانسولين إفرازية من فرد خلايا β 3. وفهم آليات خلايا β الكامنة في تطور النوع 2 من مرض السكري 1 و إعطاء أمل يؤدي إلى علاجات جديدة لمنع وعلاج هذه الأمراض.

منظمة الشفافية الدولية في المختبرنماذج الثقافة ssue، مثل INS-1 وMIN6 خلد خطوط الخلايا β-، يمكن أن تكون أدوات مفيدة لفهم وظائف الخلايا β محددة. ومع ذلك، فإن التفاعلات بين أنواع مختلفة من الخلايا داخل جزيرة أنفسهم قد تنظم وظيفة الخلية β. على سبيل المثال، تأثير نظير الصماوي من الجلوكاجون (أفرج عنه من الخلايا α) والسوماتوستاتين (أفرج عنه من الخلايا δ) في زيادة وخفض إفراز الأنسولين، على التوالي، يدل على أهمية القرب خلية خلية في استجابة الغدد الصماء 4. علاوة على ذلك، تقاطعات الفجوة بين خلايا β تحفيز الافراج عن الانسولين 5. علاوة على ذلك، رغم ما اتخذ من خطوات في توليد خطوط ورم جزيري أن تكرارها بشكل أفضل الاستجابة الفسيولوجية من الجزر المعزولة إلى جلوكوز (على سبيل المثال، INS-1-مشتقة 832/13 و832/3 خطوط الخلايا)، والاستجابة الجلوكوز لا يزال يختلف من الفئران العادية الجزر 6،7. وعلاوة على ذلك، واستجابة لهذه خطوط الخلايا ورم جزيري النسيليلالببتيد-1 (GLP-1) منبهات مثل الجلوكاجون يمكن أن تختلف بشكل كبير عن بعضها البعض، وكذلك من الجزر الطبيعية 6. وبالتالي، خطوط الخلايا خلد قد لا تمثل أفضل نموذج لمعايرة العوامل التي تؤثر على إنتاج المخيم.

وعلى النقيض من خطوط الخلايا المشتقة من ورم جزيري، ودراسة وظيفة خلايا β فقط في النماذج الحيوانية كلها تقدم مجموعتها الخاصة من المضاعفات. واحدة من أكبر التحديات في العمل مع أنسجة الغدد الصماء وقياس تركيز دقيق لهرمون يفرزه الجسم. على وجه التحديد، والكبد يلعب دورا رئيسيا تأييض الأنسولين، وتدفق الدم البنكرياس يذهب مباشرة إلى الكبد. وهكذا، فإن قياس الانسولين البلازما قد لا تصور بدقة كميات الأنسولين التي يفرزها البنكرياس من نفسه أو تأثير العلاجات المختلفة على معدل إفراز الأنسولين 8. وعلاوة على ذلك، والتمثيل الغذائي الكلوي من الجلوكاجون قد تحد من الاعتماد على الانتاج الجلوكاجون من خلايا جزيرة α 9. لذلك، عزل الجزر الماوس الأساسي للالتجريب في المختبر يوفر فهما أكثر دقة عن كيفية جزيرة يستجيب للمؤثرات محددة لاستكمال القياسات التي أجريت في الجسم الحي.

هذا البروتوكول لعزل الجزر الماوس هو بروتوكول الراسخة التي يستخدمها عدد من المجموعات (مع بعض التعديلات الطفيفة التي قد تساعد على زيادة النجاح) 10،11. بالإضافة إلى ذلك، تحديد الإنتاج المخيم يسمح لقراءة المغادرة مباشرة للاستجابة incretin للخلايا β. بالتزامن مع قياس المخيم، ومحتوى البروتين إفراز الأنسولين كما يمكن كميا من نفس العينة المخيم الإعدادية، مما يساعد على تحديد ما إذا كان وجود خلل في وظيفة خلايا β يكمن الداني القاصي أو إلى معسكر 10. المحتوى المخيم النهائية وتطبيق إفراز الأنسولين في هذا البروتوكول يمكن أن يكون أداة قوية جدا لفهم تأثير المكونات الدوائية والغذائية، من بين أمور أخرىق، في المخيم وإفراز الأنسولين. بالإضافة إلى التحفيز من الجلوكوز وحده، ومركبات أخرى يمكن استخدامها لقياس التغيرات في المخيم وافراز الانسولين 10،11.

أخيرا، على الرغم من أن الأنسولين هو الهرمون الأساسي أننا مقايسة من الجزر المعزولة، والهرمونات الأخرى، مثل الجلوكاجون والسوماتوستاتين، فضلا عن السيتوكينات، eicosanoids، وأحادي فسفات الأدينوزين الحلقي، ويمكن أيضا أن تقاس، إما عن طريق تحفيز مقايسة عابرة أو عن طريق التحديد الكمي لل مستوياتها في مستنبت 12. أخيرا، على الرغم من خارج نطاق هذه المخطوطة، والعزلة جزيرة مع أسلوب كولاجيناز العزلة وصفها يسمح للحفاظ على جزيرة بحيث يمكن السعي العديد من التطبيقات المصب الأخرى، مثل زرع جزيرة، عزل الحمض النووي الريبي في الوقت الحقيقي PCR الكمي أو ميكروأري التحليلات، البروتين العزلة عن النشاف الغربية، جزيرة التضمين والتصوير مناعي، وإدماج [3H]-ثيميدين كمقياس للrepli خلايا الجزيرةالموجبة، وبعضها قد تم وصفها في مقالات سابقة إن الرب 13-16. عموما، بعد إجراء العزل جزيرة موضح في البروتوكول قد توفر الباحث بمعلومات هامة ومفيدة لتطوير علاجات وتشجيع اكتشاف المخدرات التي تهدف إلى تعزيز وظيفة خلايا β.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وأعدم جميع التجارب على الحيوانات في الامتثال لجميع المبادئ التوجيهية واللوائح والوكالات التنظيمية ذات الصلة. تم إجراء بروتوكول يتم شرحها تحت إشراف وموافقة اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام (IACUC) من جامعة ويسكونسن ماديسون.

1. إعداد حلول

  1. طريقة القتل الرحيم في هذا البروتوكول هو استنزاف تحت التخدير آفيرتين (لاستعراض البدائل، انظر مناقشة). لجعل آفيرتين، إضافة 0.625 غرام (1.25٪ أو 44.2 ملم) من 2-2-2 ثلاثي بروم إيثانول إلى 1.25 مل من 2 ميثيل-2-بيوتانول في أنبوب 15 مل المخروطية والحرارة عند 37 درجة مئوية لمدة 20-30 دقيقة. دوامة الحل على ارتفاع لمدة 10-15 ثانية في وقت لتذوب تماما ثلاثي بروم إيثانول 2-2-2. مرة واحدة يذوب بالكامل، إضافة إلى حل 48.75 مل من ضعف H 2 O المقطر، تصفية من خلال مرشح 0.45 ميكرون إلى 50 مل أنبوب مخروطي الشكل الجديد، والتفاف 50 مل مخروطيآل أنبوب في رقائق الألومنيوم وتخزينها في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد. جعل أنبوب لRT قبل حقن الفئران.
  2. لجعل محلول الملح هانكس 'المتوازن (HBSS)، ويشكلون 1 L 1X HBSS من 10X الأسهم (GIBCO، تقنيات الحياة، كارلسباد، كاليفورنيا) في ضعف H 2 O المقطر، إضافة 0.35 غ (4.2 ملم) ناتشو 3، ومخزن في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 1 في الشهر. لكل الماوس، سوف تكون هناك حاجة 105 مل من هذا الحل (بالإضافة إلى 5-10 مل اضافية لpipetting لخطأ) لجزيرة العزلة.
  3. الجزر معرضة جدا للضرر ميتة؛ لذلك، وفقاعات HBSS مع 95٪ O 2/5٪ CO 2 لتقليد تركيزات O 2 في الدم. ويمكن شراء يمزج الغاز خاصة ومحطة محتدما اقامة مع ماصة باستور تعلق على أنابيب مرنة. بعد محتدما المبلغ المطلوب من HBSS مع 95٪ O 2/5٪ CO 2 لمدة 15 دقيقة، إضافة 0.02٪ ريا الصف BSA (ألبومين المصل البقري) من حيث الحجم والحفاظ على الجليد لصemainder من عزلة جزيرة.
  4. لإعداد Ficoll، تزن 32.5 غرام من خارج Ficoll في كوب 400 مل، إضافة 80 مل من HBSS، ويقلب في 500-700 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة. مرة واحدة المنحل، من أجل حل Ficoll إلى 250 مل تخرج اسطوانة وإضافة HBSS إلى علامة 130 مل على اسطوانة تخرج لإيجاد حل Ficoll 25٪. تغطية الجزء العلوي من الاسطوانة مع اثنين من أجزاء من parafilm ® M (بيشيني بلاستيك شركة التعبئة والتغليف، شيكاغو، IL) ويهز بقوة عدة مرات.
  5. ل23٪، 20.5٪، و 11٪ Ficoll الحل، إضافة 27.6، 24.6، و 13.2 مل من Ficoll 25٪، على التوالي، إلى 50 مل أنابيب مخروطية. ثم، وجلب كل حل تصل إلى ما مجموعه 30 مل مع HBSS ويهز جيدا لخلط. يجب أن يتم تخزين كل أربعة حلول Ficoll في 4 درجات مئوية وجيدة لتصل إلى 2 أسابيع.
  6. يتم تحضير محلول كولاجيناز التي هي مناسبة لعزل الجزر نشطة من كولاجيناز معزولة عن كلوستريديوم حال للنسجأم (الجدول مواد). كل الكثير يحتاج إلى الخضوع لاختبار الكفاءة الانزيم. عادة، يتم استخدام كولاجيناز في 0.3-0.5 ملغ لكل مل من HBSS. استخدام تركيزات الإنزيم في هذا النطاق (عادة 3 تركيزات مختلفة)، وتحديد نوعية وكمية من الجزر المعزولة من الفئران المتطابقة العمر أو تتزاحم لتعيين تركيز انزيم العمل.
  7. مرة واحدة يتم تحديد التركيز الصحيح، يتطلب كل فأر 35 مل من كولاجيناز في HBSS لبروتوكول العزلة بأكملها. دوامة كولاجيناز في HBSS حل. على الفور قبل الجراحة، قبل تحميل حقنة 5 مل مع حل كولاجيناز، وضع قنية على وإزالة فقاعات الهواء، وترك على الجليد لحين الحاجة إليها.
  8. وسائل الإعلام والثقافة للجزيرة O / N الحضانة هو تستكمل 1640 RPMI وسائل الإعلام. من أجل حل الأوراق المالية، بحل واحد 1640 RPMI حزمة (GIBCO، نيويورك) في 1 لتر من ضعف H 2 O المقطر وإضافة 1.19 غ HEPES (5 ملم) و 2 ز 3 ناتشو (24 ملم). ضبط درجة الحموضة إلى 7.4،فلتر تعقيم، وتخزينها في 4 درجات مئوية في الظلام.
  9. لوسائل الإعلام تستكمل، إضافة 10٪ FBS و 100 IU/100 ميكروغرام / مل البنسلين / الستربتوميسين، على التوالي، إلى وسائل الإعلام الأسهم RPMI 1640. إذا كان المطلوب تركيز الجلوكوز مختلفة، خالية من السكر في 1640 RPMI وسائل الإعلام ويمكن استخدام وتركيز محددة من الجلوكوز يمكن أن يضاف.
  10. لقارع الأجراس كريبس الأسهم بيكربونات العازلة (كريبس)، إضافة المكونات التالية لمضاعفة الماء المقطر في التركيزات التالية: كلوريد الصوديوم (118.41 ملم)، بوكل (4.69 ملم)، MgSO 4 (1.18 ملم)، KH 2 PO 4 (1.18 ملم )، ناتشو 3 (25 ملم)، HEPES (5 ملم)، وو CaCl 2 (2.52 ملم) في درجة الحموضة 7.4. و CaCl 2 ينبغي أن تضاف الماضي ويمكن تخزين هذا الحل في 4 درجات مئوية لمدة تصل الى 2 أسابيع.
  11. لجعل مخزون عمل كريبس والغاز الأولى مع 95٪ O 2/182 5٪ CO 2 لمدة 10-15 دقيقة مع ماصة باستور عند 37 درجة مئوية تليها إضافة 0.5٪ ريا الصف BSAمن حيث الحجم. المقبل، يتم إضافة الجلوكوز إلى التركيز المطلوب للفحص في المختبر.

2. إعداد أدوات

  1. فظة قليلا نصائح من 30 - 27 والإبر-G باستخدام الحجر شحذ لجولة قبالة نقطة حادة. وضع الانحناء 45 درجة في الإبرة حوالي ¼ من شبر واحد من الطرف باستخدام زوج من كماشة. يجب الحرص على عدم الضغط من الصعب جدا، والتي سوف تغلق القطر الداخلي للإبرة.
  2. قطع الخيط 3/0 خياطة الحرير إلى حوالي أطوال 4 بوصة، واحد لكل الماوس.
  3. تغطية قاعدة المجهر تشريح مع الاغطية البلاستيكية والشريط أسفل.
  4. قطع عدة قطع من الورق ماصة مقاعد البدلاء، وحوالي 3 × 5 بوصة في الحجم، ل2 في الماوس على الأقل.

3. إعداد ماوس

  1. ملء حقنة 1 مل مع 1 مل آفيرتين.
  2. حقن محلول AVERTIN الغشاء البريتونى في حوالي 40 ميكرولتر / غرام من وزن الجسم.
  3. بعد الماوس لا لonger يستجيب إلى الذيل أو القرصات القدم الخلفيتين، ونقل بعناية لمحطة العمل المجهر تشريح.
  4. مع الماوس في موقف ضعيف ورئيسها تواجه بشكل أقصى، ورذاذ الفأر مع الايثانول 70٪ مائي. تأكد من استخدام كمية كافية من الإيثانول بنسبة 70٪ للحد من كمية من الفراء في التجويف الصدري عرضة للخطر.

4. فتح تجويف الصدر

  1. قرصة الفراء والجلد من الفأرة بين اثنين من رجليه الخلفيتين وإجراء خفض الأولية من خلال البشرة، الأدمة والغشاء الأساسي.
  2. في حين لا تزال معسر الجلد والأغشية الكامنة، وقطع نحو الطرف الأمامي على جانبي الماوس مع الحرص على تجنب قطع أي من أجهزة الداخلية.
  3. أضعاف الجلد والغشاء رفرف فوق القفص الصدري وإزالة عملية الخنجري للسماح سهولة الوصول إلى البنكرياس للتضخم.
  4. إعادة توجيه الماوس مع رئيس تواجه قريب ونقل الأعضاء الداخلية نحو الجانب الأيمن من شارع العملأوجه للكشف عن الشريان الأورطي النازل.
  5. إلا الأنسجة الدم التي سيتم جمعها، ويمكن خفض الشريان الأورطي النازل لاستكمال euthanization. امتصاص الدم الزائد مع ورقة مقاعد البدلاء أو Kimwipe لتسهيل الوصول إلى القناة الصفراوية المشتركة.

5. تضخيم البنكرياس

  1. مع مجهر تشريح، إعادة الأمعاء الدقيقة حتى القناة الصفراوية المشتركة تشكل خط عمودي مع رئيس الماوس.
  2. اتخاذ ملقط وفهم الأمعاء الدقيقة والعثور على المصرة من أودي (المصرة للأمبولة) في نهاية القناة الصفراوية المشتركة، والتي splays الخروج إلى الأمعاء الدقيقة من القناة الصفراوية، وتشكيل مثلث أبيض على الأمعاء الوردي. مرة واحدة وقد يقع العضلة العاصرة من أودي، واتخاذ # 5 ملقط دومون وحرك طرف تحت القناة الصفراوية المشتركة أقرب إلى الأمعاء الدقيقة وقت ممكن، والحرص على عدم اختراق القناة.
  3. بعد ثقب من خلال الأمعاء الدقيقة والأنسجة الضامة، استخدمغيض من ملقط دومون لفهم خياطة وتسحبه تحت القناة الصفراوية المشتركة. ربطة عنق من القناة الصفراوية المشتركة أقرب إلى المصرة من أودي وقت ممكن، والتأكد من عقدة هو مشدود لمنع التسرب.
  4. فهم طرفي الخيط وسحب نحو الذيل لوضع بعض التوتر على القناة الصفراوية المشتركة. استخدام اليد الحرة، وجعل شق صغير مع المقص الصغير في القناة الصفراوية المشتركة فقط فوق التشعب مشاركة في الكبد. ملاحظة: من المهم أن لا قطع قريبة جدا من المصرة من أودي وهذا يمكن أن يؤدي إلى التضخم الجزئي للالبنكرياس وتجنب القطع من خلال القناة الصفراوية المشتركة لأنها سوف تؤدي أيضا في التضخم الفقراء.
  5. في حين الضغط على طرفي سلسلة مع القناة الصفراوية المشتركة مشدود، وإزالة حقنة / قنية التي تم تحميلها مسبقا مع 5 مل من محلول كولاجيناز من دلو الثلج، المنصوص عليها الحقنة، وإدراج اضعافها 30 G الإبرة في خفض القناة الصفراوية المشتركة، والحرص على عدم اختراق من خلال واليرة لبنانية من القناة. إذا كانت إبرة 30 G ليست واسعة بما فيه الكفاية لقناة الصفراء على شكل خاتم حولها، وإزالته واستبداله مع اضعافها 27 G الإبرة.
  6. في حين عقد الإبرة في المكان، والإفراج عن خياطة والتقط حقنة 5 مل. خفض ببطء المكبس من المحاقن. ملاحظة: إذا تم إدخال الإبرة بنجاح في القناة الصفراوية المشتركة، فإنه سيتم التوسع.
  7. مواصلة خفض المكبس ببطء والسماح قبالة بطريقة نابض حتى الجزء الأول من البنكرياس انتفاخ، تليها ضغط لطيف مستمر حتى البنكرياس الوسادة لم يعد. ملاحظة: معظم البنكرياس عقد 3-5 مل قبل البدء في تسرب. أيضا، فإن التضخم ناجحة لها حتى توزيع الأنسجة الإفرازية وسوف يكون مبالغا جزء من البنكرياس على الجزء العلوي من المعدة.
  8. إزالة الإبرة من القناة الصفراوية المشتركة وانطلقت إلى الجانب.

6. إزالة البنكرياس

  1. اتخاذ ملقط في يد واحدة ومقص منحني فيمن جهة أخرى. باستخدام ملقط، فهم الأمعاء الدقيقة في المصرة من أودي. مع إغلاق المقص، استخدم تلميح إلى جزء منفصل من البنكرياس من الأمعاء الدقيقة.
  2. نشر مقص حدة لتوسيع الفجوة بين الأمعاء الدقيقة والبنكرياس.
  3. وضع "V" من مقص حيث الأمعاء الدقيقة والبنكرياس نعلق على بعضها البعض في الجانب الأيمن من الفجوة التي كان أدلى به للتو. باستخدام ملقط سحب بلطف الأمعاء الدقيقة الماضية المقص لإزالة البنكرياس.
  4. الاستمرار في العمل أسفل الأمعاء الدقيقة للأنسجة الضامة الوردي. عند هذه النقطة، والتقاط الأمعاء الدقيقة القريب حيث تعلقها على المعدة والبنكرياس قص بعيدا عن بقية الأمعاء الدقيقة. ملاحظة: الحرص على عدم قص البنكرياس لأنها قد تبدأ في تنكمش.
  5. انتزاع بلطف جزء من البنكرياس تعلق على المعدة مع ملقط (ملقط مسطحة تعمل بشكل أفضل). في حين سحب ما يصل بلطف على البنكرياس، استخدم منحنىمقص د قص بعيدا في الاتصالات بين البنكرياس والمعدة.
  6. حدد موقع الطحال وأنه عقد مع ملقط فوق البنكرياس. اتخاذ مقص منحني وقطع الاتصالات بين الطحال والبنكرياس.
  7. البحث حيث يتم إرفاق البنكرياس إلى الأمعاء الغليظة. التقاط الأمعاء الغليظة مع ملقط واستخدام غيض من مقص لكزة من خلال. نشر مقص بعيدا كما كان من قبل لتوليد الفجوة بين الأمعاء الغليظة والبنكرياس.
  8. تصمد في الأمعاء الغليظة مع ملقط: هذا سيؤدي في البنكرياس تقع بعيدا، وفضح ارتباطاتها دقيقة إلى الأمعاء الغليظة. قص بعيدا اتصالات المتبقية.
  9. العثور على النسيج الضام وردي تعلق على البنكرياس والأمعاء الدقيقة وقطع أقرب إلى البنكرياس ممكن. ملاحظة: إذا ثقب في البنكرياس هو مصدر قلق، وينصح لخفض أقرب إلى الأمعاء الدقيقة حيث سيتم تصفيتها النسيج الضام في خطوات لاحقة.
  10. Gراب قدر من البنكرياس ممكن ورفعه بلطف. مع مقص منحني، وقطع المسافة المتبقية الاتصالات بين البنكرياس والتجويف الصدري لإزالة بالكامل البنكرياس. ملاحظة: يجب أن يكون لا يزال تضخم البنكرياس إذا أزيلت بشكل صحيح.
  11. تخزين البنكرياس في إزالة ~ 2.5 مل من محلول كولاجيناز في أنبوب 50 مل المخروطية على الجليد حتى تضخمت جميع البنكرياس الأخرى وإزالة للتجربة.

7. الغسل

  1. اتخاذ جميع البنكرياس معزولة ونقلها إلى فصل أنابيب مخروطية 50 مل تحتوي كل منها على 25 مل من محلول كولاجيناز جديدة
  2. وضع أنابيب مخروطية 50 مل تستقيم في 37 ° C تهز حمام مائي قادر على تتأرجح في 220-250 دورة في الدقيقة، مع شاكر إيقاف.
  3. الغاز كل أنبوب 50 مل المخروطية مع 95٪ O 2/5٪ CO 2 لمدة 5 دقائق مع ماصة باستور.
  4. باختصار كل أنبوب بإحكام ووضع جانبية في الماء تهتزحمام تحت سطح الماء. يهز في 220-250 دورة في الدقيقة لمدة 20 ثانية، كل دقيقة أخرى، ما يصل إلى 16 دقيقة ابتداء من الساعة 6 دقيقة. (هزة في 6، 8، 10، 12، 14، و 16 دقيقة)
  5. نقل على الفور إلى أنابيب جهاز للطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة لتدور سريعة. جعل أجهزة الطرد المركزي تصل إلى 1،500 دورة في الدقيقة (400-500 ز) وإيقاف فورا.
  6. باستخدام فخ الفراغ، نضح حوالي 22.5 مل من محلول كولاجيناز دون الإخلال بيليه. تغسل مع 10 مل HBSS ودوامة بلطف لتفريق بيليه.
  7. تدور أداء سريع آخر في درجة حرارة الغرفة ما يصل إلى 1،500 دورة في الدقيقة (400-500 ز).
  8. نضح حوالي 10 مل من الحل، ومرة ​​أخرى من دون إزعاج بيليه.
  9. تغسل مع 10 مل أخرى من الجليد الباردة HBSS ودوامة بلطف لكسر مرة أخرى حتى بيليه. تكرار تدور ونضح السريع 10 مل من الحل.
  10. دوامة بلطف بيليه في 2.5 مل المتبقية من حل HBSS. صب حل من خلالشبكة 1،000 ميكرومتر إلى 50 مل أنبوب مخروطي الشكل الجديد. سيؤدي ذلك إلى إزالة الحطام الأنسجة كبيرة لا يهضم من قبل كولاجيناز.
  11. شطف القديمة أنبوب 50 مل المخروطية مع 2.5 مل من الجليد الباردة HBSS. استخدام ماصة باستور لشطف جانبي الأنبوب جيدا قبل نقل مل 2.5 من HBSS من خلال شبكة جديدة في أنبوب 50 مل المخروطية.
  12. تدور أداء سريع آخر في درجة حرارة الغرفة في 1،500 دورة في الدقيقة (400-500 ز) لتكوير الأنسجة.
  13. نضح كل من HBSS عن طريق إمالة الأنبوب نحو فخ الفراغ. ملاحظة: من المهم جدا أن لا تعكر صفو بيليه لأن هذا سيؤدي إلى فقدان الجزر. إذا كان بيليه هو فضفاض أو يبدأ في التحرك نحو فخ الفراغ، ووقف الشفط الحل وإعادة بيليه-الأنسجة ومن ثم الاستمرار في نضح الحل المتبقية.
  14. مرة واحدة تمت إزالة جميع HBSS، إضافة 4.8 مل من 25٪ محلول Ficoll ودوامة لتفريق بيليه.
  15. طبقة بعناية 2.4 مل من 23٪ محلول Ficoll على أعلى من 25٪ Ficoll الحل بإضافة 23٪ Ficoll حل للجانب أنبوب 50 مل المخروطية. لضمان حتى طبقات، وتناوب على 50 مل أنبوب مخروطي عند إضافة محلول Ficoll.
  16. تكرار عملية التصفيف 20.5٪ ثم 11٪ الحلول Ficoll. ملاحظة: إذا 4 طبقات متميزة لم تكن موجودة، إضافة HBSS حتى العلامة 50 مل وعكس أنبوب 4-6 مرات أو حتى التدرج Ficoll لم يعد موجودا. إعادة بيليه الأنسجة وإعادة المحاولة الخطوات 7،14-7،16.
  17. تدور أنبوب 50 مل المخروطية في RT في 1،820 دورة في الدقيقة (800 غ) لمدة 15 دقيقة.
  18. صب كل من Ficoll في أنبوب 50 مل المخروطية الطازجة، مع الحرص على ترك بيليه من الأنسجة الإفرازية وراء. إضافة الجليد الباردة HBSS حتى العلامة 50 مل وعكس أنبوب 4-6 مرات لخلط Ficoll وHBSS معا.
  19. تدور أنبوب 50 مل المخروطية في RT في 1،820 دورة في الدقيقة (800 غ) لمدة 5 دقائق.
  20. نضح بعناية معظم خليط HBSS / Ficoll باستخدام الهيئة فراغع. لا تعكير صفو بيليه كما هو فضفاض ويمكن أن يستنشق بسهولة.
  21. اتخاذ ماصة باستور ونقل بيليه إلى أنبوب ثقافة المتاح.

8. اختيار الفشوت

  1. إضافة 5 مل من وسائل الاعلام التقاط (أي. تستكمل 1640 RPMI أو قارع الأجراس كريبس بيكربونات الاحتياطي) إلى أنبوب ثقافة المتاح. ملاحظة: سوف تختلف وسائل الإعلام التقاط اعتمادا على تطبيقات المصب.
  2. دعونا الجزر تستقر في قاع الأنبوب الثقافة لمدة 5 دقائق. نقلها باستخدام ماصة باستور إلى 15 مم بنسبة 60 مم طبق بيتري البوليسترين. ملاحظة: من المهم لاستخدام طبق بتري كما لا يتم التعامل مع هذه وسيمنع الجزر من الانضمام إلى الطبق.
  3. في ملف 15 مم بنسبة 60 مم البوليسترين طبق بيتري، إضافة 5 مل من الماوس سائل الإعلام والثقافة جزيرة (100 مل 1640 RPMI الأسهم وسائل الإعلام، و 10 مل FBS الحرارة المعطل، 1 مل القلم / بكتيريا؛ تصفية تعقيمها).
  4. بمساعدة مجهر تشريح مع backligقدرة حزب التحرير، واستخدام P-20 ماصة لاختيار الجزر في طبق بتري تحتوي جزيرة سائل الإعلام والثقافة، مع الحرص على تجنب نقل عنيبية الحطام الأنسجة. عندما الخلفية، وسوف تظهر الجزر البني والذهب والغشاء الخارجي لها قد معان، بينما الأنسجة عنيبية سيظهر رمادي فاتح ومملة. إذا كان إعداد جزيرة يحتوي على كمية كبيرة من الحطام، فإنه من المستحسن أن ناحية اختيار الجزر مرتين في متوسطة جديدة. والحد من التلوث الحطام تحد جزيرة التثاقل بعد الحضانة بين عشية وضحاها. مضيفا الدناز (3،000 U / مل) إلى المخزن المؤقت الهضم قد يساعد أيضا على الحد من جزيرة التثاقل (JWJ، الملاحظة الشخصية). ملاحظة: من المهم لحساب عدد من الجزر المعزولة في التخطيط لتجارب المصب.
  5. احتضان الجزر O / N في حاضنة تعيين إلى 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2.

9. الفحص المخيم

  1. تسمية 1.7 مل أنابيب microfuge، واحدة لكل تكرار للمقايسة. ملاحظة: يجب أن يكون المقايسات المخيم على الأقل دوويفضل plicates لكل حالة العلاج، ولكن أكثر مكررات لكل معاملة.
  2. بعد القتل بالغاز في كريبس قارع الأجراس بيكربونات العازلة لمدة 15 دقيقة مع 95٪ O 2/5٪ CO 2 مع ماصة باستور، إضافة 0.5٪ BSA ريا الصف وتركيز الجلوكوز النهائي من 1.7 ملم (حل حضن مسبق). ثم، إضافة 1 مل من كريبس بالغاز حديثا إلى كل microfuge أنبوب. اثنين مل من كريبس مطلوب في أنبوب لنقطة ما قبل الحضانة ووقت العلاج؛ ومع ذلك فمن المستحسن أن يعد 5-10 مل على الأقل إضافية.
  3. دوامة الجزر إلى منتصف طبق بيتري، واستخدام P-20 ماصة، ومن ناحية اختيار الجزر إلى الجديد 15 مم بنسبة 60 مم البوليسترين طبق بتري تحتوي على 5 مل من محلول لغسل حضن مسبق الثقافة المتوسطة التي تحتوي على الجلوكوز من الجزر.
  4. عدة المخيم الفحص المستخدمة هي GE للرعاية الصحية المخيم المباشر BioTrak EIA. وتستخدم prococol هو تعديل لتلك التي وصفها ل "الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف المخيم بين الخلاياوقد تم تحسين urement باستخدام الإجراء EIA غير أستلة مع الكواشف تحلل الرواية، "وللاستخدام مع الحد الأدنى لعدد الجزر في أنبوب، مما يتيح زيادة أعداد ظروف العلاج ومكررات التقنية. استخدام P-20 ماصة، ونقل ما لا يقل عن 13 الجزر في كل أنبوب من الخطوة 9.2، والحفاظ على حجم جزيرة الاتساق بين أنابيب، مع 1 مل العازلة قبل الحضانة. ملاحظة: زيادة عدد مكررات هو أكثر فائدة من عدد من الجزر في أنبوب. ومع ذلك، إذا كان هناك ما يكفي من الجزر الصغيرة لزيادة عدد من الجزر في أنبوب بالتساوي، فإنه من المستحسن أن تفعل ذلك، وتصل إلى 25-50 الجزر في أنبوب.
  5. مع قبعات microfuge أنبوب مفتوحة، ونقل إلى حاضنة 37 درجة مئوية وضعت في 5٪ CO 2 واحتضان لمدة 45 دقيقة لتطبيع إفراز الأنسولين من جميع الجزر إلى مستوى خط الأساس.
  6. في حين أن العينات واحتضان، وإعداد العلاجات (أي 8 ملم، 11.1 ملم، 16.7 ملم الجلوكوز، وغيرها) في كريبس الاب بالغازام الخطوة 9.2. في 15 مل أنابيب مخروطية، مع 1 مل اضافية لحساب أي خطأ pipetting ل. إضافة 3-الاستيوفينون-1-الميثيل (IBMX) إلى تركيز النهائي من 200 ميكرومتر. IBMX هو المانع فسفودايستراز العام الذي يمنع تدهور المخيم، والسماح المخيم لتتراكم في الخلايا كما يتم إنتاجه. (ملاحظة: هذا هو الاختبار الحقيقي الإنتاج المخيم راجع قسم مناقشة لحالات عندما قد لا يكون قياس الإنتاج المخيم مرغوب فيه إذا تم ترك IBMX من الفحص، سوف تكون هناك حاجة أكثر الجزر في أنبوب من أجل الحصول على البيانات في المخيم مجموعة خطية من المنحنى القياسي).
  7. بعد 45 دقيقة قبل الحضانة، وإزالة أنابيب microfuge من الحاضنة، وكأب ونبض دوامة كل عينة (أقل من 0.5 ثانية). هذا هو خلط التدرج الأنسولين الذي من المرجح تولدت بسبب الجزر التي تتركز في الجزء السفلي من الأنبوب. يجب الحرص على عدم دوامة بقسوة، لأن ذلك قد يؤثر سلبا على الاستقرار جزيرة (ملاحظة: توجأنابيب مع الجزر قد انقض بلطف أو مقلوب إذا كان من غير الممكن نبض دوامة بلطف. وسوف تضيف هذه الخيارات الوقت لفحص، والتي ينبغي أخذها في الاعتبار عند التخطيط للتجربة).
  8. نقل كل أنبوب إلى أعلى الجدول الطرد المركزي (RT) وتدور حتى تصل إلى 10،000 دورة في الدقيقة الجزر (7،000-7500 ز) ومن ثم إيقاف فورا.
  9. استخدام ماصة P-1000 لإزالة معظم كريبس في كل microfuge أنبوب، وترك ما يقرب من 10-15 ميكرولتر من كريبس على بيليه جزيرة. استخدام ماصة P-20 لإزالة جزء الأقرب بيليه جزيرة. إذا اختل بيليه، ماصة كريبس مرة أخرى إلى الأنبوب وإعادة الدوران.
    (ملاحظة: إذا وجدت أنه من الصعب جدا مجرب لإزالة جميع كريبس من جزيرة بيليه من دون إزعاج ذلك، قد يكون غادر 10-15 ميكرولتر الماضي على واستأثرت في الحجم الكلي لاحقا في البروتوكول.
  10. الحصول على كمية كافية من النيتروجين السائل في وعاء معزول لالتقاط تجميد العينات بعد الحضانة.
  11. أخذ عينات من الحاضنة، وكأب، الدوامة بسرعة (أقل من 0.5 ثانية) تدور أنابيب microfuge في أعلى الجدول الطرد المركزي (RT) ما يصل إلى 10،000 دورة في الدقيقة (7،000-7500 ز)، ومن ثم ايقافها فورا. إذا الأنسولين أو الأيض آخر هو تطبيق المصب المطلوب، واستخدام ماصة-P 1000 إلى جمع قسامة من متوسطة في أنبوب microfuge وتخزينها في -20 درجة مئوية حتى مزيد من التحليل. إذا لم يتم جمعها وسائل الإعلام التحفيز، قد يتم تجاهل ذلك.
    (ملاحظة: IBMX هو potentiator قوية من إفراز الأنسولين حفز الجلوكوز (التأمين الحكومية) لذلك، النتائج التي تم الحصول عليها من مخيم GSIS التحفيز المتوسطة قد لا تمثل بدقة تأثير الحقيقي لعلاجات محددة بشأن التأمين الحكومية، خاصة إذا كانت هذه الآثار هي خفية).
  12. كرر الخطوة 9.9 لإزالة أكبر قدر متوسطة التحفيز ممكن من دون إزعاج بيليه جزيرة. المفاجئة تجميد بيليه جزيرة في النيتروجين السائل مرة واحدة هناك أقل من 10-15 ميكرولتر من كريبس اليسار على بيليه جزيرة. مرة واحدة كلتم تجميد عينات مبكرة، مخزن في -80 درجة مئوية حتى قياس المخيم.
  13. في يوم من تقرير المخيم، وإعداد الكواشف تحلل الرواية وفقا لبروتوكول الصانعين. إضافة 200 مل تحلل كاشف 1B لكل microfuge أنبوب ودوامة في سرعة قصوى لمدة 30 ثانية. السماح للأنابيب الجلوس على الجليد لمدة 10 دقيقة، vortexing لكل 2 دقيقة لمدة 30 ثانية. (ملاحظة: توصي البروتوكول إجراء تحليل مجهري مع الأزرق التريبان لضمان تحلل الخلية، ولكن هذا لم يتم تنفيذ لالجزر).
  14. إعداد معايير العمل وإعداد صفيحة ميكروسكوبية EIA بالضبط كما هو موضح في بروتوكول الشركة المصنعة. بعد أن تم حضنت الركيزة انزيم مع صفيحة ميكروسكوبية لمدة 30 دقيقة، نفذ الخطوة 1.0 M حمض الكبريتيك اختياري، وتحديد الامتصاصية من آبار صفيحة ميكروسكوبية 450 نانومتر باستخدام قارئ صفيحة ميكروسكوبية.
  15. سيتم تسجيل نتائج دوري امبير كما fmol / جيد. وينبغي تطبيع هذا إلى الحجم الكلي للعينة الأصلية (200 ميكرولتر + أيالمتبقية كريبس اليسار على الجزر من الخطوة 9.9). المقبل، والنتائج يمكن أن تكون إما طبيعية لعدد من الجزر الصغيرة، وإعطاء fmol المخيم أنتجت / جزيرة، أو عينات المحللة يمكن أن يتعرضوا لحمض bicinchoninic (BCA) البروتين مقايسة لتطبيع النتائج إلى البروتين الكلي الخلوية (إعطاء البروتين fmol / ميكروغرام) . ينصح هذا الأخير عندما الأحجام جزيرة غير متناسقة بين العينات، ويمكن أن تكون بديلة لحجم جزيرة. وقد استخدم بيرس BCA عدة البروتين مقايسة مع النجاح في هذا البروتوكول، ويتطلب فقط 25 مل من العينة. وينبغي إعداد معايير BSA في تحلل كاشف 1B من عدة المخيم الفحص.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

لضمان العائد جزيرة عالية خلال العزلة، ينبغي اتباع التقنيات الجراحية المذكورة في البروتوكول عن كثب. على الرغم من أن التقنيات المعروضة هنا سوف يكون متلائما مع كل مختبر، وهناك عدد قليل من الخطوات الحاسمة التي من شأنها أن تؤدي إلى العزلة الناجحة. من أجل جعل القناة الصفراوية المشتركة يمكن الوصول إليها بسهولة، فمن المستحسن أن الأجهزة قد نزحوا إلى الجانب الأيمن من الفأرة (الشكل 1). وعلاوة على ذلك، وهذا سوف يسمح البنكرياس لتضخيم مع كمية صغيرة من المقاومة حيث سيكون هناك أقل وزنا تقييد التوسع. خطوة حاسمة أخرى لتعظيم العائد جزيرة هو ربط من القناة الصفراوية المشتركة بالقرب من المصرة من أودي (أرقام 2A-C). Ligating بعيدا عن مصرة أودي قد يؤدي إلى التضخم الجزئي عن طريق تقليل كمية من محلول كولاجيناز دخول قناة البنكرياس الرئيسية. أيضا، فإن عقدة مشدود منع حل كولاجيناز من دخول الأمعاء.

<ع الطبقة = "jove_content"> شق السليم في القناة الصفراوية المشتركة يجب أن يكون موجودا بعيدا بما فيه الكفاية بعيدا عن التشعب من الكبد ولكنه قريب بما فيه الكفاية للتضخم البنكرياس القصوى (الشكل 3). شق جعلت قريبة جدا من التشعب قد يؤدي إلى تدفق حل كولاجيناز في الكبد. عندما يدخل الحل كولاجيناز الكبد، فإنه سوف يفقد لونه أحمر غامق والبدء في تحويل بيضاء. إذا حدث هذا، إزالة الإبرة ومحاولة القسطرة آخر مزيد من الكبد. بالإضافة إلى ذلك، ينبغي أن القناة الصفراوية المشتركة شق تكون سوى طريقة وجزئيا من خلال القناة (حوالي 50٪). سوف القص تماما القناة تجعل من الصعب اغلاق القناة حول الطرف الإبرة. وهناك شق السليم يؤدي إلى إغلاق كامل للقناة حول إبرة، وتنتج ما يكفي من الضغط على كل من ملء الصفراوية المشتركة والقنوات البنكرياسية (الشكل 4A). من المهم أيضا لضمان الإبرة دخلت القناة الصفراوية المشتركة وليس غمد المحيطة بها.مرة واحدة وقد تم إدخال الإبرة بشكل صحيح، يجب أن 5 مل من محلول كولاجيناز ملء البنكرياس، وخلق نسيج مرخم.

يجب أن يتم تنفيذ عملية الإزالة البنكرياس بدقة لتعزيز الغلة القصوى جزيرة (الشكل 5). ثقب في البنكرياس قد يؤدي إلى الانكماش وفقدان حل كولاجيناز، مما يقلل من العائد جزيرة. وقطع البنكرياس على مقربة من النسيج الضام، وغيرها من الأجهزة منع الانكماش. أيضا، والأنسجة الأخرى الحصاد، مثل النسيج الضام، جنبا إلى جنب مع البنكرياس ليست قضية، كما سيتم إزالته في الخطوات اللاحقة. ستبقى A البنكرياس إزالتها بشكل صحيح تضخم بعد الختان قبل مواصلة عملية الهضم كولاجيناز (الشكل 6).

سوف طبقات متميزة في التدرج Ficoll يؤدي إلى إعداد جزيرة نظيفة وخلق بيئة أسهل لالتقاط الجزر (الشكل 7). التدرج يضمن الفصل بين الجزر منالحطام الخلية والأنسجة الضامة التي تبقى بعد عملية الهضم وشاشة شبكة التصفية. علاوة على ذلك، هذه الخطوة حاسمة لاختيار نظيفة، الجزر صحية للتطبيقات المصب. على وجه التحديد، فإن الجزر صحية تكون كروية الشكل ولها لونها بنيا ذهبيا إلى مركز البني الداكن (الشكل 8). ملاحظة: سوف الفشوت من الفئران من السكري يكون أكثر من ونا في اللون، والمقابلة مع تناقص محتوى الانسولين، ويمكن أن يكون أفضل حاليا من قبل الأنسجة عنيبية شكلها، لمعان، وشبكة من الشعيرات الدموية واضحة لهم. أي الجزر متصلة الأنسجة عنيبية لا ينبغي أن تستخدم، وينبغي التخلص منها. علاوة على ذلك، أن أكبر الجزر تطوير، مركز نخرية الظلام بعد الحضانة بين عشية وضحاها يجب التخلص من حيث أنها لا تعمل بشكل صحيح.

كما هو موضح في مقدمة والإنتاج المخيم هو عنصر هام في وظيفة خلايا β؛ على وجه الخصوص، فيما يتعلق incretin العمل. فائدة واحدة لبروتوكول الموصوفة في هذه التقى هود هو أن واحدة يمكن الحصول على إنتاج نفس الوقت المخيم والبيانات افراز الانسولين حفز الجلوكوز. عادة، وأثر على الإنتاج وكيلا المخيم يرتبط مباشرة مع تأثيرها على إفراز الأنسولين 17. لتجارب بسيطة، ويحمل هذه القاعدة الحقيقية بشكل جيد (انظر الشكل 9 للحصول على مثال). في هذا البروتوكول، ونحن نستخدم IBMX (المانع phosphodiesterase) في العلاجات جهدنا لمنع هدم مخيم، وإعطاء مجموع الإنتاج من المخيم.

الشكل 1
الشكل 1. ازاحة الأعضاء الداخلية. تحديد المواقع الأجهزة الداخلية إلى الجانب الأيمن من الفأرة يخلق بيئة عمل أسهل ويسمح غرفة البنكرياس لتوسيع خلال التضخم.

الرقم 2 "FO: محتوى العرض =" 5IN "FO: SRC =" / files/ftp_upload/50374/50374fig2highres.jpg "سرك =" / files/ftp_upload/50374/50374fig2.jpg "/>
الشكل 2. ربط قبالة مصرة أودي (AC). يصور هنا هو مدخل القناة الصفراوية المشتركة إلى الأمعاء الدقيقة في المصرة من أودي. ربط قبالة القناة الصفراوية المشتركة في المصرة من أودي يمنع حل كولاجيناز من دخول الأمعاء.

الرقم 3
الرقم 3. شق القناة الصفراوية المشتركة. فمن الأفضل لاجراء خفض في القناة الصفراوية المشتركة البعيدة قليلا إلى التشعب في الكبد لمنع تدفق الحل كولاجيناز في الكبد.

0374/50374fig4highres.jpg "سرك =" / files/ftp_upload/50374/50374fig4.jpg "/>
الشكل 4. القسطرة من القناة الصفراوية المشتركة من قبل اضعافها 30 G إبرة والتضخم البنكرياس. أ) يتم إدراج إبرة G 30 إلى القناة الصفراوية المشتركة، وخلق ختم أنحاء طرف الإبرة. من المهم أن نلاحظ تحقق ولقد تم إدراج الإبرة في القناة الصفراوية المشتركة وليس غمد المحيطة بها. وهناك إبرة تدخل بشكل صحيح لها مظهر معتم. B) A التضخم البنكرياس السليم وملء مع حوالي 3-5 مل من محلول كولاجيناز ولها مظهر رخامي.

الرقم 5
الرقم 5. إزالة البنكرياس. أ) شق الأولية التي مع زوج من مقص منحني يحدث بالقرب من المصرة من أودي. عيني الأوليةالبيضاوي يبدأ في الاتجاه من المعدة والحرص على عدم ثقب في البنكرياس. B) والخطوة الأخيرة هي إزالة البنكرياس من النسيج الضام في الأمعاء الدقيقة والاتصالات القليلة الماضية إلى التجويف البريتوني.

الرقم 6
الرقم 6. البنكرياس مبالغ فيها. سوف إزالة البنكرياس ناجحة تسفر عن البنكرياس مع perfused الحل كولاجيناز. سوف الفقراء الختان يترك أصغر والبنكرياس مفرغة.

الرقم 7
الرقم 7. أربع طبقات من التدرج Ficoll. طبقات متميزة الأربعة تمثل مختلفاالكثافة ر Ficoll من 25٪ في أسفل إلى 11٪ في الجزء العلوي. طبقات متميزة لا بد من إزالة الأنقاض وإفرازات الاهمال من الجزر.

الرقم 8
الرقم 8. اختيار جزيرة. الجزر صحي تميل إلى أن تكون لونها بنيا ذهبيا للون البني الداكن مع شكل كروية مستديرة وغير متصلة عنيبية الأنسجة. بعد الحضانة بين عشية وضحاها (16-20 ساعة) يطور مركز نخرية في الجزر الأكبر حجما، والتي ينبغي استبعادها من التجارب.

الرقم 9
الرقم 9. عالية الجودة نتائج الإنتاج المخيم الممثل، مما يدل على أن يفرز insulفي يمكن قياسها من التحفيز المتوسطة المخيم. A) وحفز الجزر المعزولة من النوع البري أو الجينات الفئران خروج المغلوب مع 11.1 ملي الجلوكوز داخل الخلايا وإنتاج المخيم وقد تم قياس وتطبيع إلى البروتين الكلي الخلوية تم قياس. ب) يفرز الأنسولين باستخدام الأنسولين القياسية ELISA، وتطبيع أيضا إلى إجمالي الخلوية البروتين. في كثير من الحالات، فإن التغير في إنتاج أحادي فوسفات الأدينوزين الحلقي يرتبط بشكل مباشر مع زيادة في مستوى السكر في حفز إفراز الأنسولين. ن = 3 لكل مجموعة؛ *، ف <0.05. وقد تم تكييف هذا الرقم من البحوث المنشورة في Kimple وآخرون 10.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

مع انتشار مرض السكري من المتوقع أن تؤثر على 7.7٪ من سكان العالم، واشتراط تقنيات البحث الرواية لا بد من فهم كل من وعلاج مرض السكري 18. عزلة جزيرة الحاضر هو بروتوكول راسخة المستخدمة في المختبر لالتجريب وقدمت من قبل مع تعديلات طفيفة 11،14،16. على الرغم من إفراز الأنسولين هو تطبيق المصب المشتركة لجزر معزولة، مع التركيز على مكونات المنبع، مثل معسكر، قد تساعد على تحديد الآليات التي يحتمل إنتاج الأنسولين وإفراز.

يجب أن يتم اختيار القتل الرحيم بعناية لضمان كل من المعاملة الإنسانية للحيوانات المختبر وكذلك سلامة القياسات التجريبية. لجزيرة العزلة، واستنزاف تحت التخدير هو الأسلوب المفضل لدينا للقتل الرحيم لأنها تسمح جزيرة نضح مع الدم المؤكسج لكمية ممكنة من الوقت قبل البنكرياسالتضخم. CO 2 الاستنشاق هو خيار الفقراء للقتل الرحيم، كما لو يتم تنفيذ ذلك وفقا لبروتوكولات إنسانية، وإنما يعرض الجزر إلى الدم المؤكسج سيئة لمدة 5-6 دقائق على الأقل قبل أن تبدأ في الإجراء. خلع عنق الرحم بدون تخدير يمكن أن تكون وسيلة مقبولة مع التبرير العلمي، ولكن هذا يتطلب خبرة كبيرة مع كل طريقة القتل الرحيم وتشريح الفأر والإجراءات التضخم البنكرياس من أجل ضمان الموت إنسانية والحفاظ على وظيفة جزيرة. في اختيار استنزاف تحت التخدير، آفيرتين هو مخدر المفضل في هذا البروتوكول. خيار معين من آفيرتين هو أنه هو سريع المفعول والتخدير العميق مع العديد من المزايا أكثر من غيرها من مواد التخدير المستخدمة عادة. الأولى، آفيرتين لا تمدد الأوعية الدموية وتحفز إطلاق أكسيد النيتريك، كما يفعل isoflurane و19. وأوعية دموية للغاية الجزر البنكرياس، وبالتالي الأحياء الخاصة بهم قد تتأثر سلبا exposur isoflurane وه. الثانية، آفيرتين لا يرفع مستويات السكر في الدم بشكل مفرط في غياب حقن الجلوكوز، كما يمكن الكيتامين / زيلازين، وهو ما ثبت لرفع مستوى السكر في الدم بواسطة 167٪ لتصل إلى ساعة بعد الحقن 20. أخيرا، ومجموعة علاجية للبنتوباربيتال ضيقة جدا في الفئران 21، مما يزيد من فرصة حدوث ضرر ميتة إلى الجزر.

في هذا البروتوكول، ويستخدم استخدام خيوط الجروح لligate القناة الصفراوية المشتركة قرب مصرة أودي كبديل للمرقئ. يسمح الأسلوب للموضوع قدرة أكبر على المناورة من القناة الصفراوية المشتركة ويساعد على موقف إبرة لالقسطرة. ومع ذلك، فإن استخدام موضوع خلال هذه الخطوة يتطلب عقد كائنين (موضوع وحقنة) في حين أن مرقئ يسمح يدها للمساعدة في وضع القناة الصفراوية. كلا تقنيات عزل تسفر عن عدد مماثل من الجزر وقابلة للحياة كما هو موضح مع الأعمال السابقة في مختبرنا وغيرها 10،22. علاوة على ذلك، القسطرة نيسوف حجم DLE، والموقف، وزاوية تعتمد على تفضيل المستخدم. على وجه التحديد، يتم استخدام 30 G إبرة في هذا البروتوكول ولكن قد تكون هناك حاجة الأحجام الأخرى على أساس السلالة أو الخلفية الوراثية. على سبيل المثال، الفئران BTBR ديك تفتيت جدا القناة الصفراوية المشتركة ويمكن أن توفر مقياس أكبر ختم أكبر حول الطرف إبرة (مجاهدي خلق، والملاحظات الشخصية). وبالتالي، فمن المستحسن أن اضعافها الإبر قنية من مختلف الأحجام على يد أثناء الجراحة، وعلى استعداد للتبديل خارج إذا لزم الأمر. والموقف من الإبرة في القناة الصفراوية المشتركة أيضا تؤثر بشكل كبير على العائد جزيرة. إذا وضعت الإبرة أمام التشعب من القناة الصفراوية المشتركة، والحل كولاجيناز دخول الكبد ويؤدي إلى التضخم الفقراء. ومع ذلك، إذا تم وضع إبرة قريبة جدا من المصرة من أودي، سيحدث تضخم البنكرياس الجزئي، وخفض عدد من الجزر المعزولة. سوف التضخم البنكرياس المحاكمة مع مختلف أحجام إبرة ومواقع على القناة الصفراوية المشتركة يكون ل requiأحمر لتخصيص الإجراء الحالي وتعظيم العائد جزيرة.

آخر عنصرا هاما من هذا الإجراء لزيادة عدد من الجزر قابلة للحياة هو إعداد كل الكواشف وفقا للتعليمات البروتوكولات. يمكن لعامل في البقاء على قيد الحياة في جميع أنحاء جزيرة بروتوكول بالغاز المخازن المؤقتة مع 95٪ O 2/5٪ CO 2 لزيادة الأوكسجين. يوضح الأعمال السابقة أن يقلل تركيز الأكسجين نحو المناطق الداخلية من جزيرة، مما يحتمل أن يقلل محتوى الطاقة من خلايا β 23. قد يكون هذا واضحا بعد الحضانة بين عشية وضحاها باعتبارها، مركز نخرية الظلام سوف تظهر في الجزر مثقف، ربط مع انخفاض في القدرة على الاستجابة في المختبر. وبالتالي، فإن توفير ما يكفي من الأوكسجين تساعد على زيادة عدد وجدوى جزيرة خلال العزلة وبين عشية وضحاها في عملية الحضانة normoxic. وعلاوة على ذلك، فإن الإعداد المناسب من الحل كولاجيناز تعزيز هضم أنسجة البنكرياس وتحرير رانه الجزر من الأنسجة المحيطة بها. إذا كان تركيز كولاجيناز منخفضة جدا، وليس فقط سوف يكون العائد جزيرة منخفضة، ولكن قد تبقى الأنسجة الإفرازية عنيبية تعلق على الجزر، والتي تؤثر سلبا على التطبيقات المصب. من ناحية أخرى، عالية جدا من التركيز كولاجيناز قد تدمر الجزر. وبالتالي، فإن تدابير مراقبة الجودة المناسبة لضمان كفاءة الهضم كولاجيناز دون تدمير الجزر تعزيز عوائد أكبر.

كولاجيناز معزولة عن كلوستريديوم نسج هو انزيم المستخدمة لتحرير الجزر من أنسجة البنكرياس في هذا البروتوكول. وirreproducibility النشاط الأنزيمي بين الكثير مختلفة من كولاجيناز لديه القدرة على عرقلة كمية و / أو نوعية من الجزر المعزولة. في هذا البروتوكول، على كل كبيرة وجديدة من الانزيم كولاجيناز يذهب من خلال الاختيار مراقبة الجودة الداخلية لتحديد كل من كمية وظيفة من الجزر قبل أن تخضع للدراسة. وبالتالي، downstrتحتاج تطبيقات زير الشئون الخارجية والتباين الكثير لأخذها في الاعتبار عند اختيار انزيم لجزيرة العزلة. Liberase ® (روش)، وهو مزيج كولاجيناز النقى هو آخر الانزيم الهضمي البديلة التي نجحت في كثير من الحالات؛ على وجه الخصوص، في الحصول على كميات أعلى من الجزر المعزولة 24،25. ومع ذلك، فإن استخدام Liberase قد لا يكون مفيدا لعزل الجزر وظيفية، لأنها قد تعيق وظيفة في المختبر 26.

وجود العديد من القيود في الإجراءات العزلة جزيرة وتقرير المخيم الحالية التي قد تعوق تطبيقات المصب. كما ذكر سابقا، والفئران BTBR ديك هشة للغاية القناة الصفراوية المشتركة، مما يزيد من صعوبة التضخم البنكرياس واللاحقة العزلة جزيرة. لذلك، قد تكون هناك حاجة تجميع الاستعدادات جزيرة من عدة الفئران، والعديد من فحوصات المختبر في، بما في ذلك فحص المخيم وصفها، تتطلب العديد من الجزر في تكرار. بالإضافة إلى ذلك، وذلك باستخدام IBMX في كتلة المخيم مقايسةالنشاط ق فسفودايستراز، وإعطاء مهلة قراءة الإنتاج المخيم. إضافة IBMX قد لا يكون من المستحسن في الحالات التي يكون فيها الدراجات الإنتاج المخيم وتدهور المهم للإشارات الخلوية. ومع ذلك، وإزالة IBMX من هذا البروتوكول تقلل بشكل كبير من المحتوى المخيم النهائية من الجزر، مما يستلزم إضافة العديد من الجزر في تكرار من أجل الحصول على القيم المخيم ذات مغزى في تقييم الأثر البيئي.

هذا البروتوكول هو أداة أساسية لمختبر البيولوجيا جزيرة أو المهتمين في البنكرياس والغدد الصماء. المكون المخيم لهذا البروتوكول هو مجرد واحدة من العديد من التجارب في المختبر لفهم كيفية التلاعب جزيرة من خلال العلاجات المختلفة يمكن أن تعزز أو إفراز الأنسولين حادة. على الرغم من أن معظم الأبحاث التي تستخدم الجزر يركز في المقام الأول على افراز الانسولين الخلايا β-، أنواع الخلايا الأخرى يمكن تقييم للعلاقات الديناميكية الخاصة بهم داخل جزيرة 4. بالاشتراك مع آخرين في المختبر، وأنان النماذج الحية، وجزيرة التجريب تسليط الضوء على الآليات الكامنة وراء الأمراض المدمرة البنكرياس ذات الصلة مثل مرض السكري وinsulinomas. الأهم من ذلك، فهم كيف وكلاء الأدوية تؤثر مباشرة الجزر من شأنها تعزيز فعالية العلاج والمساعدة في الترجمة إلى نموذج في الجسم الحي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

نود أن نشكر رينيه L. Pasker وHarpreet K. برار للحصول على المساعدة التقنية للخبراء بشأن البروتوكولات وصفها في هذا العمل. وعلاوة على ذلك، نود أن نعترف التوجيه كريستوفر B. Newgard في جامعة ديوك وألان D. Attie في جامعة ويسكونسن ماديسون، جنبا إلى جنب مع دعم أعضاء المختبر، والتي سمح لنا الوقت والدعم اللازم لتحسين البروتوكولات وصفها. على وجه الخصوص، ونحن نشكر هانز Hohmeier، Danhong لو، وهيلينا وينفيلد في مختبر Newgard ومريم Rabaglia في مختبر Attie لمناقشات مثمرة والمشورة. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح DK080845 وسكري الأطفال 594
منحة مؤسسة البحوث 17-2011-608 (لمجاهدي خلق)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Collagenase from Clostridium histolyticum suitable for isolating active islets Sigma-Aldrich C7657
Ficoll 400 Sigma-Aldrich F9378
Hanks Balanced Salt Solution 10X Invitrogen (Gibco) 14065-056
HEPES Sigma-Aldrich H3375
RPMI 1640 (powder) Invitrogen (Gibco) 31800-022
Albumin from Bovine Serum (BSA) Sigma-Aldrich A7888
3/0 Silk Suture Thread Fine Science Tools 18020-30
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11251-10
0.8 mm Forceps   Fine Science Tools 11050-10
Curved Scissors Fine Science Tools 14061-10
Vannas-Tübingen Spring Scissors - Straight/Sharp/8.5 cm/5 mm Cutting Edge Fine Science Tools 15003-08
Dissecting Scissors Fine Science Tools 14002-14
5 ml BD Luer-Lok Syringe BD 309646
1 ml BD syringe BD 309628
30 G BD Needle 1/2" Length BD 305106
27 G BD Needle 1/2" Length BD 305109
Sharpening Stone Fine Science Tools 29008-01
2-2-2-tribromoethanol Sigma-Aldrich T48402-25G
2-methyl-2-butanol Sigma-Aldrich 240486-100mL
Sodium Chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S9888
Potassium Chloride Sigma-Aldrich P3911
Monopotassium Phosphate (KH2PO4) Sigma-Aldrich P0662
Sodium Bicarbonate (NaCHO3) Sigma-Aldrich S6014
CaCl2·2H2O Sigma-Aldrich C3881
MgSO4·7H2O Sigma-Aldrich M9397
Penicillin-Streptomycin Invitrogen (Gibco) 15140-122
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum (H.I. FBS) Fisher Scientific SH30088.03HI
3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) Sigma-Aldrich 5879-100MG

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cryer, P. E. Hypoglycaemia: the limiting factor in the glycaemic management of Type I and Type II diabetes. Diabetologia. 45, 937-948 (2002).
  2. Alberti, K. G., Zimmet, P. Z. Definition, diagnosis and classification of diabetes mellitus and its complications. Part 1: diagnosis and classification of diabetes mellitus provisional report of a WHO consultation. Diabet Med. 15, 539-553 (1998).
  3. Muoio, D. M., Newgard, C. B. Mechanisms of disease: molecular and metabolic mechanisms of insulin resistance and beta-cell failure in type 2 diabetes. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 193-205 (2008).
  4. Kelly, C., McClenaghan, N. H., Flatt, P. R. Role of islet structure and cellular interactions in the control of insulin secretion. Islets. 3, 41-47 (2011).
  5. Meda, P., Halban, P., Perrelet, A., Renold, A. E., Orci, L. Gap junction development is correlated with insulin content in the pancreatic B cell. Science. 209, 1026-1028 (1980).
  6. Hohmeier, H. E., et al. Isolation of INS-1-derived cell lines with robust ATP-sensitive K+ channel-dependent and -independent glucose-stimulated insulin secretion. Diabetes. 49, 424-430 (2000).
  7. Hohmeier, H. E., Newgard, C. B. Cell lines derived from pancreatic islets. Mol Cell Endocrinol. 228, 121-128 (2004).
  8. Field, J. B. Extraction of insulin by liver. Annu Rev Med. 24, 309-314 (1973).
  9. Emmanouel, D. S., et al. Glucagon metabolism in the rat. J Clin Invest. 62, 6-13 (1978).
  10. Kimple, M. E., et al. Deletion of GalphaZ protein protects against diet-induced glucose intolerance via expansion of beta-cell mass. J Biol Chem. 287, 20344-20355 (2012).
  11. Rabaglia, M. E., et al. Alpha-Ketoisocaproate-induced hypersecretion of insulin by islets from diabetes-susceptible mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 289, 218-224 (2005).
  12. Collins, S. C., Salehi, A., Eliasson, L., Olofsson, C. S., Rorsman, P. Long-term exposure of mouse pancreatic islets to oleate or palmitate results in reduced glucose induced somatostatin and oversecretion of glucagon. Diabetologia. 51, 1689-1693 (2008).
  13. Fueger, P. T., Hernandez, A. M., Chen, Y. C., Colvin, E. S. Assessing Replication and Beta Cell Function in Adenovirally-transduced Isolated Rodent Islets. J Vis Exp. , (2012).
  14. Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Murine pancreatic islet isolation. J Vis Exp. , (2007).
  15. Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Transplantation of pancreatic islets into the kidney capsule of diabetic mice. J Vis Exp. , (2007).
  16. Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation. J Vis Exp. , (2011).
  17. Kimple, M. E., et al. A role for G(z) in pancreatic islet beta-cell biology. J Biol Chem. 280, 31708-31713 (2005).
  18. Shaw, J. E., Sicree, R. A., Zimmet, P. Z. Global estimates of the prevalence of diabetes for 2010 and 2030. Diabetes Res Clin Pract. 87, 4-14 (2010).
  19. Kirstetter, P., Lagneau, F., Lucas, O., Krupa, Y., Marty, J. Role of endothelium in the modulation of isoflurane-induced vasodilatation in rat thoracic aorta. Br J Anaesth. 79, 84-87 (1997).
  20. Brown, E. T., Umino, Y., Loi, T., Solessio, E., Barlow, R. Anesthesia can cause sustained hyperglycemia in C57/BL6J mice. Vis Neurosci. 22, 615-618 (2005).
  21. Vaupel, D. B., McCoun, D., Cone, E. J. Phencyclidine analogs and precursors: rotarod and lethal dose studies in the mouse. J Pharmacol Exp Ther. 230, 20-27 (1984).
  22. Davis, D. B., et al. FoxM1 is up-regulated by obesity and stimulates beta-cell proliferation. Mol Endocrinol. 24, 1822-1834 (2010).
  23. Dionne, K. E., Colton, C. K., Yarmush, M. L. Effect of hypoxia on insulin secretion by isolated rat and canine islets of Langerhans. Diabetes. 42, 12-21 (1993).
  24. Linetsky, E., et al. Improved human islet isolation using a new enzyme blend, liberase. Diabetes. 46, 1120-1123 (1997).
  25. Vaithilingam, V., Sundaram, G., Tuch, B. E. Islet cell transplantation. Curr Opin Organ Transplant. 13, 633-638 (2008).
  26. Brandhorst, H., et al. Large-scale comparison of Liberase HI and collagenase NB1 utilized for human islet isolation. Cell Transplant. 19, 3-8 (2010).

Tags

علم وظائف الأعضاء، العدد 88، جزيرة، والعزلة، إفراز الانسولين، خلايا β، ومرض السكري، والإنتاج المخيم، والماوس
وهناك طريقة للماوس البنكرياس جزيرة العزلة وبين الخلايا المخيم تقدير
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Neuman, J. C., Truchan, N. A.,… More

Neuman, J. C., Truchan, N. A., Joseph, J. W., Kimple, M. E. A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination. J. Vis. Exp. (88), e50374, doi:10.3791/50374 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter